具体实施方式

TTField是有效的抗肿瘤治疗方式，其通过低强度、中频(例如100-500 kHz)、交变的电场的非侵入性施加来递送。然而，在某些情况下，肿瘤细胞可以发展对TTField治疗的抗性，导致在这些情况下功效降低。在一些方面，对TTField的抗性被称为“干细胞特性”的增加或类似于干细胞的表型。可以通过干细胞特性标志物(例如CD44)的表达和通过在3D球体中的无血清培养基中生长并在植入免疫抑制小鼠的脑中时形成脑肿瘤的能力来测量干细胞特性。

重要的是，与其敏感对应物相比，在抗性细胞中保留了TTField诱导的染色体不稳定性(例如细胞质微核的形成)，指示对TTField的抗性通过非生物物理机制介导。事实上，在抗性细胞中TTField诱导的炎症响应被严重抑制，支持了这样的假设，即对TTField的抗性由生物物理损伤诱导的有害作用的选择性丧失所赋予。这种获得的TTField抗性表型与标准神经球测定所确定的向干细胞样状态的转变有关。

最近，免疫传感分子环GMP-AMP合酶(cGAS)-干扰素基因刺激物(STING，由TMEM173编码)途径被鉴定为胞质DNA传感的重要组分，并在介导细胞中的免疫应答中起重要作用。Ghaffari等人, British Journal of Cancer, 第119卷, 第440-449页 (2018)；参见例如图3。STING途径的激活通过响应细胞中的异常(例如，细胞质双链DNA (dsDNA)的存在)而介导免疫应答。

前列腺素E受体3 (PTGER3)是G-蛋白偶联受体和前列腺素E2的四种受体之一。PTGER3涉及与炎症、癌症、消化、神经系统、肾功能、血压和子宫收缩相关的生物系统和疾病。

PTGER3抑制剂包括NSAID (例如，阿司匹林、布洛芬)、cox2抑制剂(例如，塞来考昔、伐地考昔、罗非考昔)、L798,106和DG041。NSAID是用于缓解疼痛和减轻炎症的常用非处方药物。

本文描述的各方面使用系统方法，通过一套创新的计算平台的帮助，来理解抗性细胞中的“干细胞特性”发展并鉴定抗性机制的主调节子。发现三个网络被破坏，包括神经系统发育调节、炎症响应和细胞-细胞粘合，所有这些在GBM干细胞样细胞中起作用。

利用独特的主调节子分级系统，前列腺素E受体3 (PTGER3)被鉴定为这些途径顶点处的关键主调节子，并负责TTField抗性表型。PTGER3在暴露于TTField时在GBM细胞中快速上调，并且引导治疗的细胞远离TTField也平行激活的有益炎症途径。

PTGER3信号转导途径通过与前列腺素E2 (PGE2)相互作用而上调。TTField和阿司匹林或其它传统NSAID (例如cox2抑制剂)的组合可以防止PGE2生物合成，并因此防止PTGER3信号传导的激活。或者，PTGER3受体拮抗剂(例如L798,106,106、ONO-AE3-240和DG-O41)可单独使用或与其它PTGER3拮抗剂和抑制剂组合使用。这样的组合可以用于恢复发展抗性的细胞中对TTField的敏感性。

此外，用PTGER3抑制剂治疗的GBM细胞在暴露于TTField时可防止细胞发展对TTField的抗性，例如，约3周后至大于5周后。

提供了通过向受试者推荐给予前列腺素E受体3 (PTGER3)抑制剂，并向受试者的癌细胞施加交变电场来降低受试者中TTField抗性癌细胞的活力的方法。所述交变电场的频率可在100-500 kHz之间。

如本文所用的术语“降低活力”是指减少增殖、诱导凋亡或杀死癌细胞。本文所用的术语“TTField抗性癌细胞”是指与TTField敏感的癌细胞相比，癌细胞对TTField治疗的敏感性显示降低10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。本文所用的术语“敏感性”是指对TTField治疗的响应性，例如通过在用TTField治疗后细胞数目的减少来测量。

术语“推荐”是指来自例如医学专业人员(例如医生、医师助理、护士、护理师等)对受试者(例如患者)的建议或指示。

在一些情况下，PTGER3抑制剂选自NSAID (例如阿司匹林、布洛芬)、cox2抑制剂(例如塞来考昔、伐地考昔、罗非考昔)、L798,106和DG041中的一种或多种。在一个方面，PTGER3抑制剂是阿司匹林。

在一些情况下，PTGER3抑制剂在受试者中的推荐浓度对于L798,106为约1-500纳摩尔，对于阿司匹林为0.1-2毫摩尔，对于DG041为0.5-50纳摩尔，或对于塞来考昔为1-500纳摩尔。术语“推荐浓度”可以指足以在受试者中提供间歇或持续水平的PTGER3抑制剂的推荐剂量。在一些情况下，PTGER3抑制剂在受试者中的推荐浓度维持至少约3天至5周。在一些情况下，癌细胞选自成胶质细胞瘤、肺癌、胰腺癌、间皮瘤、卵巢癌和乳腺癌细胞。

进一步的方面提供了通过向受试者推荐给予前列腺素E受体3抑制剂，并向受试者的癌细胞施加交变电场来防止受试者的癌细胞发展对交变电场的抗性的方法。所述交变电场的频率在100-500 kHz之间。在一些情况下，交变电场的频率在100-300 kHz之间。

在一些情况下，PTGER3抑制剂选自NSAID (例如阿司匹林、布洛芬)、cox2抑制剂(例如塞来考昔、伐地考昔、罗非考昔)、L798,106和DG041中的一种或多种。在一个方面，PTGER3抑制剂是阿司匹林。

在一些情况下，PTGER3抑制剂在受试者中的推荐浓度对于L798,106为约1-500纳摩尔，对于阿司匹林为0.1-2毫摩尔，对于DG041为0.5-50纳摩尔，或对于塞来考昔为1-500纳摩尔。术语“推荐浓度”可以指足以在受试者中提供间歇或持续水平的PTGER3抑制剂的推荐剂量。在一些情况下，PTGER3抑制剂在受试者中的推荐浓度维持至少约3天至5周。在一些情况下，癌细胞选自成胶质细胞瘤、肺癌、胰腺癌、间皮瘤、卵巢癌和乳腺癌细胞。

进一步的方面提供了通过向受试者推荐给予PTGER3抑制剂来恢复受试者的TTField抗性癌细胞中对TTField的敏感性的方法，其中受试者的TTField抗性癌细胞中对TTField的敏感性基本上恢复。

术语“恢复敏感性”是指将TTField抗性细胞的响应性重新建立为TTField敏感的细胞的响应性。在这方面，“响应性”通过计数暴露于TTField前后的细胞数目来测量。术语“基本上恢复”是指增加TTField抗性细胞的响应性。在一些情况下，TTField抗性细胞的响应性恢复至少10%。在一些情况下，TTField抗性细胞的响应性恢复至少25%。在一些情况下，TTField抗性细胞的响应性恢复至少50%。

在一些情况下，PTGER3抑制剂选自NSAID (例如阿司匹林、布洛芬)、cox2抑制剂(例如塞来考昔、伐地考昔、罗非考昔)、L798,106和DG041中的一种或多种。在一个方面，PTGER3抑制剂是阿司匹林。

在一些情况下，PTGER3抑制剂在受试者中的推荐浓度对于L798,106为约1-500纳摩尔，对于阿司匹林为0.1-2毫摩尔，对于DG041为0.5-50纳摩尔，或对于塞来考昔为1-500纳摩尔。术语“推荐浓度”可以指足以在受试者中提供间歇或持续水平的PTGER3抑制剂的推荐剂量。在一些情况下，PTGER3抑制剂在受试者中的推荐浓度维持至少约3天至5周。在一些情况下，癌细胞为成胶质细胞瘤细胞。

又一方面提供降低受试者中TTField抗性癌细胞的活力的方法，所述方法通过向受试者开PTGER3抑制剂处方，并向癌细胞施加交变电场。所述交变电场的频率可在100-500kHz之间。

如本文所用的术语“开处方”是指经授权可以写处方的医学专业人员，其向受试者提供药物处方或向药房或其它医药药房传达处方。

进一步的方面提供了通过为受试者开PTGER3抑制剂处方，并向癌细胞施加交变电场来防止受试者的癌细胞发展对交变电场的抗性的方法。所述交变电场的频率可在100-500 kHz之间。

又另一方面提供了通过为受试者开PTGER3抑制剂处方来恢复受试者的TTField抗性癌细胞中对TTField的敏感性的方法，其中在将PTGER3抑制剂给予受试者之后，受试者的TTField抗性癌细胞对TTField的敏感性恢复。

在一些情况下，提供了通过向受试者推荐给予EP3控制的抗性途径中的靶的抑制剂，并向受试者的癌细胞施加交变电场来降低受试者中TTField抗性癌细胞的活力的方法。所述交变电场的频率在100-500 kHz之间。

在一些情况下，所述EP3控制的抗性途径中的靶选自ZNF488和PRDM8。PRDM8抑制剂的实例包括但不限于氮杂胞苷和地西他滨。

如在图1A中所示，将人LN827成胶质细胞瘤细胞用TTField在200 kHz下治疗24小时，然后用4% PFA固定20分钟。用DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚)以1:5000的稀释对细胞染色，并在室温下孵育5分钟，对核和微核进行染色。在经TTField治疗的细胞中可以看到微核(箭头) (下图)。柱状图显示微核结构增加约15%。

图1B描述dsDNA (双链DNA)对促炎STING和细胞焦亡途径的诱导。dsDNA可以由异常有丝分裂诱导的微核产生。异常有丝分裂可例如由TTField诱导。TTField还可以降低核包膜完整性，如通过核纤层蛋白B1结构的破坏导致细胞质中的dsDNA和STING途径的诱导所显示的，如所示的。

对于在图2中总结的实验，通过以10,000/ml的密度接种LN827细胞产生TTField抗性人GBM细胞系，并用TTField在200 kHz的频率下治疗重复的1周循环。对于每个循环，在第2天、第4天和第7天计数细胞。在每个循环结束时，以与第0天相同的密度再次接种细胞，收获并加工用于RNAseq和低温贮藏用于将来分析。在TTField治疗至少四周后出现抗性细胞。如在图2中所示，与前几周相比，第5周后经TTField治疗的细胞的细胞数目明显更高，证明发展了在非抗性细胞中对TTField的细胞数目减少作用的细胞抗性。

将人GBM细胞系在200 kHz的频率下用TTField以及不用TTField治疗1周(TTF=敏感细胞；R-TTF=抗性细胞) (图3)。分析细胞的大小(流式细胞术)、微核结构(免疫荧光)和1型干扰素应答基因(qPCR)。如在左图中所示，U87C (敏感)和U87R (抗性)未显示细胞大小的变化。然而，右图(顶部)显示仍形成微核(比较TTF和R-TTF)。干扰素刺激的基因15(ISG15)(一种关键的1型干扰素应答基因)在U87R和LN827R抗性细胞系中不再产生。

图4显示由TTField诱导的促炎途径和抗性途径是独立的。使用shRNA (短发夹RNA)，STING/AIM2途径在“敲出” (KD) TTField抗性细胞系(U87R、LN428R、LN827R)中被耗尽。如所指示的治疗细胞3天，并通过细胞计数器(Bio-Rad TC10)确定细胞数目。如在图4中所示，即使当STING/AIM2途径被shRNA抑制时，保持对TTField的抗性(例如，将TTField柱与双KD+TTField相比较)。

图5显示对照细胞中以及在抗性细胞(LN428、LN827和U87)中TTField暴露后1周和5周时抗性细胞中总体基因表达变化的示例性变化。

图6显示使用算法和鉴定的基因与干细胞特性相关表型(例如，ERG、FOXF1、NFKBIZ、LIF、BCL3、EHF、ZNF488、SLC2A4RG、ETV4、PTGER3)和免疫应答(例如，CEBPD、RCOR2、TRIM22、SLC1A3、PLSCR1、FLI1)的相关性，抗性GBM细胞中的总体基因网络变化。

图7A显示在3个不同的GBM细胞系中，跨4个不同的时间点(0小时、6小时、24小时、1周、5周)，使用NETZEN (图7A)鉴定的对TTField的抗性的顶级主调节子的nSCORE等级。图7B显示PTGER3表达确定的RNAseq和蛋白质印迹与PTGER3 nSCORE等级相关。在293T细胞系中EP3过表达用作阳性对照，并且β-肌动蛋白作为负载对照。

图8提供暴露于TTField 24小时后由PTGER3控制的基因子网络的二维视图。图9显示PTGER3控制的基因子网络如何随着抗性细胞接管细胞培养物而变成占优势(第1周+第5周)。

图10显示在3种中PTGER3上调与暴露于TTField后TTField诱导的STING和细胞焦亡激活相关。利用定量RT-PCR检测PTGER3、IL6和ISG15 (STING和细胞焦亡激活的标志物)的转录水平。

图11显示在大鼠GBM模型中在体内PTGER3上调与TTField诱导的STING促炎性细胞因子相关。由Novocure建立。注射后1周在F98大鼠原位GBM模型(Novocure)中开始TTField治疗并持续1周。然后将动物安乐死，并收集肿瘤的RNA。进行定量RT-PCR以检测PTGER3、IL6和ISG15的转录水平。

图12基于来自Markovic等人, Structural features of subtype-selective EPreceptor modulators. Drug Discovery Today, 第22(1)卷 - 2017年1月1日的说明，说明PTGER3途径，包括受阿司匹林和PTGER3抑制剂L798,106和DG041)影响的信号途径的部分。

阿司匹林显著降低TTField抗性细胞中对TTField的抗性。图13显示阿司匹林降低TTField抗性GBM细胞(U87R、L428R和LN827R)中对TTField的抗性(将媒介物+TTField与阿司匹林+TTField相比较)。对于在图13中总结的实验，用媒介物对照或阿司匹林以及有或没有TTField治疗抗性人GBM细胞3天。每天补充药物。在终点使用细胞计数器定量活细胞的数目。

因此，发展对TTField治疗的抗性(例如，在长期使用的过程中)的患者可以通过服用阿司匹林(例如，每日)来降低对TTField的抗性，使得TTField治疗在更长的时间段内更有效。不受理论束缚，据信该方法可以改进TTField在发展抗性的患者中的有效性。

例如，在U87R抗性细胞中，TTField将活细胞计数从150 K/盘降低到125 K/盘。当向细胞提供阿司匹林时，活细胞计数从150 K/盘降低到100 K/盘。在LN428R抗性细胞中，TTField将活细胞计数从85 K/盘降低到70 K/盘。当向细胞提供阿司匹林时，活细胞计数从85 K/盘降低到40 K/盘。在LN827R细胞中，TTField稍微增加了活细胞计数。当向细胞提供阿司匹林时，活细胞计数从约125 K/盘降低到90 K/盘。

PTGER3抑制剂可以恢复对TTField的敏感性。抗性人GBM细胞用媒介物对照或EP3(PTGER3)抑制剂L798,106 (左图)或DG041 (右图)分别在200 kHz下用TTField或不用TTField治疗3天(图14)。DG041获自US Biological且L789,106获自Tocris。对于在图14中总结的实验，每天补充药物。在终点使用细胞计数器定量活细胞的数目。如在图14中所示，PTGER3抑制剂恢复了对TTField的敏感性(将TTField柱与L798,106+TTField和DG041+TTField相比较)。

如在图14 (左图)中所示，对于U87 GBM抗性细胞，TTField将活细胞计数从约200K/盘降低到125 K/盘。当向细胞提供PTGER3抑制剂L798,106 (0.5μM)时，活细胞计数从约200 K/盘降低到25 K/盘。如在图14 (右图)中所示，对于U87 GBM抗性细胞，TTField将活细胞计数从约160 K/盘降低到100 K/盘。当向细胞提供PTGER3抑制剂DG041 (50 nM)时，活细胞计数从约160 K/盘降低到约40 K/盘。该数据证明，即使在发展对TTField的抗性后，PTGER3抑制剂可以恢复对TTField的敏感性。

在TTField敏感的GBM细胞中的强制PTGER3表达赋予对TTField的抗性。如在图15A中所示，用表达空载体对照(EV)或PTGER3的慢病毒转导人GBM细胞，并随后用TTField在200kHz下治疗3天。使用细胞计数器定量活细胞的数目。通过蛋白质印迹确定EP3过表达效率(图15B)。仅在过表达的EP3的细胞(U87和LN428)中赋予了抗性，而在过表达EP3失败的细胞(LN827)中没有赋予抗性。

用另外两个包括PTGER3抑制剂(L798,106和L798,106+TTField)的组重复使用来自图2的原始人GBM细胞系的抗性细胞系产生实验(图16)。L798,106 PTGER3抑制剂防止发展对TTField的抗性。在相同的细胞密度和时间点接种细胞并计数。在总共5个循环内，每个循环持续7天。

在图17中所示的结果证明在暴露于TTField时在核中存在EP3。这些结果显示EP3(一种7跨膜细胞表面受体)存在或易位至核，在该核中它用作对TTField的抗性的主调节子，与数百个基因直接相互作用。绝大多数主调节子是定位于核的转录因子。

不受理论束缚，据信EP3上调，并且在暴露于TTField时存在或易位至核，提供了由此EP3可以直接或间接通过其它转录因子(例如神经元干因子ZNF488)调节其它基因的机制。因此，据信EP3通过促进GBM干细胞的发展和富含来调节对TTField的抗性，GBM干细胞由于其再循环速率慢和其它存活和抗凋亡途径而对许多治疗形式(例如TTField)有抗性。

如在图18A-18B中所示，TTField抗性GBM细胞富含“干细胞特性”表型(例如，神经胶质瘤球形成和CD44表面标志物)。图18A显示在用TTField治疗1周的抗性细胞中神经胶质瘤球形成，而用TTField治疗1周的TTField敏感的细胞没有显示神经胶质瘤球形成。

图18B显示与TTField敏感的细胞相比，TTField抗性细胞中CD44表面标志物增加。如所指示的治疗人GBM细胞系，然后以100个细胞/孔的密度接种到96孔板的无FBS干细胞培养物培养基中，培养4周，并在室温下用钙黄绿素AM染料染色30分钟。在波长ex/em=456/541nm下在读板器(SpectraMax® i3x)中拍摄每个孔的图像。通过FACS测量CD44表达。

如在图19中所示，TTField抗性细胞富含GBM干细胞，导致肿瘤生长和死亡增加。将TTField抗性和TTField敏感的细胞植入小鼠脑中。将在每种治疗条件下的相等数量的细胞原位植入NSG小鼠的脑中，并测量存活作为肿瘤生长的代表。

尽管已经参考某些实施方案公开了本发明，但是在不背离如所附权利要求中限定的本发明的领域和范围的情况下，可以对所描述的实施方案进行许多修改、变更和改变。因此，旨在本发明不局限于所描述的实施方案，而是具有由所附权利要求的语言及其等同物限定的全部范围。