一种双染法检测细菌活菌的方法
阅读说明：本技术 一种双染法检测细菌活菌的方法 (Method for detecting live bacteria by double-dyeing method ) 是由 周大祥 李婧怡 于 2019-09-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种双染法检测细菌活菌的方法,包括如下步骤：细菌培养、细菌稀释、洗涤重悬、加入反应试剂避光孵育、使用流式细胞仪分析。本发明取得的有益效果为：检测快速、准确,克服了传统qPCR假阳性较高、平板培养检测周期长等缺点,使结果更加有效、可靠。(The invention discloses a method for detecting live bacteria by a double-dyeing method, which comprises the following steps: bacterial culture, bacterial dilution, washing and resuspension, adding reaction reagent and incubating in dark place, and analyzing by using a flow cytometer. The invention has the following beneficial effects: the detection is rapid and accurate, the defects of high false positive, long plate culture detection period and the like of the traditional qPCR are overcome, and the result is more effective and reliable.)
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，更具体的说是涉及一种双染法检测细菌活菌的方法。
背景技术
细菌性青枯病是由青枯菌引起的一种广泛分布于世界热带、亚热带和一些温暖地区的毁灭性病害。青枯菌的寄主范围非常广泛，目前已发现44个科的几百种植物可能被其侵染，并且不断有新的寄主被发现，给作物生产带来了很大的经济损失。
大肠杆菌是许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，主要寄生在大肠内。大肠杆菌在肠道中大量繁殖，大约占粪便干重的1/3，其可随粪便散布在周围环境中，影响周边环境的卫生；若在水中和食品中检出此菌，可认为水质或食品已被粪便污染，从而推测其可能有肠道病原菌的存在，因此，大肠杆菌常作为饮水和食物的卫生学指标。
目前，用于青枯菌和大肠杆菌检测的常用方法为PCR检测和平板培养方法。但是PCR检测技术不仅能扩增活菌的DNA，自由状态的DNA或死菌DNA也能被扩增，导致假阳性的出现；而平板培养方法则有培养周期长等缺点。
因此，提供一种快速、准确的检测细菌活菌的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种快速、准确的检测细菌活菌数的方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种双染法检测细菌活菌的方法，包括如下步骤：
(1)细菌培养：将细菌接种于液体培养基中，摇床震荡培养至对数生长期，得到菌种液；
(2)细菌稀释：将步骤(1)得到的菌种液用无菌蒸馏水重悬，1000目无菌不锈钢筛网过滤，细胞计数板计数后，无菌蒸馏水稀释菌液浓度至 5×105～1×106cfu/ml，得细菌稀释液；
细菌直径为0.5～5μl，在得到单细胞菌种稀释液前增加了1000目不锈钢筛网过滤，以除去聚集成团的细菌。
(3)洗涤重悬：取步骤(2)得到的细菌稀释液100μl于无菌流式管中，先用去离子水洗涤，再向洗涤后的细菌稀释液中加入200～400μl Annexin VFITC结合液重悬细菌，得细菌重悬液；
(4)向步骤(3)的细菌重悬液中加入5μl浓度为0.5～10μg/ml的AnnexinV FITC溶液和10μl浓度为10～50μg/ml的PI溶液，混匀后于室温避光孵育 10～20min；
(5)分析：孵育完成后，立即用流式细胞仪分析。
Annexin V FITC与PI(碘化丙锭)双染法的原理是处于死亡早期的细菌因细胞膜的磷脂对称性改变而使PS(磷脂酰丝氨酸)暴露于细胞膜外，PS可特异结合标记有异硫氰酸荧光素(FITC)的连接素V(Annexin V)，但细菌仍维持其细胞膜的完整性，使变性染色质着色的荧光染料PI不能进入细菌；然而，死亡晚期的细菌可同时受Annexin V FITC与PI标记，用FCM(流式细胞仪)可定量分析受标记的死亡的细菌数。
优选的，步骤(1)的培养条件为：培养温度25～30℃，培养时间8～12h，转速为200～300r/min。
优选的，步骤(3)中去离子水洗涤的过程具体包括：将细菌稀释液在4℃条件下3000r/min离心5min，收集沉淀，之后使用1ml去离子水重悬，4℃条件下3000r/min离心5min，收集沉淀，如此重复2次。
优选的，步骤(5)中用流式细胞仪分析的激发波长为490nm，发射波长为 533nm。
优选的，所述细菌为青枯菌或大肠杆菌。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：检测快速、准确。克服了传统qPCR假阳性较高、平板培养检测周期长等缺点，使结果更加有效、可靠。
附图说明
图1为实施例1检测结果，其中：第一象限表征机械损伤细胞，第二象限表征晚期凋亡和坏死细胞，第三象限表征活细胞，第四象限表征早期凋亡细胞；
图2为实施例4检测结果，其中：第一象限表征机械损伤细胞，第二象限表征晚期凋亡和坏死细胞，第三象限表征活细胞，第四象限表征早期凋亡细胞；
图3为实施例7检测结果，其中：第一象限表征机械损伤细胞，第二象限表征晚期凋亡和坏死细胞，第三象限表征活细胞，第四象限表征早期凋亡细胞；
图4为实施例8检测结果，其中：第一象限表征机械损伤细胞，第二象限表征晚期凋亡和坏死细胞，第三象限表征活细胞，第四象限表征早期凋亡细胞。
具体实施方式
实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中微生物原料来源：
番茄青枯菌：菌株编号ATCC BAA-1114，购于北钠生物；
大肠杆菌：菌株编号BNCC336902，购于北钠生物。
实施例1
(1)细菌培养：将无菌蒸馏水室温保存的番茄青枯菌在NA固体培养基(牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂20g，水1000ml,pH值 6.8～7.0)上划线活化后，接种于NA液体培养基(牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，水1000ml,pH值6.8～7.0)中，摇床震荡培养，培养温度28℃，培养时间10h，转速为280r/min，至对数生长期，得到青枯菌液；
(2)细菌稀释：将步骤(1)得到的青枯菌液用无菌蒸馏水重悬，1000目无菌不锈钢筛网过滤，细胞计数板计数后，无菌蒸馏水稀释菌液浓度至 1×106cfu/ml，得青枯菌稀释液；
(3)洗涤重悬：取步骤(2)得到的青枯菌稀释液100μl于无菌流式管中， 4℃条件下3000r/min离心5min后弃上清，加入去离子水1ml，之后在4℃条件下3000r/min离心5min，弃上清，如此重复两次，加入250μl Annexin V-FITC 结合液重悬细菌，得青枯菌悬浮液；
(4)向青枯菌悬浮液中加入5μl浓度为5μg/ml的AnnexinV FITC溶液和 10μl浓度为20μg/ml的PI溶液，混匀后于室温避光孵育20min；
(5)孵育完成后，立即用流式细胞仪分析，激发波长为490nm，发射波长为533nm。
检测结果如图1所示。
实施例2
(1)细菌培养：将无菌蒸馏水室温保存的番茄青枯菌在NA固体培养基(牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂20g，水1000ml,pH值 6.8～7.0)上划线活化后，接种于NA液体培养基(牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，水1000ml,pH值6.8～7.0)中，摇床震荡培养，培养温度28℃，培养时间10h，转速为280r/min，至对数生长期，得到青枯菌液；
(2)细菌稀释：将步骤(1)得到的青枯菌液用无菌蒸馏水重悬，1000目无菌不锈钢筛网过滤，细胞计数板计数后，无菌蒸馏水稀释菌液浓度至 5×105cfu/ml，得青枯菌稀释液；
(3)洗涤重悬：取步骤(2)得到的青枯菌稀释液100μl于无菌流式管中， 4℃条件下3000r/min离心5min后弃上清，加入去离子水1ml，之后在4℃条件下3000r/min离心5min，弃上清，如此重复两次，加入200μl Annexin V-FITC 结合液重悬细菌，得青枯菌悬浮液；
(4)向青枯菌悬浮液中加入5μl浓度为0.5μg/ml的Annexin V FITC溶液和10μl浓度为10μg/ml的PI溶液，混匀后于室温避光孵育15min；
(5)孵育完成后，立即用流式细胞仪分析，激发波长为490nm，发射波长为533nm。
实施例3
(1)细菌培养：将无菌蒸馏水室温保存的番茄青枯菌在NA固体培养基(牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂20g，水1000ml,pH值 6.8～7.0)上划线活化后，接种于NA液体培养基(牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，水1000ml,pH值6.8～7.0)中，摇床震荡培养，培养温度28℃，培养时间10h，转速为280r/min，至对数生长期，得到青枯菌液；
(2)细菌稀释：将步骤(1)得到的青枯菌液用无菌蒸馏水重悬，1000目无菌不锈钢筛网过滤，细胞计数板计数后，无菌蒸馏水稀释菌液浓度至 7×105cfu/ml，得青枯菌稀释液；
(3)洗涤重悬：取步骤(2)得到的青枯菌稀释液100μl于无菌流式管中， 4℃条件下3000r/min离心5min后弃上清，加入去离子水1ml，之后在4℃条件下3000r/min离心5min，弃上清，如此重复两次，加入400μl Annexin V-FITC 结合液重悬细菌，得青枯菌悬浮液；
(4)向青枯菌悬浮液中加入5μl浓度为10μg/ml的Annexin V FITC溶液和10μl浓度为50μg/ml的PI溶液，混匀后于室温避光孵育10min；
(5)孵育完成后，立即用流式细胞仪分析，激发波长为490nm，发射波长为533nm。
实施例4
(1)细菌培养：将斜面培养基保存的大肠杆菌在LB固体培养基(蛋白胨 10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，1000mL蒸馏水，pH值7.0)上划线活化后，接种于LB液体培养基(蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g， 1000mL蒸馏水，pH值7.0)中，摇床震荡培养，培养温度30℃，培养时间12h，转速为200r/min，至对数生长期，得到大肠杆菌液；
(2)细菌稀释：将步骤(1)得到的大肠杆菌液用无菌蒸馏水重悬，1000 目无菌不锈钢筛网过滤，细胞计数板计数后，无菌蒸馏水稀释菌液浓度至 1×106cfu/ml，得大肠杆菌稀释液；
(3)洗涤重悬：取步骤(2)得到的大肠杆菌稀释液100μl于无菌流式管中， 4℃条件下3000r/min离心5min后弃上清，加入去离子水1ml，之后在4℃条件下3000r/min离心5min，弃上清，如此重复两次，加入250μl Annexin V-FITC 结合液重悬细菌，得大肠杆菌悬浮液；
(4)向大肠杆菌悬浮液中加入5μl浓度为5μg/ml的Annexin V FITC溶液和10μl浓度为30μg/ml的PI溶液，混匀后于室温避光孵育15min；
(5)孵育完成后，立即用流式细胞仪分析，激发波长为490nm，发射波长为533nm。
检测结果如图2所示。
实施例5
(1)细菌培养：将斜面培养基保存的大肠杆菌在LB固体培养基(蛋白胨 10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，1000mL蒸馏水，pH值7.0)上划线活化后，接种于LB液体培养基(蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g， 1000mL蒸馏水，pH值7.0)中，摇床震荡培养，培养温度30℃，培养时间12h，转速为200r/min，至对数生长期，得到大肠杆菌液；
(2)细菌稀释：将步骤(1)得到的大肠杆菌液用无菌蒸馏水重悬，1000 目无菌不锈钢筛网过滤，细胞计数板计数后，无菌蒸馏水稀释菌液浓度至 8×105cfu/ml，得大肠杆菌稀释液；
(3)洗涤重悬：取步骤(2)得到的大肠杆菌稀释液100μl于无菌流式管中， 4℃条件下3000r/min离心5min后弃上清，加入去离子水1ml，之后在4℃条件下3000r/min离心5min，弃上清，如此重复两次，加入300μl Annexin V-FITC 结合液重悬细菌，得大肠杆菌悬浮液；
(4)向大肠杆菌悬浮液中加入5μl浓度为0.5μg/ml的Annexin V FITC溶液和10μl浓度为20μg/ml的PI溶液，混匀后于室温避光孵育10min；
(5)孵育完成后，立即用流式细胞仪分析，激发波长为490nm，发射波长为533nm。
实施例6
(1)细菌培养：将斜面培养基保存的大肠杆菌在LB固体培养基(蛋白胨 10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，1000mL蒸馏水，pH值7.0)上划线活化后，接种于LB液体培养基(蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g， 1000mL蒸馏水，pH值7.0)中，摇床震荡培养，培养温度30℃，培养时间12h，转速为200r/min，至对数生长期，得到大肠杆菌液；
(2)细菌稀释：将步骤(1)得到的大肠杆菌液用无菌蒸馏水重悬，1000 目无菌不锈钢筛网过滤，细胞计数板计数后，无菌蒸馏水稀释菌液浓度至 5×105cfu/ml，得大肠杆菌稀释液；
(3)洗涤重悬：取步骤(2)得到的大肠杆菌稀释液100μl于无菌流式管中， 4℃条件下3000r/min离心5min后弃上清，加入去离子水1ml，之后在4℃条件下3000r/min离心5min，弃上清，如此重复两次，加入400μl Annexin V-FITC 结合液重悬细菌，得大肠杆菌悬浮液；
(4)向大肠杆菌悬浮液中加入5μl浓度为10μg/ml的Annexin V FITC溶液和10μl浓度为50μg/ml的PI溶液，混匀后于室温避光孵育20min；
(5)孵育完成后，立即用流式细胞仪分析，激发波长为490nm，发射波长为533nm。
实施例7
(1)细菌培养：将无菌蒸馏水室温保存的番茄青枯菌在NA固体培养基(牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂20g，水1000ml,pH值 6.8～7.0)上划线活化后，接种于NA液体培养基(牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，水1000ml,pH值6.8～7.0)中，摇床震荡培养，培养温度28℃，培养时间10h，转速为280r/min，至对数生长期，得到青枯菌液；
(2)细菌稀释：将步骤(1)得到的青枯菌液用无菌蒸馏水重悬，1000目无菌不锈钢筛网过滤，细胞计数板计数后，无菌蒸馏水稀释菌液浓度至 1×106cfu/ml，得青枯菌稀释液；
(3)洗涤重悬：取步骤(2)得到的青枯菌稀释液100μl于无菌流式管中， 4℃条件下3000r/min离心5min后弃上清，加入去离子水1ml，之后在4℃条件下3000r/min离心5min，弃上清，如此重复两次，加入300μl Annexin V-FITC 结合液重悬细菌，得青枯菌悬浮液；
(4)向青枯菌悬浮液中加入5μl浓度为20μg/ml的Annexin V FITC溶液和 10μl浓度为100μg/ml的PI溶液，混匀后于室温避光孵育20min；
(5)孵育完成后，立即用流式细胞仪分析，激发波长为490nm，发射波长为533nm。
检测结果如图3所示。
实施例8
(1)细菌培养：将斜面培养基保存的大肠杆菌在LB固体培养基(蛋白胨 10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，1000mL蒸馏水，pH值7.0)上划线活化后，接种于LB液体培养基(蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g， 1000mL蒸馏水，pH值7.0)中，摇床震荡培养，培养温度30℃，培养时间12h，转速为200r/min，至对数生长期，得到大肠杆菌液；
(2)细菌稀释：将步骤(1)得到的大肠杆菌液用无菌蒸馏水重悬，1000 目无菌不锈钢筛网过滤，细胞计数板计数后，无菌蒸馏水稀释菌液浓度至 1×106cfu/ml，得大肠杆菌稀释液；
(3)洗涤重悬：取步骤(2)得到的大肠杆菌稀释液100μl于无菌流式管中， 4℃条件下3000r/min离心5min后弃上清，加入去离子水1ml，之后在4℃条件下3000r/min离心5min，弃上清，如此重复两次，加入250μl Annexin V-FITC 结合液重悬细菌，得大肠杆菌悬浮液；
(4)向大肠杆菌悬浮液中加入5μl浓度为30μg/ml的Annexin V FITC溶液和10μl浓度为100μg/ml的PI溶液，混匀后于室温避光孵育20min；
(5)孵育完成后，立即用流式细胞仪分析，激发波长为490nm，发射波长为533nm。
检测结果如图4所示。
对比例1
使用平板培养检测实施例1、实施例4、实施例7和实施例8步骤(2)得到的菌种稀释液。菌种稀释液涂板，28℃培养72h计数。
对比例2
使用qPCR法检测实施例1和实施例7步骤(2)得到的青枯菌种稀释液，具体检测方法如下：
青枯菌特异引物RSF(5'-GTGCCTGCCTCCAAAACGA CT-3')和RSR (5'-GACGCCACCCGCATCCCT C-3')，扩增目的片段长度为159bp。qPCR扩增在CFX96 Real-TimePCR System(BIO-RAD，USA)进行，SYBR GreenⅠ荧光染料染色。反应采用25μL的反应体系：12.5μL SYBR Premix Ex Taq TMⅡ mix，0.75μL引物对RSF/RSR(10μM)以及2μl模板(实施例1和实施例7 步骤(2)得到的菌种稀释液)，加Milli-Q水补足25μL。qPCR反应程序为： 95℃预变性1min，(95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸20s，40个循环)， qPCR扩增结束后立即进行熔解曲线分析，验证扩增的特异性。
使用qPCR法检测实施例4和实施例8步骤(2)得到的大肠杆菌种稀释液，具体检测方法如下：
大肠杆菌16S rDNA特异性引物FP2(5'-GAGCGCAACCCTTATCCTTTG-3') 和RP2(5'-TACTAGCGATTCCGACTTCATGG-3')，扩增目的片段长度为246bp。反应采用20μL的反应体系：10μL SYBR Premix Ex Taq，上、下游引物各0.8μL (10μM)，模板DNA 1μL(实施例4和实施例8步骤(2)得到的菌种稀释液), Milli-Q水补齐至20μL。qPCR反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环。qPCR扩增结束后立即进行熔解曲线分析，验证扩增的特异性。
实施例1、实施例4、实施例7、实施例8、对比例1和对比例2三种检测方法的试验结果如下：
图1为实施例1的检测结果，浓度为1×106cfu/ml的番茄青枯菌活菌比例为80.25％，即番茄青枯菌活菌浓度为0.80×106cfu/ml；对比例1平板计数法检测实施例1步骤(2)得到的青枯菌种稀释液结果为0.79×106cfu/ml；对比例2中qPCR 检测实施例1步骤(2)得到的青枯菌种稀释液结果为0.89×106cfu/ml。
图2为实施例4的检测结果，浓度为1×106cfu/ml的大肠杆菌活菌比例为79.81％，即大肠杆菌活菌浓度为0.80×106cfu/ml；对比例1平板计数法检测实施例4步骤(2)得到的大肠杆菌种稀释液结果为0.81×106cfu/ml；对比例2中qPCR 检测实施例4步骤(2)得到的大肠杆菌种稀释液结果为0.85×106cfu/ml。说明本发明检测结果与平板计数法结果一致，而qPCR法检测因假阳性原因，结果高于本发明方法。
图3为实施例7的检测结果，浓度为1×106cfu/ml的番茄青枯菌活菌比例为52.35％，即番茄青枯菌活菌浓度为0.52×106cfu/ml；对比例1平板计数法检测实施例7步骤(2)得到的青枯菌种稀释液结果为0.80×106cfu/ml；对比例2中qPCR 检测实施例7步骤(2)得到的青枯菌种稀释液结果为0.88×106cfu/ml。
图4为实施例8的检测结果，浓度为1×106cfu/ml的大肠杆菌活菌比例为55.86％，即大肠杆菌活菌浓度为0.56×106cfu/ml；对比例1平板计数法检测实施例8步骤(2)得到的大肠杆菌种稀释液结果为0.81×106cfu/ml；对比例2中qPCR 检测实施例8步骤(2)得到的大肠杆菌种稀释液结果为0.86×106cfu/ml。
实施例7和实施例8检测结果远远低于平板计数法，原因可能与Annexin V FITC和PI染料浓度超过优化的最大值，染料能够扩散进入活菌有关。如果 Annexin V FITC和PI浓度等参数低于优化最低值，流式细胞仪检测失败，仪器不能显示实验结果，可能系染料浓度过低，低于流式细胞仪检测极限有关。因此，本发明方法能够用于青枯菌活菌检测，结果有效、可靠。
对比例3
步骤(2)中不经过1000目无菌不锈钢筛网过滤，其余操作同实施例1。
实验结果：一些细菌聚集成团，流式细胞仪检测失败，仪器不能显示实验结果。
说明在检测过程中细菌容易聚集成团，影响检测结果。通过1000目无菌不锈钢筛网过滤，可以除去聚集成团的细菌，使检测结果更加准确。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。