阅读说明：本技术 一种改善羟脯氨酸发酵前期溶菌的方法 (Method for improving bacterial lysis in early fermentation stage of hydroxyproline ) 是由 张孟涛 徐倩 封浪 张磊鹏 刘永超 马辉 于 2019-09-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种改善羟脯氨酸发酵前期溶菌的方法,属于发酵技术领域,所述方法首先收集羟脯氨酸发酵过程中污染的噬菌体,将收集到的噬菌体对羟脯氨酸发酵液进行侵染,分离纯化侵染后长出的羟脯氨酸菌株,挑选种子进行上罐验证,筛选出优良菌株进行发酵生产。在本发明的羟脯氨酸菌株经噬菌体侵染后,种子活力明显提升,发酵过程中不易受到噬菌体的侵染,有效改善了羟脯氨酸发酵前期易产生自溶的情况。(The invention relates to a method for improving bacterial lysis in the early fermentation stage of hydroxyproline, belonging to the technical field of fermentation. After the hydroxyproline strain is infected by the bacteriophage, the activity of seeds is obviously improved, the hydroxyproline strain is not easily infected by the bacteriophage in the fermentation process, and the condition that the hydroxyproline is easy to generate autolysis in the early fermentation stage is effectively improved.)

一种改善羟脯氨酸发酵前期溶菌的方法

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，具体地，涉及一种改善羟脯氨酸发酵前期溶菌的方法。

背景技术

L-羟脯氨酸是亚氨基酸之一，广泛应用于医药、化工、食品和美容等行业。L-羟脯氨酸的生产方法主要有3种，分别为生物组织提取法、化学合成法和微生物发酵法。前两种方法具有成本高、污染严重等弊端，随着代谢工程的发展及近年来微生物法生产氨基酸所展现的优势，使得发酵法生产氨基酸成为一种最具前景的生产方法。目前，L-羟脯氨酸发酵扩大所使用的菌种为经过基因重组技术所得的大肠杆菌，试验过程中出现了种子生长正常，但移入发酵罐后70%批次培养3-6h突然出现大量溶菌、OD下降的情况，即使继续培养后重新长菌，其产酸也极低，导致发酵失败，给生产带来严重的经济损失。

发明内容

为了解决现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种改善羟脯氨酸发酵前期溶菌的方法，所述方法采用噬菌体浸染试验、筛选出能够抵抗噬菌体的菌株，从而提高种子活力，改善发酵过程中的溶菌问题。

为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

一种改善羟脯氨酸发酵前期溶菌的方法，首先收集噬菌体，将噬菌体侵染羟脯氨酸发酵液，培养至发酵液变澄清，然后继续培养后，发酵液变浑浊，选取变浑浊的发酵液进行纯化培养，挑取纯化后的菌株进行上罐验证，筛选出未出现溶菌的菌株，利用经过上罐验证的筛选菌株进行羟脯氨酸发酵生产。

作为对上述方案的进一步优化，所述收集噬菌体，是将受到噬菌体污染的发酵液接种到带菌平板上进行培养，长出噬菌斑后即获得所需要的噬菌体。

作为对上述方案的进一步优化，所述将噬菌体侵染羟脯氨酸发酵液，是将噬菌体挑取一环转接至OD5-6的羟脯氨酸摇瓶发酵液中进行培养，培养前期发酵液由浑浊变澄清，且镜检菌体产生碎片，继续培养一段时间后能够抵抗噬菌体的菌株正常生长繁殖，发酵液再次变浑浊，OD明显增加，取此时的发酵液涂布纯化菌株进行挑选。

作为对上述方案的进一步优化，所述上罐验证，是将纯化后的菌株连续培养若干批次都未出现溶菌现象，且菌体长势及产酸能力均都有所提高。

作为对上述方案的更进一步优化，所述上罐验证是将纯化后的菌株连续培养12批次。

有益效果：

发酵液经噬菌体侵染后绝大部分菌体自溶，但极少数能抵抗噬菌体的菌株存活下来并进行二次繁殖，从再次繁殖的培养液中挑取菌液进行纯化培养，这样培育出来的菌株具有较强的生命力，能抵抗外界噬菌体及杂菌对菌体的侵害，进而降低发酵溶菌的风险。采用本发明所述方法，与现有工艺相比，经侵染后复筛菌株生长速率更快，发酵更为稳定，进而增加产量，降低成本，减少废液的排放，给环境带来保护。

具体实施方式

一种改善羟脯氨酸发酵前期溶菌的方法，具体包括：

1）收集噬菌体 将出现菌体自溶的发酵液接种于培养8h的羟脯氨酸带菌平板进行培养，形成噬菌斑后冷藏待用；

2）发酵侵染 将收集到的噬菌体刮取一环，接种到OD培养至5-6的羟脯氨酸摇瓶发酵液中，培养一段时间后，发酵液变澄清，镜检菌体出现碎片，继续培养，直至发酵液变浑浊，即菌体开始再次繁殖；3）纯化培养 将再次增长的菌体发酵液平板划线获得单菌落，挑取单菌落纯化培养后进行上罐验证；

所述出现菌体自溶的发酵液是指种子液移入发酵罐后3-6h出现菌体自溶，主要表现为发酵液变澄清，比浊度OD下降，镜检菌体数目下降。所用的羟脯氨酸菌种为大肠杆菌，经噬菌体侵染后种子活力明显提升，发酵罐连续培养12批次未出现溶菌现象。

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例

1、收集噬菌体

采用大肠杆菌作为生产菌，经种子罐培养5h，OD达到9.20，镜检无杂菌，达到移种指标，按10%接种量移入30m3发酵罐，发酵全程33℃培养，4.5h后溶氧开始回升，由30%上升至100%，镜检发现溶菌现象，发酵液变澄清，OD由12.0下降至2.0，取此时的发酵液接种于培养8h的羟脯氨酸带菌平板上做平板噬菌体检测，形成噬菌斑后冷藏待用；

2、噬菌体侵染

从培养好的羟脯氨酸斜面上刮取一环，转接至50mL摇瓶液体培养基中，培养4h左右，OD达到5.0左右，从准备好的噬菌斑平板上刮取一环噬菌斑转接至OD5.0左右的摇瓶发酵液中，继续震荡培养1h左右，观察发现，发酵液变澄清，OD下降至1.5左右，镜检发现菌体碎片，视野数目由原来的80粒/视野下降至8粒/视野，说明摇瓶发酵液受到噬菌体的侵染，继续培养3-4h左右，发酵液开始明显变浑浊，OD至开始上升，镜检几乎看不到菌体碎片，且菌体数目明显增加，OD长至5.0左右时，取此时的发酵液做稀释涂布，对菌种进行纯化挑选，甘油管冷冻保藏，以待验证；

3、上罐验证

将保藏的菌种经斜面活化两代后上罐验证，经种子罐培养5h，OD达到9.20，镜检无杂菌，达到移种指标，按10%接种量移入30m³发酵罐，发酵全程33℃培养，发酵前6h生长正常（溶氧由100%下降至23%，镜检菌数由5-8粒/视野增加到＞70粒/视野，OD由2.0上升至23.0），发酵62h下罐，OD值达到200，羟脯氨酸含量达到70g/L，连续12批上罐验证，都未出现溶菌现象。

对比例

采用大肠杆菌作为生产菌，经种子罐培养5h，OD达到9.20，镜检无杂菌，达到移种指标，

按10%接种量移入30m³发酵罐，发酵全程33℃培养，发酵前4h生长正常（溶氧由100%下降至30%，镜检菌数由2-4粒/视野增加到＞45粒/视野，OD由1.8上升至12.0），4.5h后溶氧开始回升，由30%上升至100%，镜检发现溶菌现象，发酵液变澄清，OD下降至2.0，直至发酵23h，各项参数变化不明显，23h后开始重新长菌，溶氧开始下降，并稳定在30%左右，发酵62h下罐，OD值达到80，羟脯氨酸含量达到34g/L。

需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。