阅读说明：本技术 一种大肠杆菌o157免疫磁珠洗液 (Escherichia coli O157 immunomagnetic bead washing liquor ) 是由 曲晓莹 蔡芷荷 卢勉飞 徐环 吴清平 巩路 陈鲁 于 2019-10-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种大肠杆菌O157免疫磁珠洗液,将表面活性剂、蛋白质、水溶性糖、无机盐、抑菌剂以特定比例混合,溶剂为缓冲液。与常规磁珠洗液相比较,除了提高了清洗效果,还特异持续增菌,提高了大肠杆菌O157的检出率。而且有效降低了食品基质的干扰,提高了免疫磁珠洗液的灵敏度,克服了常规磁珠洗液的缺陷。(The invention discloses Escherichia coli O157 immunomagnetic bead washing liquor, which is prepared by mixing a surfactant, protein, water-soluble sugar, inorganic salt and a bacteriostatic agent in a specific ratio, wherein a solvent is a buffer solution. Compared with the conventional magnetic bead washing liquid, the washing liquid improves the washing effect, also specifically and continuously increases bacteria, and improves the detection rate of Escherichia coli O157. And the interference of food substrates is effectively reduced, the sensitivity of the immunomagnetic bead washing liquid is improved, and the defects of the conventional magnetic bead washing liquid are overcome.)

一种大肠杆菌O157免疫磁珠洗液

技术领域

本发明属于免疫技术领域，特别涉及一种大肠杆菌O157免疫磁珠洗液。

背景技术

大肠杆菌O157:H7是肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)中较为显著的血清型菌株，大肠杆菌O157:H7的感染剂量极小(仅为10个菌)。感染后的病人可能会出现腹泻等症状，进一步发展为出血性结肠炎，病情发展极快，致死率高，给社会和大众健康造成严重伤害。

食源性的EHEC感染中，肉类及其制品、牛奶、水果及其制品等均可受到污染，在常规的大肠杆菌检测中，难以检测到此病原菌，为了提高检测率，不断有分子检测产品的涌现，灵敏度得到了提高，但检测结果更容易受到样品基质的影响，检测前样品前处理的重要性变得尤为突出。

众多检测技术中，免疫磁珠法效果显著。免疫磁珠法是一种具有特异性的分离富集技术，在多个领域如DNA提取、蛋白纯化、细胞筛选、食源性致病微生物富集等，都有重要的应用价值。高品质的抗体资源对免疫磁珠特异性富集至关重要，但实际应用中，不同的食品基质如肉沫会干扰富集过程，造成免疫磁珠的回收率降低从而降低富集效果。因此在免疫富集操作过程中，需要使用免疫磁珠洗液清除食品杂质。但常规免疫磁珠洗液并没有起到很好的效果。尤其是对肉沫样品进行富集，损失了大量免疫磁珠，从而降低了目标菌的检出率。而且还降低了清洗效果，增加了其他病原菌，使得清洗过程不能达到实验要求。

根据现有技术的缺陷，研制一种大肠杆菌O157免疫磁珠洗液成为亟需解决的问题。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种大肠杆菌O157免疫磁珠洗液，以降低食品基质的干扰并提高大肠杆菌O157的检出率。

为达到上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明第一个方面，提出了一种大肠杆菌O157免疫磁珠洗液。根据本发明的实施例，大肠杆菌O157免疫磁珠洗液，其溶液为缓冲液，所述缓冲液中添加有表面活性剂、蛋白质、水溶性糖、无机盐、特异性抑菌剂，其中特异性抑菌剂可以抑制样品中的非目标菌生长。根据本发明的实施例，可提高了洗液的清洗效果，并且有效降低了食品基质的干扰，而且具有特异持续性增菌的功效，尤其是目标菌含量极低的样品增菌效果显著，从而提高了大肠杆菌O157的检出率。

根据本发明的实施例，其溶液为缓冲液，所述缓冲液中添加有0.2～1.45g/L表面活性剂、0.5～0.7g/L无机盐、4.8～33.9g/L蛋白质、5.0～6.5g/L水溶性糖、0.003～1.017g/L特异性抑菌剂。

根据本发明的实施例，

所述表面活性剂选自Tween-20、TritonX-100、OHODASURF ON-870中的至少一种；

所述蛋白质选自胰蛋白胨、酪蛋白钠、乳白蛋白中的至少一种；

所述水溶性糖选自乳糖；

所述无机盐选自NaCl、KCl的至少一种；

所述特异性抑菌剂选自新生霉素钠、胆盐。

根据本发明的实施例，所述洗液的pH＝7.0～7.5，其溶液为缓冲液，所述缓冲液中添加有5.0～6.5g/L乳糖、4.8～6.8g/L胰蛋白胨、7.6～10.6g/L酪蛋白钠、7.0～10.0g/L乳白蛋白、0.5～0.7g/L NaCl、13～17mg/L新生霉素钠、0.6～1.0g/L胆盐、0.60～0.75g/LTween-20、0.20～0.35g/L TritonX-100和0.20～0.35g/L OHODASURF ON-870。发明人发现，质量比在上述范围内时，增菌和清洗效果更显著。为了进一步效果，发明人进行了进一步优化，惊喜地发现，配比效果大大增强，在上述范围内时，增菌和清洗效果更佳显著。

根据本发明的实施例，所述洗液的pH＝7.0～7.5，其溶液为缓冲液，所述缓冲液中添加有5.0g/L乳糖、4.8g/L胰蛋白胨、7.6g/L酪蛋白钠、7.0g/L乳白蛋白、0.5g/L NaCl、13mg/L新生霉素钠、0.6g/L胆盐、0.60g/L Tween-20、0.20g/L TritonX-100和0.20g/LOHODASURF ON-870。在上述配比中，增菌和清洗效果更佳显著。

根据本发明的实施例，所述洗液的pH＝7.0～7.5，其溶液为缓冲液，所述缓冲液中添加有6.5g/L乳糖、5.8g/L胰蛋白胨、8.6g/L酪蛋白钠、8.5g/L乳白蛋白、0.65g/L NaCl、15mg/L新生霉素钠、0.8g/L胆盐、0.70g/L Tween-20、0.30g/L TritonX-100和0.30g/LOHODASURF ON-870。在上述配比中，增菌和清洗效果更佳显著。

根据本发明的实施例，所述洗液的pH＝7.0～7.5，其溶液为缓冲液，所述缓冲液中添加有7.0g/L乳糖、6.8g/L胰蛋白胨、10.6g/L酪蛋白钠、10.0g/L乳白蛋白、0.70g/L NaCl、17mg/L新生霉素钠、1.0g/L胆盐、0.75g/L Tween-20、0.35g/L TritonX-100和0.35g/LOHODASURF ON-870。在上述配比中，增菌和清洗效果更佳显著。

根据本发明的实施例，所述缓冲液为PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液。在上述配比中，增菌和清洗效果更佳显著。

本发明第二方面，本发明提出了前面所述免疫磁珠洗液的制备方法，按前面任一项所述的配方称取各原料，混合即得免疫磁珠洗液。

本发明第三方面，本发明提出了前面所述免疫磁珠洗液的使用方法，包括以下步骤：将免疫磁珠与样品混匀孵育，静置磁分离，去上清；加入前面任一项所述免疫磁珠洗液孵育，静置磁分离，去上清。

根据本发明的实施例，所述免疫磁珠与样品的体积比为：20μL：1mL。

根据本发明的实施例，所述孵育条件为35～37℃孵育10～15min。

根据本发明的实施例，所述静置磁分离1～2min。

根据本发明的实施例，所述免疫磁珠洗液体积为1～2mL。

本发明第四方面，本发明提出了前面任一项所述免疫磁珠洗液作为大肠杆菌O157检测试剂中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明的大肠杆菌O157免疫磁珠洗液组分以特定比例混合，能够提高免疫清洗功效，而且特异增菌，提高了大肠杆菌O157的检出率。有效降低食品基质的干扰，提高了免疫磁珠的准确率、灵敏度，满足现代工业生产需求。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整的说明，但并不局限于此。

OHODASURF ON-870是一种表面活性剂，购于扬州施惠尔生物科技有限公司，货号SPBHS17。胰蛋白胨(货号T819615)，购自于麦克林公司。新生霉素钠盐(货号MB5425)，购自于大连美仑生物技术有限公司。胆盐(B8550)，采购于北京索莱宝科技有限公司；其他材料、试剂，如无特殊说明，均为商业途径购得。

大肠杆菌O157免疫磁珠制备方法：

1)取1mg羧基磁珠放EP管中，加入1mL超纯水中超声30s，离心去上清取沉淀，清洗，最后重悬于100μL超纯水中；

2)缓慢加入MIX&GO活化剂(货号A-SMPN100，购于Sigma)100μL，置于混匀仪上室温活化1h；

3)活化后加1mL MEST(25mM，pH6.0)缓冲液洗涤2遍，重悬于100μL MES缓冲液中；

4)缓慢加入抗大肠杆菌O157抗体(购自于Abcam，货号ab30521)50～80μg，置于混匀仪上室温偶联2h；

5)用TBST缓冲液洗涤磁珠，加入1mL封闭液(含1％BSA的PBS溶液)，置于混匀仪上封闭2h；

6)封闭完成后，用TBST缓冲液洗涤磁珠，得到本发明后续实验的大肠杆菌O157免疫磁珠。

实施例1～8

实施例1～8的大肠杆菌O157免疫磁珠洗液按照表1的配方1～8对原料称取，使用PBS缓冲液(0.1M,PH7.4)配制成相对应的溶液；混合，搅拌混匀，使得洗液的pH＝7.0～7.5，即得大肠杆菌O157免疫磁珠洗液。

常规洗液配方为含0.5g/L Tween-20的PBS(0.1M，PH7.4)溶液。

表1免疫磁珠洗液不同配方组分

对本发明实施例的免疫磁珠洗液做进一步效果检测。

免疫磁珠洗液的单因素分析

大肠杆菌O157免疫磁珠洗液组分：乳白蛋白、OHODASURF ON-870单因素水平按表2设置，其他组分使用PBS缓冲液(0.1M,pH7.4)分别配制为6.5g/L乳糖、4.8g/L胰蛋白胨、7.6g/L酪蛋白钠、0.5g/L NaCl、13mg/L新生霉素钠、0.6g/L胆盐、0.60g/L Tween-20、0.20g/L TritonX-100、0.35g/L OHODASURF ON-870，混合。

另外，将大肠杆菌O157按照以下组别设置：0.5CFU/g、1.0CFU/g、2.5CFU/g、5.0CFU/g、10.0CFU/g、15.0CFU/g、20.0CFU/g，分别对猪肉进行人工感染。

依据国标GB4789.4-2016的实验步骤，对感染后的猪肉样品增菌，分别取增菌液1mL、20μL的免疫磁珠加到1mL猪肉样品中混匀后，37℃孵育10min，放入磁力架中静置1～2min，去除上清；加入1mL本发明制备的免疫磁珠洗液混匀后，37℃孵育15min,放入磁力架中静置1～2min后去除上清取沉淀，沉淀洗涤两次。

按LAMP试剂盒(货号KJD05L，广东环凯微生物科技有限公司)说明书或者其他定量方法鉴定大肠杆菌O157的含量。

表2大肠杆菌O157免疫磁珠洗液组分的单因素实验

结果如表2所示，免疫磁珠洗液中乳白蛋白的适宜浓度为2.5～20g/L，大肠杆菌O157的检出量为2.5～10CFU/g，灵敏度极高；CFU/g OHODASURF ON-870的适宜浓度为0.1～0.4g/L，大肠杆菌O157的检出量为2.5～10CFU/g，灵敏度极高。

免疫磁珠洗液的灵敏度实验

按照0.1CFU/g、0.5CFU/g、2.5CFU/g、5CFU/g、10CFU/g、20CFU/g、62.5CFU/g七个水平对猪肉样品进行人工污染,依据国标GB4789.4-2016对样品增菌，分别取增菌液1mL，20μL免疫磁珠加入1mL样品中混匀后，37℃孵育10min，放入磁力架中静置1～2min，去除上清；加入1mL免疫磁珠洗液混匀后，37℃孵育15min,放入磁力架中静置1～2min后去除上清，重复洗涤操作进行两次。

最后用LAMP试剂盒或其他定量方法进行结果鉴定。

结果如表3所示。使用本发明制备的磁珠洗液能够显著地提高了检测大肠杆菌O157的灵敏度，其中配方4、5和6(实施例4、5和6)阳性检出率最多，效果最好。

表3大肠杆菌O157免疫磁珠洗液对检出率的影响

实际样品验证

从三个农贸市场各采集50份猪肉样品，按照国标GB4789.4-2016对样品增菌，分别取增菌液1mL，20μL免疫磁珠加入1mL样品中混匀后，37℃孵育10min，放入磁力架中静置1～2min，去除上清；加入1mL本发明实施例的免疫磁珠洗液混匀后，37℃孵育15min,放入磁力架中静置1～2min后去除上清，重复洗涤操作进行两次。

最后用LAMP试剂盒或其他定量方法进行结果鉴定。

表4免疫磁珠洗液对阳性检出率的影响

从表4中所示的结果可以看出，使用配方4、5、6的洗液检出的阳性样品明显高于常规洗液，本发明实施例4、5和6制备的免疫磁珠洗液更有利于提高阳性样品的检出率。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。