阅读说明：本技术 苯并异硒唑衍生物与铂类药物联合用于制备***药物与术后肿瘤复发药物中的应用 (Application of benzisoselenazole derivative and platinum medicine in preparation of medicine for treating tumor and postoperative tumor recurrence ) 是由 曾慧慧 尹汉维 于 2018-08-06 设计创作，主要内容包括：本发明属于肿瘤治疗技术领域,公开了苯并异硒唑衍生物与铂类药物联合用于制备治疗肿瘤药物与术后肿瘤复发药物中的应用。所述苯并异硒唑衍生物具有如式A所示的结构,所述铂类抗癌药物选自顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂等中的至少一种,所述苯并异硒唑衍生物与铂类抗癌药物的摩尔比为(1～99):(1～99)。二者联用,可有效降低毒性高的铂类抗癌药物给药剂量,提升抗癌用药的安全性；可以通过降低Bcl-2/Bax蛋白表达比例来诱导Bel-7402细胞凋亡,可以协同抑制肿瘤组织内TrxR的表达,明显降低术后肿瘤细胞的增殖率,提升对术后肿瘤细胞的生长抑制率。<Image he="265" wi="700" file="DDA0001756036260000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention belongs to the technical field of tumor treatment, and discloses an application of a benzisoselenazole derivative and a platinum drug in preparation of a drug for treating tumor and a drug for postoperative tumor recurrence. The benzisoselenazole derivative has a structure shown as a formula A, the platinum anticancer drugs are at least one of cisplatin, carboplatin, oxaliplatin, nedaplatin and the like, and the molar ratio of the benzisoselenazole derivative to the platinum anticancer drugs is (1-99) to (1-99). The two are used together, so that the administration dosage of the platinum anti-cancer drugs with high toxicity can be effectively reduced, and the safety of the anti-cancer drugs is improved; bel-7402 cell can be induced by reducing Bcl-2/Bax protein expression ratioApoptosis can synergistically inhibit the expression of TrxR in tumor tissues, obviously reduce the proliferation rate of postoperative tumor cells and improve the growth inhibition rate of the postoperative tumor cells.)

苯并异硒唑衍生物与铂类药物联合用于制备***药物与 术后肿瘤复发药物中的应用

技术领域

本发明属于肿瘤治疗技术领域，具体涉及一种苯并异硒唑衍生物与铂类药物联合用于制备***药物与术后肿瘤复发药物中的应用。

背景技术

肿瘤，尤其是恶性肿瘤，是全球性人类健康杀手，是导致疾病高死亡率的主要原因之一。针对肿瘤的临床治疗方式主要包括手术、放射疗法和化学疗法。然而，即使经过以上治疗，肿瘤的快速增殖和复发的概率依旧高居不下，使抗癌治疗成为世界范围最具有挑战性的难题之一。

癌症治疗的不彻底所造成癌细胞在体内的残存，是导致癌细胞复发的主要原因。癌症主要的治疗手段为手术、放疗、化疗，手术作为一种机械手段，局部治疗彻底，但癌症细胞的转移性决定了癌症发病后，就会有癌症细胞脱落，并通过局部扩散、血管、***等途径向四周及远处增殖或转移。据我国疾病预控中心癌情监测数据显示，我国癌症患者术后3个月复发转移率为50％，6个月复发转移率高达69％，手术五年后复发或转移率高达90％以上。

整体来讲，复发的癌症比初始的癌症治疗要更为困难，主要原因为：1、初始手术或放疗等局部治疗已经尽可能将癌细胞清除，但仍然可能残留一些极小的癌细胞群体，很早就迁徙出了手术和放疗的范围。这些癌细胞群体往往是侵袭性非常强的(快速生长和快速扩散)，即复发的肿瘤是恶性程度是非常高的亚群组成的，对恶性程度进一步增高的肿瘤，治疗的困难性就会大大增加。2、癌症对初始的放化疗治疗产生了抵抗力，并且初始治疗的副作用也会导致复发肿瘤再次治疗的困难。

铂类抗癌药物作为一种多种癌症的一线抗癌药物，适用于卵巢癌、肺癌、肝癌等，其能够通过多种机制发挥广谱的抗癌作用。然而，当铂类抗癌药物单独作为抗癌药物或术后复发药物临床使用时，由于其较大的毒性使其使用中要有较大的间隙时间用于消除毒性，影响了抗癌效果和对于术后患者抑制癌症复发效果较差。

因此，不同靶点并且低毒性药物联合铂类药物是有效治疗的重要出路，寻找可以协调铂类药物发挥更好的抗肿瘤作用，和抑制肿瘤生长的作用，并且同时可以表现低毒性，从根结上抑制或消除癌细胞的生长，有效抑制初始肿瘤和术后复发肿瘤的药物成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明提供苯并异硒唑衍生物与铂类抗癌药物联合用于制备***药物中的应用。

根据本发明，所述苯并异硒唑衍生物具有如式A所示化合物的结构，其选自式A所示化合物、其前体、活性代谢产物、立体异构体、药学上可接受的盐、前药和溶剂合物中的至少一种，

其中，R₁、R₂相同或不同，彼此独立的选自H、或下列基团：C_1-12烷基、C_3-20环烷基；优选地，选自H、或下列基团：C_1-6烷基、C_3-10环烷基；示例性地，R₁、R₂选自H。

其中，R选自C_1-12亚烷基、亚苯基、亚联苯基、亚三苯基，或者

其中M代表Pt、Pd或Rh；优选地，R代表C_1-6亚烷基，如C_1-4亚烷基，例如R为亚丁基。

优选地，所述式A所示化合物中，R₁、R₂相同或不同，彼此独立的选自H、-CH₃、-CH₂CH₃、-CH(CH₃)₂、-C(CH₃)₃、-CH(CH₂)₄、或-CH(CH₂)₅；R选自-CH₂-、-C₂H₄-、-C₄H₈-、亚苯基-C₆H₄-。

根据本发明示例性的技术方案，所述苯并异硒唑衍生物选自1,2-二[2-(1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]-丁烷，其结构如下所示：

根据本发明，所述铂类抗癌药物选自顺铂(CDDP)、卡铂(CBP)、奥沙利铂(1-OHP)、奈达铂(CDGP)等中的至少一种；示例性地，所述铂类抗癌药物选自顺铂(CDDP)。

根据本发明，所述苯并异硒唑衍生物与铂类抗癌药物的摩尔比为(1～99):(1～99)；例如摩尔比为(50～90):(1～30)，(60～70):(1～10)，(1～40):(1～40)，(1～25):(1～25)，(1～10):(1～10)，(1～6):(1～6)；示例性地，摩尔比为1:1、2:1、60:1、70:1、80:1。

根据本发明，所述肿瘤包括实体瘤和非实体瘤，可以是良性的和恶性的。例如，所述肿瘤包括但不限于：肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、胃癌、皮肤癌、膀胱癌、卵巢癌、***癌、骨癌、脑癌、直肠癌、食管癌、舌癌、淋巴癌、口腔上皮癌、上皮***或慢性髓系白血病。优选地，所述肿瘤为耐药的肿瘤，所述耐药是指对作用于***和增殖状态的肿瘤细胞的抗肿瘤药物耐药。示例性地，所述肿瘤选自肝癌、卵巢癌、肺癌、直肠癌或上皮***。

进一步的，本发明提供苯并异硒唑衍生物与铂类抗癌药物联合用于抑制肿瘤细胞增殖中的应用。例如，苯并异硒唑衍生物与铂类抗癌药物联合用于抑制肿瘤细胞体外或体内增殖中的应用；优选地，用于抑制肿瘤细胞体外增殖中的应用。

例如，所述肿瘤细胞包括但不限于：人肝癌细胞HepG2、人肝癌细胞Bel-7402、人肝癌细胞Huh7721、人结直肠癌细胞LoVo、人结直肠癌细胞RKO、人结直肠癌细胞SW480、人肺癌细胞A549、人肺癌细胞H1299、人肺癌细胞SPCA-1、人上皮***细胞HeLa、人乳腺癌细胞MCF-7、人慢性髓性白血病细胞k562、人食管癌细胞KYSE150、人食管癌细胞KYSE450或人食管癌细胞KYSE510。根据本发明示例性的技术方案，所述肿瘤细胞选用人肝癌细胞Bel-7402、人结直肠癌细胞LoVo、人上皮***细胞HeLa、人肺癌细胞A549。

根据本发明示例性的技术方案，所述苯并异硒唑衍生物与铂类抗癌药物联合用于抑制人肝癌细胞Bel-7402的增殖。例如，用于抑制人肝癌细胞Bel-7402的体外增殖。优选地，用于诱导Bel-7402细胞凋亡，例如通过降低Bcl-2/Bax蛋白表达比例来诱导Bel-7402细胞凋亡。再如，联合用药还用于抑制Bel-7402细胞内TrxR(硫氧还蛋白氧化还原酶)活性。

进一步的，本发明提供苯并异硒唑衍生物与铂类抗癌药物联合抑制肿瘤细胞增殖(包括体外增殖和体内增殖)的方法，将苯并异硒唑衍生物与铂类抗癌药物按一定配比作用于肿瘤细胞。

优选地，所述一定配比为：苯并异硒唑衍生物与铂类抗癌药物的摩尔比为(1～99):(1～99)；例如摩尔比为(50～90):(1～30)，(60～70):(1～10)，(1～40):(1～40)，(1～25):(1～25)，(1～10):(1～10)，(1～6):(1～6)；示例性地，摩尔比为1:1、2:1、60:1、70:1、80:1。具体地，当苯并异硒唑衍生物与铂类抗癌药物摩尔比相差不大时，例如摩尔比(1～10):(1～10)，(1～6):(1～6)，示例性地，摩尔比为1:1、2:1时，二者联合优选可以作用于抑制肿瘤细胞体外增殖。当苯并异硒唑衍生物用于体内时，由于药物体内代谢达到肿瘤部位浓度和体内性质有很大的关系，口服苯并异硒唑衍生物用量需要远大于铂类抗癌药物(常规注射给药)用量，例如苯并异硒唑衍生物与铂类抗癌药物摩尔比为(50～90):(1～30)，(60～70):(1～10)，示例性地，摩尔比为60:1、70:1、80:1时，二者联合优选可以作用于抑制肿瘤细胞体内增殖。

优选地，所述苯并异硒唑衍生物与铂类抗癌药物的浓度均为1～100μM，例如5～60μM、10～50μM；示例性地，浓度为15、20、30、40μM。

优选地，所述作用的时间为10～120h，例如15～105h，24～96h；示例性地，作用时间为24h、48h、72h。

优选地，所述作用的方式选用孵育方式。

进一步的，本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包括苯并异硒唑衍生物与铂类抗癌药物。优选地，所述苯并异硒唑衍生物与铂类抗癌药物具有如上文所述的含义和配比。

优选地，所述药物组合物还可任选地包含至少一种药学上可接受的辅料。

优选地，所述药学上可接受的辅料是制药领域中常用或已知的各种辅料，包括但不限于：稀释剂、粘合剂、抗氧化剂、pH调节剂、防腐剂、润滑剂、崩解剂等。

例如，所述稀释剂选自乳糖、淀粉、纤维素衍生物、无机钙盐、山梨醇等。所述粘合剂例如：淀粉、明胶、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮等。例如，所述抗氧化剂选自维生素E、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、丁羟基茴香醚等。例如，所述pH调节剂选自盐酸、氢氧化钠、柠檬酸、酒石酸、Tris、乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等。例如，所述防腐剂选自对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、间甲酚、苯扎氯铵等。例如，所述润滑剂选自硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉等。例如，所述崩解剂选自淀粉、甲基纤维素、黄原胶、交联羧甲基纤维素钠等。

所述药物组合物的剂型可以是口服剂的形式，例如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒剂、悬浮剂、糖浆剂等；也可以是注射给药的剂型，例如注射液、粉针剂等，通过静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内的途径。所有使用的剂型形式都是药学领域普通技术人员所熟知的。

进一步的，本发明还提供上述药物组合物***的方法，将治疗有效量的所述药物组合物施用于有此需求的个体。

优选地，所述个体可以为哺乳动物，如人类。

优选地，所述肿瘤具有如上文所述的含义，优选为肝癌。

进一步的，本发明还提供苯并异硒唑衍生物与铂类抗癌药物联合用于制备抑制肿瘤术后复发药物中的应用。

优选地，所述苯并异硒唑衍生物与铂类抗癌药物的摩尔比为(1～99):(1～99)；例如摩尔比为(50～90):(1～30)，(60～70):(1～10)，(1～40):(1～40)，(1～25):(1～25)，(1～10):(1～10)，(1～6):(1～6)；示例性地，摩尔比为1:1、2:1、60:1。

优选地，以施用对象(例如小鼠)重量计，所述苯并异硒唑衍生物的给药量为10～600mg/kg；例如50～500mg/kg，100～400mg/kg；示例性地，给药量为180mg/kg。

优选地，以施用对象(例如小鼠)重量计，所述铂类抗癌药物的给药量为0.05～5mg/kg；例如0.1～4mg/kg、0.5～3mg/kg；示例性地，给药量为2mg/kg。

优选地，所述肿瘤具有如上文所述的含义，优选为肺癌，例如小鼠Lewis肺癌。

优选地，所述苯并异硒唑衍生物与铂类抗癌药物联合用于提升血常规中白细胞、红细胞和血小板)的数量。

优选地，所述苯并异硒唑衍生物与铂类抗癌药物联合用于协同抑制肿瘤组织内TrxR的表达。

进一步的，本发明还提供一种抑制肿瘤术后复发的药物组合物，所述组合物包括苯并异硒唑衍生物与铂类抗癌药物。优选地，所述苯并异硒唑衍生物与铂类抗癌药物具有如上文所述的含义和配比。

优选地，所述药物组合物还可任选地包含至少一种药学上可接受的辅料。优选地，所述辅料具有如上文所述的含义。

进一步的，本发明还提供上述药物组合物联合抑制术后肿瘤复发的方法，将治疗有效量的所述药物组合物施用于有此需求的个体。

优选地，所述个体可以为哺乳动物，如人类、小鼠。

优选地，所述肿瘤具有如上文所述的含义，优选为肺癌，例如小鼠Lewis肺癌。

本发明的有益效果是：

本发明出人意料地发现，BS与CDDP联合应用对抑制多种肿瘤细胞增殖具有优异的效果，对于多种肿瘤的治疗具有重大应用价值。具体的，二者联用，可有效降低毒性高的CDDP给药剂量，提升抗癌用药的安全性；可以通过降低Bcl-2/Bax蛋白表达比例来诱导Bel-7402细胞凋亡，明显抑制肿瘤细胞的增殖率。

本发明还出人意料地发现，BS与CDDP联合应用对抑制肿瘤术后复发具有优异的效果。具体表现为：二者联用，可以协同抑制肿瘤组织内TrxR的表达，明显降低术后肿瘤细胞的增殖率，提升对术后肿瘤细胞的生长抑制率。进一步的，BS与CDDP联用，还可以缓解CDDP的毒性，提高免疫力。

BS和铂类抗癌药物联合作为***和术后复发药物的机制：

铂类抗癌药物，尤其是顺铂，作为临床一线的抗肿瘤化疗药物，具有明确的抗肿瘤效果，但是相对应地其细胞毒性明显，理论上顺铂不适合用于术后肿瘤患者，但通常为了能够对复发肿瘤立即杀死，以控制肿瘤复发生长，临床还是选择铂类药物用于术后复发用药。BS作为硫氧还蛋白还原酶抑制类药物，具有抑制肿瘤细胞增生而复发生长的特点。本发明出人意料地发现，当BS与顺铂联合时，可以发挥二者不同作用机制叠加产生的协同抗肿瘤效果，降低顺铂用药量和机体对顺铂产生的依赖，从而降低术后患者毒副作用的承受量，进而帮助患者恢复。

术语定义和说明

除非另有说明，本申请说明书和权利要求书中记载的基团和术语定义，包括其作为实例的定义、示例性的定义、优选的定义、表格中记载的定义、实施例中具体化合物的定义等，可以彼此之间任意组合和结合。这样的组合和结合后的基团定义及化合物结构，应当属于本申请说明书记载的范围内。

术语“C_1-12烷基”应理解为优选表示具有1～12个碳原子的直链或支链饱和一价烃基，优选为C_1-6烷基。“C_1-6烷基”应理解为优选表示具有1、2、3、4、5、6个碳原子的直链或支链饱和一价烃基。所述烷基是例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基或1,2-二甲基丁基等或它们的异构体。特别地，所述基团具有1、2、3、4、5、6个碳原子(“C_1-6烷基”)，例如甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基，更特别地，所述基团具有1、2、3或4个碳原子(“C_1-4烷基”)，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基或丁基。

术语“C_3-20环烷基”应理解为表示饱和的一价单环或双环烃环，其具有3～20个碳原子，优选“C_3-10环烷基”。术语“C_3-10环烷基”应理解为表示饱和的一价单环或双环烃环，其具有3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子。所述C_3-10环烷基可以是单环烃基，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基或环癸基，或者是双环烃基如十氢化萘环。

术语“C_1-12亚烷基”应理解为优选表示丢失两个氢原子的具有1～12个碳原子的直链或支链饱和一价烃基，优选为C_1-4亚烷基。“C_1-4亚烷基”应理解为优选表示丢失两个氢原子的具有1、2、3、4个碳原子的直链或支链饱和一价烃基。所述亚烷基是例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基。

术语“有效量”或者“治疗有效量”是指足以实现预期应用(包括但不限于如下定义的疾病治疗)的本发明所述化合物的量。治疗有效量可以取决于以下因素而改变：预期应用(体外或者体内)，或者所治疗的受试者和疾病病症如受试者的重量和年龄、疾病病症的严重性和给药方式等，其可以由本领域普通技术人员容易地确定。具体剂量将取决于以下因素而改变：所选择的特定化合物、所依据的给药方案、是否与其它化合物组合给药、给药的时间安排、所给药的组织和所承载的物理递送系统。

附图说明

图1是BS、CDDP及二者联合作用24h的生长抑制率曲线；

A：BEL-7402细胞；B：LoVo细胞；C：HeLa细胞；D：A549细胞。数据表示为平均值±标准差，n≥3。

图2是BS、CDDP及二者联合作用48h的生长抑制率曲线；

A：BEL-7402细胞；B：LoVo细胞；C：HeLa细胞；D：A549细胞。数据表示为平均值±标准差，n≥3。

图3是BS、CDDP及二者联合作用72h的生长抑制率曲线；

A：BEL-7402细胞；B：LoVo细胞；C：HeLa细胞；D：A549细胞。数据表示为平均值±标准差，n≥3。

图4是实施例1和实施例2BS和CDDP联合给药，作用于BEL-7402、LoVo和HeLa细胞的DRI值分析图；

a：实施例1作用BEL-7402细胞48h的DRI值分析图；

b：实施例2作用BEL-7402细胞48h的DRI值分析图；

c：实施例1作用BEL-7402细胞72h的DRI值分析图；

d：实施例2作用BEL-7402细胞72h的DRI值分析图；

e:实施例1作用HeLa细胞48h的DRI值分析图；

f：实施例2作用HeLa细胞48h的DRI值分析图；

g：实施例1作用HeLa细胞72h的DRI值分析图；

h：实施例2作用HeLa细胞72h的DRI值分析图；

i：实施例1作用LoVo细胞48h的DRI值分析图；

j：实施例2作用LoVo细胞48h的DRI值分析图；

k：实施例1作用LoVo细胞72h的DRI值分析图；

l：实施例2作用LoVo细胞72h的DRI值分析图。

图5是BS或CDDP作用48小时后TrxR1、Trx1、β-actin蛋白表达水平和TrxR活性图；

A：BS作用48小时后，BEL-7402细胞中TrxR1、Trx1、β-actin蛋白水平的Westernblot分析；B：CDDP作用48小时后，BEL-7402细胞中TrxR1、Trx1、β-actin蛋白水平的Westernblot分析；C：BS对BEL-7402细胞TrxR活性(左)、TrxR1(中)、Trx1(右)蛋白相对水平的影响。数据表示为平均值±标准差，n≥3。^*P<0.05，表示与对照组相比具有统计学差异；^#P<0.05，表示与BS 10μM组相比具有统计学差异；^※P<0.01，表示与BS 20μM组相比具有统计学差异；D：CDDP对BEL-7402细胞TrxR活性(左)、TrxR1(中)、Trx1(右)蛋白相对水平的影响。数据表示为平均值±标准差，n≥3。^*P<0.05，表示与对照组相比具有统计学差异；^**P＜0.01，表示与对照组相比具有统计学差异，^#P<0.05，表示与CDDP 10μM组相比具有统计学差异；^※P<0.05，表示与CDDP 20μM组相比具有统计学差异；^ΔP<0.05，表示与CDDP 30μM组相比具有统计学差异。

图6是作用48小时后，BS或CDDP诱导BEL-7402细胞凋亡图；

A：用0(对照)、20、30、40μM BS或CDDP作用48小时后对BEL-7402细胞的促凋亡作用。左上象限：死细胞；右上象限：晚期凋亡细胞；左下象限：活细胞；右下象限：早期凋亡细胞；B：BS作用48小时后BEL-7402细胞的总细胞凋亡率。数据表示为平均值±标准差，n≥3。**P<0.01，表示与对照组相比具有统计学差异；^#P<0.01，表示与BS 20μM组相比具有统计学差异；^※P<0.05，表示与BS 30μM组相比具有统计学差异；C：CDDP作用48小时后BEL-7402细胞的总细胞凋亡率。数据表示为平均值±标准差，n≥3。*P<0.05，表示与对照组相比具有统计学差异；**P<0.01，表示与对照组相比具有统计学差异；^#P<0.05，表示与CDDP 20μM组相比具有统计学差异；^※P<0.05，表示与CDDP 30μM组相比具有统计学差异。

图7是BS、CDDP联合给药组增强BEL-7402细胞的凋亡诱导作用图；

在BEL-7402细胞中用30μM BS(B)、30μM(C)和30μM联用(BS:CDDP＝1:1)组(D)作用48小时后对细胞凋亡的影响。

图8是BS、CDDP联合应用通过降低BEL-7402细胞中Bcl-2/Bax蛋白表达比例诱导细胞凋亡图；

A：30μM BS、30μM和30μM联用(BS:CDDP＝1:1)组作用48小时后，BEL-7402细胞中Bax、Bcl-2、β-actin蛋白水平的Western blot分析；B：BS、CDDP单药及联合给药组作用48小时后BEL-7402细胞的总细胞凋亡率。数据表示为平均值±标准差，n≥3。**P<0.01，表示与对照组相比具有统计学差异；^#P<0.05，表示与BS 30μM组相比具有统计学差异；^※P<0.05，表示与CDDP 30μM组相比具有统计学差异；C：根据其相应的免疫印迹条带对Bcl-2/Bax比例进行直方图分析。数据表示为平均值±标准差，n≥3。**P<0.01，表示与对照组相比具有统计学差异；^#P<0.05，表示与BS 30μM组相比具有统计学差异；^※P<0.05，表示与CDDP 30μM组相比具有统计学差异。

图9是各组小鼠肿瘤生长情况。每两天使用游标卡尺测量小鼠肿瘤大小，根据公式：瘤长×瘤宽2×0.5236计算肿瘤体积。(a)：实验结束时各组肿瘤照片；(b)：各组小鼠肿瘤体积变化情况。数据表示为平均值±标准差(n＝6)。*P＜0.05，表示与对照组相比具有统计学差异。

图10是小鼠体重变化情况。(a)：小鼠在给药过程中体重变化情况；(b)：各组小鼠给药过程中体重增长情况。*P＜0.05，表示与对照组相比具有统计学差异。

图11是小鼠肿瘤组织TrxR蛋白表达水平。(a)：小鼠肿瘤组织TrxR表达水平；(b)：TrxR的相对表达量。数据表示为平均值±标准差，n＝3。*P<0.05，表示与对照组相比具有统计学差异；^#P<0.05，表示与CDDP组相比具有统计学差异。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

实验方法：

1.试验药品、细胞及动物：

BS：化学名1,2-二[2-(1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]-丁烷，参考中国专利第02158917.8号申请。

顺铂(Cisplatin，CDDP)：购自华中海威(北京)基因科技有限公司。

人肝癌细胞Bel-7402、人结直肠癌细胞LoVo、人上皮***细胞HeLa、人肺癌细胞A549：均购自协和医科大学基础医学院细胞中心。

Balb/c小鼠：4周龄，体重16g-18g，雄性，购自北京大学医学部实验动物中心，实验动物生产许可证号SYXK(京)2012-0036。饲养环境清洁级，饲养温度25±2℃，12h光照12h黑暗，充足食水供应。

2.试验方法：

2.1细胞增殖抑制率检测法(SRB法)：

(1)将贴壁培养的细胞消化为单细胞悬液，调整细胞浓度为2×10⁴个/mL，均匀接种于96孔板(Corning)，每孔180μL；

(2)将96孔板置于培养箱中24h，待细胞贴壁后按照指定浓度加入化合物20μL/孔；

(3)药物作用终点，每孔加入100μL 4℃预冷的10％(v/v)三氯乙酸，将96孔板于4℃固定1h；

(4)小心弃去固定液，用去离子水从96孔板一侧缓缓冲洗4遍，用电热吹风吹干或者室温自然干燥(干燥后的96孔板可以室温长期保存)；

(5)每孔中加入100μL 0.057％(w/v)的SRB染色液，室温染色30min；

(6)小心弃去染液，每孔用150μL 1％(v/v)乙酸洗涤4次，用电热吹风吹干或者室温自然干燥(干燥后的96孔板可以室温长期保存)；

(7)每孔中精确加入200μL 10mM的Tris脱色液，室温静置使之自然溶解或置于摇床上使之溶解；

(8)用酶标仪(Thermo Fisher Scientific)检测样品在492nm处的吸光值。依据以下公式计算细胞增殖抑制率：

其中，对照孔接种细胞混悬液180μL，以同等体积培养基(20μL)代替化合物；空白孔接种时加入180μL培养基，给药时加入20μL培养基。每个药物浓度设置三个复孔。

2.2Western Blot法：

提取组织总蛋白并测定蛋白浓度(30-50μg)加入5×上样缓冲液，以RIPA裂解液补足体积，混匀后95℃变性处理10min。充分混匀后，加入洁净的1.5mm制胶板至适当位置正丁醇进行水封。加入1mL 1×分离胶缓冲液，室温放置过夜；***1.5mm加样梳，室温静置2h等待胶凝。

拔去加样梳，常法上样；80V恒压电泳，至溴酚蓝前沿进入分离胶，将电压提高至160V继续恒压电泳，至溴酚蓝迁移接近分离胶末端时停止电泳。

精确剪取与分离胶同样大小的6张滤纸和一张0.2μm PVDF膜，将PVDF膜于甲醇中浸泡10s，去离子水中浸泡3min，电转缓冲液中浸泡3min；

电转三明治由正极到负极的顺序依次安放：一张海绵、三张滤纸、PVDF膜、分离胶、三张滤纸、一张海绵(全部预先用电转缓冲液浸泡)，每层之间用玻璃棒赶出气泡，夹好电转夹连同冰盒一起放入电转槽；

将电转槽置于冰水浴中，250mA恒流电转2h。

电转完毕后，将PVDF膜取出，置于5％封闭；TBST洗膜3次，将PVDF膜与稀释适当比例的二抗溶液一同封闭于杂交袋中，室温孵育1h，TBST洗膜3次，显影；

打开凝胶成像系统，将ECL发光液的A液和B液等体积混匀后均匀分布在PVDF膜上，进行曝光分析。

2.3基于流式细胞术的细胞凋亡测定法：

1)取对数生长期的细胞接种于六孔板(Corning)中，5×10⁴个/孔，每孔含细胞悬液2mL，将培养皿置于培养箱中培养。待24h细胞贴壁后，弃去培养基，向其中加入相应浓度的药液2mL，对照组加入等体积的培养基；

2)药物作用24h后，回收培养基于5mL离心管中，1200rpm离心2min，弃上清。培养皿中的贴壁细胞用4℃预冷的PBS润洗一遍，加入300μL胰酶后置于培养箱中消化3min；

3)用1mL培养基将细胞吹打成单细胞，用1mL PBS重悬离心管中的沉淀细胞，与相应组别培养皿中的贴壁细胞合并，400rpm离心2min，弃上清。用1mL PBS重悬细胞，过300目细胞筛，；

4)用190μL结合液重悬沉淀细胞，加入10μl Annexin V-FITC，室温避光孵育10min，4000rpm离心2min，弃上清；

5)用195μL结合液重悬沉淀细胞，加入5μL PI溶液，立即于流式细胞仪(BDFACSCalibur)上检测。

2.4小鼠Lewis肺癌术后肿瘤复发模型的建立：

对皮下移植鼠肺癌细胞Lewis的Balb/c小鼠进行了如下的局部肿瘤切除术：待小鼠右侧腋下肿瘤达到大约500mm³时，腹腔注射5％水合氯醛溶液(0.08mL/10g)进行麻醉并备毛。待小鼠进入全麻状态后，在肿瘤附近剪一个1-2cm的切口，将肿瘤组织钝性剥离并切除90％，残留大概50mm³的瘤组织，最后使用无菌的医用丝线进行缝合，在伤口处涂抹碘伏进行消毒。以上操作均在超净台内完成。将小鼠安置到洁净、温暖的地方，并给予无菌的葡萄糖水供其苏醒后饮用。手术当天被认为是手术后0天。待小鼠全部苏醒后随机分为4组，每组6只，药物治疗方案如下：

空白对照组(5‰CMC-Na,i.g.,q.d.)；药品低中高剂量组：90mg·kg^-1,i.g.,q.d.；180mg·kg^-1,i.g.,q.d；360mg·kg^-1,i.g.,q.d.。

实验期间隔天记录小鼠体重，肿瘤体积及活动状况。给药八天后处死小鼠，摘除眼球取血，用于血清中TrxR活性检测。迅速分离肿瘤、肝脏、肾脏、胸腺和脾脏，观察并称重。

2.5药液配制

BS药物母液：称取BS，加入DMSO将其溶解，制备成10mM的储备液，于-20℃保存备用。

CDDP母液：称取CDDP，加入PBS将其溶解，制备成10mM的储备液，于室温保存备用。

用前根据研究需要，用不含血清的培养基将母液稀释到所需浓度(15、20、30、40μM)的工作液。后面各个试验均按照实验需要稀释使用。

实施例1

BS与CDDP按照摩尔比1:1同时给药。

实施例2

BS与CDDP按照摩尔比2:1同时给药。

实施例3BS与CDDP联合应用抑制肿瘤细胞增殖的体外实验研究

3.1BS、CDDP单药及二者联用对肿瘤细胞的增殖抑制作用

采用Bel-7402细胞、LoVo细胞、HeLa细胞和A549细胞分别与BS单药、CDDP单药、实施例1联合用药、实施例2联合用药孵育24h、48h、72h、通过SRB法测定细胞增殖抑制率。

BS、CDDP单药及二者联用组治疗癌细胞的IC₅₀(半数抑制浓度)和MI(最大抑制率)值如表1所示。BS、CDDP单药及联合给药组抑制癌细胞的生长呈现时间依赖性。

表1.BS、CDDP单药及二者联合抑制癌细胞增殖的IC₅₀值和MI值

数据表示为平均值±标准差，n≥3。

BEL-7402、LoVo、HeLa和A549细胞给药24h后，BS组IC₅₀值分别为28.90±6.65、3.26±1.67、8.98±2.34和14.62±3.57μM，CDDP组IC₅₀值分别为51.71±6.84、46.18±10.76、17.88±1.48和93.15±27.50μM，BS组IC₅₀值远小于CDDP组。此外，在BEL-7402、LoVo、HeLa和A549细胞中，BS治疗24h的MI值(分别为64.14％、93.12％、79.13％和74.84％)高于CDDP治疗组的MI值(分别为58.84％、58.50％、73.21％和46.35％)。这些结果表明，在BEL-7402、LoVo、HeLa和A549细胞中，BS作用24h的增殖抑制作用强于CDDP。此外，在BEL-7402细胞中，二者联合应用显示出比单药更高的抑制率(表1，图1)。

在BEL-7402、LoVo、HeLa细胞中药物作用48h后，实施例1和实施例2联合给药组的IC₅₀值远小于BS、CDDP单药组的IC₅₀值。在A549细胞中，与实施例2BS:CDDP＝2:1相比，实施例1BS:CDDP＝1:1联合给药组的IC₅₀更小。BEL-7402、LoVo细胞中，BS给药48h的MI值(84.04％、95.30％)高于CDDP单药组的MI值(分别为76.37％和95.30％)。在BEL-7402和LoVo细胞中，联合给药组的抑制率高于CDDP单药组(表1，图2)。

在药物作用72h后，实施例1和实施例2联合给药组在BEL-7402细胞中显示出比CDDP单药更强的抑制作用(表1，图3)。此外，在BEL-7402、LoVo、HeLa和A549细胞中，实施例1和实施例2联合给药组的IC₅₀值远低于CDDP单药组的IC₅₀值(表1)。药物作用72h后，实施例1BS:CDDP＝1:1联合给药组在BEL-7402、HeLa、A549细胞中的IC₅₀低于实施例2BS:CDDP＝2:1联合给药组，而在LoVo细胞中，实施例2BS:CDDP＝2:1联合给药组显示出了更低的IC₅₀值(1)。

3.2CI联合指数分析

我们进行了联合指数分析以进一步评估组合效应。表2列出了BS、CDDP联合给药时对BEL-7402、LoVo、HeLa和A549细胞作用24h、48h、72h的CI值(CI<0.9表示协同作用、)。联合给药组作用24h时，在BEL-7402细胞中，实施例1BS:CDDP＝1:1联合给药组显示出协同作用，而在LoVo和HeLa细胞中，实施例1和实施例2联合给药组在增殖抑制率分别达到90％和80％后显示出协同作用。药物作用48小时后，实施例2BS:CDDP＝2:1联合给药组在A549细胞中显示出协同效应。在BEL-7402、LoVo、HeLa细胞中，当生长抑制率分别达到80％、90％和70％时，实施例1BS:CDDP＝1:1联合给药组显示出协同作用。在BEL-7402和LoVo细胞中作用72h后，增殖抑制率低于95％时，实施例2BS:CDDP＝2:1联合给药组显示出协同作用，BS:CDDP＝2:1分别在24小时对HeLa细胞和BEL-7402细胞、48小时对A549细胞、72小时对LoVo细胞和BEL-7402细胞显示出协同作用。综合来看，实施例2对于LoVo细胞和A549细胞以及BEL-7402细胞处理72小时，均表现比实施例1更为好的协同效果。

表2.BS与CDDP在癌细胞中联合给药的CI分析

数据表示为平均值±标准差，n≥3。S：协同作用。

3.3DRI剂量减少指数分析

我们对BEL-7402、LoVo和HeLa细胞，BS、CDDP联合给药的DRI值进行了分析，结果如图4所示。在大多数情况下，BS、CDDP联合给药作用24、48、72h后的DRI值大于1。这些结果意味着联合给药在大多数情况下能够减少BS和CDDP的剂量，特别是在BEL-7402和LoVo细胞中。此外，CDDP的DRI值在大多数情况下高于BS，表明与BS的联合应用是降低CDDP给药剂量的有效方法。

3.4BS和CDDP在体外下TrxR活性分析

有报道顺铂具有TrxR抑制作用。我们首先研究了BS和CDDP在人肝癌细胞系BEL-7402中对TrxR蛋白含量的影响。采用Western Blotting法(免疫印迹试验)检测了BS或CDDP10、20、30、40μM作用于BEL-7402细胞48h后，细胞内TrxR的蛋白含量变化，结果如图4所示。与对照组相比，CDDP或BS给药组TrxR蛋白表达量未见明显变化。继而我们考察了BS及CDDP对TrxR蛋白活性的影响。将10、20、30、40μM BS或CDDP作用于BEL-7402细胞48h后，提取细胞总蛋白，DTNB还原法测定细胞内TrxR活性，结果如图5所示。在BEL-7402细胞中经不同浓度的BS或CDDP处理48h后，随着给药浓度的增加，BEL-7402细胞中TrxR的活性随之降低，并呈剂量依赖性。当BS(顺铂)的剂量提高至40μM时，TrxR的活性仅为control组的37.23％(62.08％)左右，表现出了强烈的抑制TrxR活性的作用。故BS和顺铂对TrxR的调控是通过抑制TrxR活性而不是TrxR的蛋白表达量来发挥作用的。

研究BS及CDDP对Trx1蛋白含量的影响。Western结果表明，BS及CDDP作用48小时后，BEL-7402细胞中的Trx1的蛋白含量降低(图5)。40μM BS作用后的Trx1相对蛋白水平仅为对照组的29.18％，而40μM CDDP作用后的Trx1相对蛋白水平为对照组的32.02％。

3.5细胞凋亡分析

随后我们在BEL-7402细胞中进行了基于流式细胞术的细胞凋亡测定。用0、20、30、40μM BS或CDDP作用于BEL-7402细胞48h后，图6A显示了一次典型结果。20、30、40μM BS作用48h后，BEL-7402细胞的总细胞凋亡率分别为16.78％、46.18％和65.49％，而CDDP作用后的总细胞凋亡率分别为10.93％、12.88％、27.92％。结果表明，BS及CDDP以剂量依赖的方式诱导BEL-7402细胞的凋亡。

为了进一步探索联合治疗癌细胞中的协同作用，我们选取BS:CDDP＝1:1的比例在BEL-7402细胞中进行了后续实验。与细胞增殖抑制的结果一致，联合给药组的总细胞凋亡率高于单药组。如图7所示，在30μM BS、CDDP联合给药(1:1)时，BEL-7402晚期凋亡细胞的百分比高于单药组。具体来说，BS、CDDP单药及联合给药组的总细胞凋亡率分别为46.18％、12.7％和55.49％(图8B)。

3.6BS与CDDP联合给药降低Bcl-2/Bax蛋白的比例

为了研究协同作用潜在的机制，在30μM BS、30μM和30μM联用(BS:CDDP＝1:1)组作用48小时后，我们利用Western Blot法对Bax、Bcl-2的蛋白含量进行了分析。结果如图8A所示，联合给药组能够显著增加Bax的表达，降低Bcl-2的蛋白表达。因此，联合给药组的Bcl-2/Bax的比例远低于对照组。以上结果表明，联合给药可能通过降低Bcl-2/Bax蛋白表达比例诱导BEL-7402细胞凋亡，从而达到协同增效的作用。

实施例4BS和CDDP联用抑制Lewis肺癌小鼠术后肿瘤复发

BS给药组(180mg/kg)：BS原药溶于5mL 5‰CMC-Na溶液中，制成混悬液，给药剂量为5mL/kg；

顺铂给药组(2mg/kg)：称取顺铂2mg，溶于5mL生理盐水中，制成溶液，给药剂量为5mL/kg。

联合给药组：BS给药组和顺铂给药组混合，给药剂量为5mL/kg。

选择Balb/c小鼠建立小鼠Lewis肺癌术后肿瘤复发模型。给药八天后处死。

结果如图9所示，给药后各给药组均显示出有效的抑制术后肿瘤复发的能力，并呈现出时间依赖性。实验结束后，对照组的荷瘤小鼠的平均瘤体积为568.2±121.1mm，BS给药组的荷瘤小鼠的平均瘤体积为283.3±45.7mm³，CDDP给药组的荷瘤小鼠的平均瘤体积为341.7±29.6mm³，联合给药组的荷瘤小鼠的平均瘤体积为202.1±18.4mm³，肿瘤生长抑制率分别为50.1％，39.9％和64.4％，具有显著性差异(P<0.05)。至治疗结束时，对照组的相对肿瘤体积为11.36±2.42，BS给药组的相肿瘤体积为5.67±0.91，CDDP给药组的相对瘤体积为6.83±0.59，联合给药组的相对瘤体积为4.04±0.37；与对照组相比，BS给药组相对肿瘤增值率为49.9％，CDDP给药组相对肿瘤增值率为60.1％，联合给药组相对肿瘤增值率为35.6％(表3)。

实验结束后，解剖小鼠，完整剥离出肿瘤，称重(表4)。对照组的荷瘤小鼠的平均瘤重量为476.5±169.6mg，BS给药组的荷瘤小鼠的平均瘤重量为275.0±73.8mg，CDDP给药组的荷瘤小鼠的平均瘤重量为301.3±148.2mg联合给药组的荷瘤小鼠的平均瘤重量为161.1±22.9mg，肿瘤生长抑制率分别为42.3％，36.8％和66.2％，具有显著性差异(P<0.05)。

表3.实验结束时各组小鼠肿瘤体积

数据表示为平均值±标准差(n＝6)。*P＜0.05，表示与对照组相比具有统计学差异；^#P＜0.05，表示与CDDP组相比具有统计学差异。

表4.实验结束时各组小鼠肿瘤重量

数据表示为平均值±标准差(n＝6)。*P＜0.05，表示与对照组相比具有统计学差异。

4.1BS和CDDP给药对荷瘤小鼠毒性考察

4.1.1荷瘤小鼠整体状况观察

小鼠均活动正常，无特异表现(如进食活动异常，腹泻等)。

4.1.2各给药组对荷瘤小鼠体重影响

图10显示了小鼠在给药过程中的体重变化情况。可以观察到，对照组和BS给药组的小鼠体重均逐渐增长，CDDP给药组和联合给药组的小鼠体重在前四天有所下降，后四天逐渐增长。对照组，BS给药组、CDDP给药组和联合给药组在第八天时体重分别增长到初始体重的1.16±0.18，1.13±0.12，1.03±0.20，1.04±0.10倍，在第六天时，CDDP给药组的体重增长率与对照组有显著性差异(P<0.05)。说明CDDP对小鼠具有一定的毒性，而联合给药组在增加药效的同时并没有增加对小鼠的毒性。

4.1.3对荷瘤小鼠各脏器系数的影响

实验结束后，分别摘取小鼠的肝脏，肾脏，脾脏和胸腺进行观察，称重。解剖小鼠的过程中发现各组小鼠各脏器均正常，无坏死，肿大等器质性改变。结果如表5所示。BS给药组脾脏系数，肝脏系数和肾脏系数与对照组相比没有显著性差异，胸腺系数显著增大(P<0.05)；顺铂给药组的小鼠各脏器系数均有下降，其中肝脏系数和胸腺系数与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)，说明CDDP对小鼠有比较严重的肝脏毒性和免疫抑制，对脾脏和肾脏也具有一定毒性；联合给药组的各脏器系数相对于顺铂给药组有所回升，与对照组没有显著性差异，表明BS和CDDP联合给药具有一定的缓解CDDP毒性，提高免疫力的作用。

表5.各给药组对脏器系数的影响

注：数据表示为平均值±标准差(n＝6)。*P＜0.05，表示与对照组相比具有统计学差异。

4.1.4对荷瘤小鼠血常规的影响

为了进一步观察各给药组对小鼠的毒副作用，在实验结束后对检测小鼠外周血中白细胞，红细胞及血小板的数量，结果如表6所示。可以看到BS单药组白细胞，红细胞和血小板数与对照组相比均没有显著性差异，且红细胞和白细胞数量较对照组有所上升，说明BS可能具有一定的提高免疫力，减少血液毒性的作用；CDDP给药组各组白细胞，红细胞和血小板数量较对照组都有下降，其中血小板的下降具有显著性差异(P<0.05)，说明CDDP对小鼠具有较强的血液毒性；联合给药组的白细胞，红细胞和血小板数目较CDDP给药组都有所提升，与对照组没有显著性差异，说明CDDP与BS联合给药可以在提高抗肿瘤药效的同时减少CDDP的血液毒性，提高小鼠的免疫力。

表6.各给药组对小鼠血常规影响

注：数据表示为平均值±标准差(n＝6)。*P＜0.05，表示与对照组相比具有统计学差异。

4.2BS和CDDP联用抑制Lewis肺癌小鼠术后肿瘤复发的初步机制研究

4.2.1对TrxR活性和表达的影响

检测了小鼠血清和肿瘤组织中TrxR活性，结果如表7和8所示。在小鼠血清中，相对对照组，BS给药组，CDDP给药组和联合给药组的TrxR活性分别降低了39.16％，34.62％和56.48％，具有显著性差异(P<0.05)。在肿瘤组织中，相对对照组，BS给药组，CDDP给药组和联合给药组TrxR活性分别降低了39.54％，29.09％和54.89％，具有显著性差异(P<0.05)。说明BS和CDDP可能通过协同抑制TrxR的活性来达到抗肿瘤的目的。结果表明BS可以通过抑制TrxR活性来抑制肿瘤术后复发。

表7.各给药组对小鼠血清TrxR活性影响

数据表示为平均值±标准差(n＝6)。*P＜0.05，表示与对照组相比具有统计学差异。

表8.各给药组对小鼠肿瘤组织TrxR活性影响

数据表示为平均值±标准差(n＝6)。*P＜0.05，表示与对照组相比具有统计学差异。

接下来用Western Blot检测小鼠肿瘤细胞TrxR表达，结果如图11所示，BS组，CDDP组和联合给药组TrxR表达水平都有所下调，其中联合给药组相对对照组和CDDP组都具有显著性差异(P<0.05)。说明BS和CDDP联用具有协同抑制肿瘤组织内TrxR表达的作用。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。