阅读说明：本技术 一种沙门氏菌免疫磁珠洗液 (Salmonella immunomagnetic bead washing liquor ) 是由 曲晓莹 吴清平 蔡芷荷 卢勉飞 万强 李艳嫦 陈鲁 于 2019-10-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种沙门氏菌免疫磁珠洗液,通过组分的优化,与常规洗液相比,在洗涤过程中提高了洗液的清洗效果,并且有效降低了食品基质的干扰,而且具有特异持续性增菌的功效,尤其是目标菌含量极低的样品增菌效果显著,从而提高了沙门氏菌的检出率,为免疫磁珠在试剂检测中的应用提供了保障。(The invention discloses salmonella immunomagnetic bead washing liquor, which is characterized in that through component optimization, compared with the conventional washing liquor, the washing liquor has the advantages that the washing effect is improved in the washing process, the interference of a food matrix is effectively reduced, the specific and persistent bacteria increasing effect is realized, particularly, the bacteria increasing effect of a sample with extremely low target bacteria content is remarkable, the detection rate of salmonella is improved, and the application of immunomagnetic beads in reagent detection is guaranteed.)

一种沙门氏菌免疫磁珠洗液

技术领域

本发明属于免疫技术领域，特别涉及一种沙门氏菌免疫磁珠洗液。

背景技术

沙门氏菌是一种引起细菌性食物中毒最常见的食源性致病菌，广泛分布在世界各地。沙门氏菌属于宿主广泛型病原菌，可以在动物与动物、动物与人以及人与人直接或间接地传播。沙门氏菌的感染途径主要是食物或者直接接触。感染沙门氏菌，会引起食物中毒性胃肠炎、伤寒、败血症等多种症状，婴幼儿、老人、免疫力低下者及近期内服用过抗菌药物者更容易受到感染。因此，沙门氏菌对人类身体健康和生命安全会造成巨大伤害。

沙门氏菌引发的沙门氏菌病是世界各地最为普遍的食源性细菌疾病。近些年新型检测技术尤其是分子检测产品的不断涌现，检测沙门氏菌灵敏度得到了提高，但检测结果很容易受到样品基质的影响，样品前处理的重要性变得尤为突出。

众多检测技术中，免疫磁珠法效果显著。免疫磁珠法是一种具有特异性的分离富集技术，在多个领域如DNA提取、蛋白纯化、细胞筛选、食源性致病微生物富集等，都有重要的应用价值。高品质的抗体资源对免疫磁珠特异性富集至关重要，但实际应用中，不同的食品基质如肉沫会干扰富集过程，造成免疫磁珠的回收率降低从而降低富集效果。因此在免疫富集操作过程中，需要使用免疫磁珠洗液清除食品杂质。但常规免疫磁珠洗液在实际应用中并没有起到很好的效果，肉沫等复杂食品样品富集时，会损失大量免疫磁珠，从而降低了目标菌的检出率。因此，需要对免疫磁珠洗液的组分进行优化，提高洗液的清洗效果。除此之外，在实际检测中，很多样品的目标菌含量极低，按照国标法增菌后目标菌含量依然很低，导致检出率不高，而且免疫磁珠洗液中还增加了特异性增菌成分，在清洗过程中还可以起到持续增菌的效果。

根据现今存在的问题，研制一种沙门氏菌免疫磁珠洗液成为亟需解决的问题。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种沙门氏菌免疫磁珠洗液，以降低食品基质的干扰并提高目标菌沙门氏菌的检出率。

为达到上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明第一个方面，提出了一种沙门氏菌免疫磁珠洗液。根据本发明的实施例，所述沙门氏菌免疫磁珠洗液，其溶液为缓冲液，所述缓冲液中添加有表面活性剂、蛋白质、水溶性糖、无机盐、特异性抑菌剂，其中特异性抑菌剂可以抑制样品中的非目标菌生长。根据本发明的实施例效果，可提高了洗液的清洗效果，并且有效降低了食品基质的干扰，而且具有特异持续性增菌的功效，尤其是目标菌含量极低的样品增菌效果显著，从而提高了沙门氏菌的检出率。

根据本发明的实施例，其溶液为缓冲液，所述缓冲液中添加有0.2～1.4g/L表面活性剂、2.0～35g/L蛋白质、5.5～9.5g/L水溶性糖、0.5～0.8g/L无机盐和6.0～33.5mg/L特异性抑菌剂。

根据本发明的实施例，所述表面活性剂选自Tween-20、TritonX-100、OHODASURFON-870中的至少一种；

所述蛋白质选自胰蛋白胨、大豆胨、酪蛋白钠、乳白蛋白中的至少一种；

所述水溶性糖选自葡萄糖；

所述无机盐选自NaCl、KCl的至少一种；

所述特异性抑菌剂为新生霉素钠、万古霉素和头孢磺啶钠的至少一种。

根据本发明的实施例，所述洗液的pH＝7.0～7.5，其溶液为缓冲液，所述缓冲液中添加有5.5～9.5g/L葡萄糖，3.5～6.5g/L胰蛋白胨，9.5～15.5g/L大豆胨，2.0～3.0g/L酪蛋白钠，6.5～10.0g/L乳白蛋白，0.5～0.70g/L NaCl，9.5～13.5mg/L万古霉素，8.0～12.0mg/L新生霉素钠盐，6.0～8.0mg/L头孢磺啶钠，0.6～0.7g/L Tween-20，0.2～0.3g/LTritonX-100和0.30～0.40g/L OHODASURF ON-870。发明人发现，质量比在上述范围内时，增菌和清洗效果更显著。为了进一步效果，发明人进行了进一步优化，惊喜地发现，配比效果大大增强，在上述范围内时，增菌和清洗效果更佳显著。

根据本发明的实施例，所述洗液的pH＝7.0～7.5，其溶液为缓冲液，所述缓冲液中添加有5.5g/L葡萄糖，3.5g/L胰蛋白胨，9.5g/L大豆胨，2.0g/L酪蛋白钠，6.5g/L乳白蛋白，0.5g/L NaCl，9.5mg/L万古霉素，8.0mg/L新生霉素钠盐，6.0mg/L头孢磺啶钠，0.6g/LTween-20，0.2g/L TritonX-100和0.3g/L OHODASURF ON-870。在上述配比中，增菌和清洗效果更佳显著。

根据本发明的实施例，所述洗液的pH＝7.0～7.5，其溶液为缓冲液，所述缓冲液中添加有7.5g/L葡萄糖，5.0g/L胰蛋白胨，12.5g/L大豆胨，2.5g/L酪蛋白钠，8.0g/L乳白蛋白，0.65g/L NaCl，11.5mg/L万古霉素，10.0mg/L新生霉素钠盐，7.0mg/L头孢磺啶钠，0.65g/L Tween-20，0.25g/L TritonX-100和0.35g/L OHODASURF ON-870。在上述配比中，增菌和清洗效果更佳显著。

根据本发明的实施例，所述洗液的pH＝7.0～7.5，其溶液为缓冲液，所述缓冲液中添加有9.5g/L葡萄糖，6.5g/L胰蛋白胨，15.5g/L大豆胨，3.0g/L酪蛋白钠，10.0g/L乳白蛋白，0.70g/L NaCl，13.5mg/L万古霉素，12.0mg/L新生霉素钠盐，8.0mg/L头孢磺啶钠，0.7g/L Tween-20，0.30g/L TritonX-100和0.40g/L OHODASURF ON-870。在上述配比中，增菌和清洗效果更佳显著。

根据本发明的实施例，缓冲液为PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液。在上述配比中，增菌和清洗效果更佳显著。

本发明第二方面，本发明提出了前面所述免疫磁珠洗液的制备方法，按前面任一项所述的配方称取各原料，混合即得免疫磁珠洗液。

本发明第三方面，本发明提出了前面所述免疫磁珠洗液的使用方法，包括以下步骤：

将免疫磁珠与样品混匀孵育，静置磁分离，去上清；

加入前面任一项所述免疫磁珠洗液孵育，静置磁分离，去上清。

根据本发明的实施例，所述免疫磁珠与样品的体积比为：20μL：1mL。

根据本发明的实施例，所述孵育条件为35～37℃孵育10～15min。

根据本发明的实施例，所述静置1～2min。

根据本发明的实施例，所述免疫磁珠洗液体积为1～2mL。

本发明第四方面，本发明提出了前面任一项所述免疫磁珠洗液作为沙门氏菌检测试剂中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明的沙门氏菌免疫磁珠洗液通过组分的优化，与常规洗液相比，在洗涤过程中提高了洗液的清洗效果，并且有效降低了食品基质的干扰。更为突出的是具有特异持续增菌的功效，尤其是目标菌含量极低的样品增菌效果极为显著，从而提高了沙门氏菌的检出率，为免疫磁珠在试剂检测中的应用提供了保障。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整的说明，但并不局限于此。

OHODASURF ON-870是一种表面活性剂，购于扬州施惠尔生物科技有限公司，货号SPBHS17。

胰蛋白胨(货号T819615)，购自于麦克林公司；大豆胨(货号FA0030)，购自于北京索莱宝科技有限公司；酪蛋白钠(货号C8654)，购自于Sigma；乳白蛋白(货号TX00903)，购自于上海颖心实验室设备有限公司；新生霉素钠盐(货号MB5425)，购自于大连美仑生物技术有限公司；万古霉素(货号C29699)、头孢磺啶钠(货号S80772)购自源叶生物公司，其他材料、试剂，如无特殊说明，均为商业途径购得。

沙门氏菌免疫磁珠制备方法：

1)取1mg羧基磁珠放EP管中，加入1mL超纯水中超声30s，离心去上清取沉淀，清洗，最后重悬于100μL超纯水中；

2)缓慢加入MIX&GO活化剂(货号A-SMPN100，购于Sigma)100μL，置于混匀仪上室温活化1h；

3)活化后加1mL MEST(25mM，pH6.0)缓冲液洗涤2遍，重悬于100μL MES缓冲液中；

4)缓慢加入抗沙门氏菌抗体(购自于Abcam，货号ab35156)50～80μg，置于混匀仪上室温偶联2h；

5)用TBST缓冲液洗涤磁珠，加入1mL封闭液(含1％BSA的PBS溶液)，置于混匀仪上封闭2h；

6)封闭完成后，用TBST缓冲液洗涤磁珠，得到本发明后续实验的沙门氏菌免疫磁珠。

实施例1～8

实施例1～8的沙门氏菌免疫磁珠洗液按照表1的配方1～8对原料称取，使用PBS缓冲液(0.1M,PH7.4)配制成相对应的溶液；混合，搅拌混匀，使得洗液的pH＝7.0～7.5，即得沙门氏菌免疫磁珠洗液。

常规洗液配方为含0.5g/L Tween-20的PBS(0.1M，PH7.4)溶液。

表1免疫磁珠洗液不同配方组分

对本发明实施例的免疫磁珠洗液做进一步效果检测。

免疫磁珠洗液的单因素分析

沙门氏菌免疫磁珠洗液组分：乳白蛋白、OHODASURF ON-870单因素水平按表2设置，其他组分使用PBS缓冲液(0.1M,pH7.4)分别配制7.5g/L葡萄糖，5.0g/L胰蛋白胨，12.5g/L大豆胨，2.5g/L酪蛋白钠，0.65g/L NaCl，11.5mg/L万古霉素，10.0mg/L新生霉素钠盐，7.0mg/L头孢磺啶钠，0.65g/L Tween-20，0.25g/L TritonX-100，混合。

将沙门氏菌按照以下组别设置：0.1CFU/g、0.5CFU/g、2.5CFU/g、5CFU/g、10CFU/g、15CFU/g、20CFU/g，分别对猪肉进行人工感染。

依据国标GB4789.4-2016的实验步骤，对感染后的猪肉样品增菌，分别取增菌液1mL、20μL的免疫磁珠加到1mL猪肉样品中混匀后，37℃孵育10min，放入磁力架中静置1～2min，去除上清；加入1mL本发明制备的免疫磁珠洗液混匀后，37℃孵育15min,放入磁力架中静置1～2min后去除上清取沉淀，沉淀洗涤两次。

使用LAMP试剂盒(货号KJD05L，广东环凯微生物科技有限公司)说明书或者其他定量方法鉴定沙门氏菌的含量。

表2沙门氏菌免疫磁珠洗液组分的单因素实验

结果如表2所示，免疫磁珠洗液中乳白蛋白的适宜浓度为2.5～20g/L，沙门氏菌的检出量为5～10CFU/g，灵敏度极高；CFU/g OHODASURF ON-870的适宜浓度为0.2～0.4g/L，沙门氏菌的检出量为0.5～10CFU/g，灵敏度极高。

对本发明实施例的免疫磁珠洗液做进一步效果检测。

免疫磁珠洗液的灵敏度实验

按照0.1CFU/g、0.5CFU/g、2.5CFU/g、5CFU/g、10CFU/g、20CFU/g、62.5CFU/g七个水平对猪肉样品进行人工污染,依据国标GB4789.4-2016对样品增菌，分别取增菌液1mL，20μL免疫磁珠加入1mL样品中混匀后，37℃孵育10min，放入磁力架中静置1～2min，去除上清；加入1mL免疫磁珠洗液混匀后，37℃孵育15min,放入磁力架中静置1～2min后去除上清，重复洗涤操作进行两次。使用LAMP试剂盒或其他定量方法进行结果鉴定。

结果如表3所示。使用本发明制备的磁珠洗液能够显著地提高了检测沙门氏菌的灵敏度，其中配方5(实施例5)阳性检出率最多，效果最好。

表3沙门氏菌免疫磁珠洗液对检出率的影响

实际样品验证

从三个农贸市场各采集50份猪肉样品，按照国标GB4789.4-2016对样品增菌，分别取增菌液1mL，20μL免疫磁珠加入1mL样品中混匀后，37℃孵育10min，放入磁力架中静置1～2min，去除上清；加入1mL本发明实施例的免疫磁珠洗液混匀后，37℃孵育15min,放入磁力架中静置1～2min后去除上清，重复洗涤操作进行两次；最后用LAMP试剂盒或其他定量方法进行结果鉴定。

表4免疫磁珠洗液对阳性检出率的影响

从表4中所示的结果可以看出，使用配方4、5、6的洗液检出的阳性样品明显高于常规洗液，其中配方5(实施例5)的检出率最高，相对于传统生化鉴定方法，更有利于提高阳性样品的检出率。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。