阅读说明：本技术 Ebv病毒检测试剂盒 (EBV virus detection kit ) 是由 *** 王志新 于 2019-12-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及分子生物技术和基因检测领域,具体而言,涉及一种EBV病毒检测试剂盒,所述试剂盒包括a)引物对；b)上游探针、下游探针、发夹探针；以及c)两种纳米金探针。上述引物和探针能够实现在闭管条件下对EBV进行高灵敏、高分辨、低成本检测,能够有效的避免扩增产物的交叉污染。(The invention relates to the field of molecular biotechnology and gene detection, in particular to an EBV virus detection kit, which comprises a) a primer pair; b) an upstream probe, a downstream probe, a hairpin probe; and c) two kinds of nano-gold probes. The primers and the probes can realize high-sensitivity, high-resolution and low-cost detection of EBV under a closed tube condition, and can effectively avoid cross contamination of amplification products.)

EBV病毒检测试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物技术和基因检测领域，具体而言，涉及一种EBV病毒检测试剂盒。

背景技术

Epstein-Barr virus(EBV)病毒是一种嗜淋巴细胞的双链DNA病毒,属于疱疹病毒γ亚科，从1964年发现EBV至今,被证实的EBV感染所致疾病越来越多,在正常人群中EBV的感染率>90％,且为终生携带。目前针对EBV的检测技术日趋成熟，常用的检测方法主要有培养、免疫检测、EBV DNA载量检测等，EBV感染者通常有外周血淋巴细胞升高和伴异型淋巴细胞以及转氨酶升高,但这对EBV感染诊断的帮助作用微乎其微。通过血清检测抗体能在一定程度上反映疾病的发展趋势,但不能呈现活动期病毒的具体数量。随着聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术的不断发展，荧光PCR技术逐渐广泛应用到EBV的检测中，通过EBV DNA载量检测，不仅可以评估鼻咽癌的发生风险，区分不明原因的感染，同时还可以对相关肿瘤的动态监测、预后评估也有积极意义。

发明内容

本发明通过一种可见光波长快速检测纳米金探针与模板杂交情况实现对EBV核酸的检出，为EBV检测提供一种更为简洁快速的方式。该试剂盒实施的过程对设施条件要求低、结果判读快速简单，且成本低廉。

具体的，本发明涉及一种EBV病毒检测试剂盒，其包括：

a)SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对；

b)SEQ ID NO：3所示的上游探针、SEQ ID NO：4所示的下游探针、SEQ ID NO：5所示的发夹探针；以及

c)两种纳米金探针，其各自包含SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示核酸片段。

上述引物和探针能够实现在闭管条件下对EBV进行高灵敏、高分辨、低成本检测，能够有效的避免扩增产物的交叉污染。

根据本发明的再一方面，还涉及一种组合物，其由如上所述的EBV病毒检测试剂盒混合配制得到。

附图说明

为了更清楚地说明本发明

具体实施方式

或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中有无修饰LNA纳米金探针杂交效率考察结果；

图2为本发明一个实施例中EBV核酸检测试剂的灵敏度实验结果；

图3为本发明一个实施例中EBV核酸检测试剂中干扰物质的影响的实验结果；

图4为本发明一个实施例中EBV核酸检测试剂的特异性验证结果；

图5为本发明一个实施例中EBV核酸检测试剂检测实际临床样本结果；

图6为本发明一个实施例中EBV实际临床样本的实时荧光PCR检测结果。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。

本发明涉及一种EBV(Epstein-Barr virus)病毒检测试剂盒，包括：

a)SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对；

b)SEQ ID NO：3所示的上游探针、SEQ ID NO：4所示的下游探针、SEQ ID NO：5所示的发夹探针；以及

c)两种纳米金探针，其各自包含SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示核酸片段。

本发明所提供的EBV核酸检测试剂盒对基因组BamHI基因区域序列进行检测，每例样本仅需一管检测试剂即可完成判读，无需开管等额外操作。其检测步骤主要有以下三个阶段：第一阶段为模板扩增，通过引物对、扩增酶的参与，实现对目标模板的高灵敏扩增；第二阶段为信号产生和积累，通过探针与扩增模板的特异性结合、内切酶参与、纳米金探针与信号分子杂交，实现对目标模板向信号分子的高效率转化；第三阶段为信号判读，通过可见光强度差值判读，实现对EBV的快速检测。为增加纳米金探针杂交的效率，在纳米金探针序列上增加LNA修饰以提高其杂交效率(序列中小写字母为LNA修饰碱基)。探针增加为保障通过以上三个阶段实现在闭管条件下对EBV的高灵敏、高分辨、低成本检测。

在一些实施方式中，所述纳米金探针中纳米金颗粒的平均粒径为1nm～200nm。

在一些实施方式中，所述纳米金探针中纳米金颗粒的平均粒径为5nm～80nm。

在一些实施方式中，所述纳米金探针中纳米金颗粒的平均粒径为10nm～30nm。

在一些实施方式中，SEQ ID NO：6所示核酸片段的5'端第八位为锁核酸，SEQ IDNO：7所示核酸片段的5'端第六位为锁核酸。

锁核酸(LNA)可以增加探针的融解温度，加强这些实验用物质的稳定性。在本发明中，相比无LNA修饰的纳米金探针，含有LNA修饰的纳米金探针的反应体系阴性结果的读数更小，含有LNA修饰的纳米金探针更有效的参与了杂交反应，使阴性反应结果的信号值更低，最终使结果的区分更为显著。

在一些实施方式中，SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示核酸片段独立地通过连接片段与所述纳米金颗粒连接，且所述连接片段彼此不杂交，也不与a)和b)发生杂交。

在本发明中，“杂交”评定的标准是指核酸在严格条件下不发生杂交。对本领域技术人员而言，这种“严格条件”是公知的，包括诸如在含400mM NaCl、40mM PIPES(pH6.4)和1mM EDTA的杂交液中于60℃杂交12～16小时，然后在65℃下用含0.1％SDS、和0.1％SSC的洗涤液洗涤15～60分钟。或者，两个核酸片段在如Sambrook等的分子克隆：实验手册(1989)(冷泉巷实验室出版，纽约，美国)的“大肠杆菌中克隆基因的表达”一节里所述的标准杂交条件下互相杂交。这样的条件如在45℃的6.0×SSC中杂交，然后在50℃的2×SSC中进行洗涤的步骤。为了选择严格性，可以例如在用于低严格性的50℃下的2.0×SSC和用于高严格性50℃下的2.0×SSC之间选择洗涤步骤中的盐浓度。另外，洗涤步骤中温度可在用于低严格性的约22℃的室温的用于高严格性的65℃之间变化。在一个具体的实施方式中，严格条件为在本申请的PCR反应条件。

在一些实施方式中，所述连接片段的长度为1nt～15nt；例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14nt。

在一些实施方式中，所述连接片段为Olig N，其中N是脱氧核糖核酸，选自A、T、C、G。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、DNA内切酶、dNTP、缓冲液或缓冲盐、可溶性镁盐、Tween-20以及水中的一种或多种。

如本文使用的术语“缓冲液”指水溶液或组合物，当酸或碱加入该溶液或组合物中时，所述水溶液或组合物抵抗pH中的变化。这种对pH变化的抗性是由于此类溶液的缓冲性质。因此，显示出缓冲活性的溶液或组合物被称为缓冲液或缓冲溶液。缓冲液一般不具有无限的维持溶液或组合物的pH的能力。相反，它们一般能够维持在特定范围内的pH，例如pH7–pH 9。一般地，缓冲液能够维持在其pKa上和下一个对数内的pH(参见例如，Mohan，Buffers，A guide for the preparation and use of buffers in biological systems，CALBIOCHEM，1999)。缓冲液和缓冲溶液一般由缓冲盐或优选非离子缓冲液组分如TRIS和HEPES制备。可以在本发明的方法中使用的缓冲液优选选自磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水缓冲液(PBS)、2-氨基-2羟甲基-1,3-丙二醇(TRIS)缓冲液、TRIS缓冲盐水溶液(TBS)和TRIS/EDTA(TE)。缓冲盐溶于溶剂(通常是水)中后能够得到所述缓冲液。

在一些实施方式中，所述可溶性镁盐为MgCl₂。

在一些实施方式中，所述水通常没有核酸及核酸酶，例如双蒸水或去离子水。水为蒸馏水、去离子水、反渗水。

在一些实施方式中，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4DNA聚合酶、Klenow片段中的任一种。

本发明优选采用Taq。

在一些实施方式中，所述DNA内切酶选自TaqPol、TthPol、TaqExo、AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN或MthFEN中的任一种。

本发明优选采用AfuFEN。

本发明还涉及一种组合物，其由如上所述的EBV病毒检测试剂盒混合配制得到。

在一些实施方式中，所述组合物为溶液，其中a)中的引物的浓度独立地选自0.5μM～1.5μM，b)中探针的浓度独立地选自0.5μM～1.5μM，c)中纳米金探针的浓度独立地选自0.03μM～0.2μM，所述组合物中还含有靶核酸。

在一些实施方式中，所述靶核酸通过饱和苯酚-氯仿法、硅胶吸附柱法、树脂提取法或磁珠提取法提取；在一些实施方式中，所述试剂盒中还含有靶核酸提取体系，所述靶核酸提取体系用于实现上述DNA提取方法。

在一些实施方式中，所述组合物的pH为8～9，优选为8.5。

本发明还涉及一种检测EBV病毒的方法，其包括：

a)获取如上所述的组合物；

b)进行PCR反应，观测反应体系的颜色变化以判断EBV病毒的有无。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例1

本实施例应用的EBV核酸检测试剂盒，分别采用无LNA修饰的纳米金探针及包含了LNA修饰的纳米金探针进行检测，以验证采用LNA修饰的纳米金探针杂交效率的优越性。

在本实施例中，所述的EBV核酸检测试剂盒由一对引物、上游探针、下游探针、发夹探针、一对纳米金探针、反应液和酶液构成，引物和探针序列如下所示。

上游引物：GCTAAGCCCAACACTCCACCAC(SEQ ID NO：1)；

下游引物：CCTTCTTAGGAGCTGTCCGAGGG(SEQ ID NO：2)；

上游探针：ACCCAGGCACACACTACACT(SEQ ID NO：3)；

下游探针：CGCGCCGAGGACACCCACCCGTC(SEQ ID NO：4)；

发夹探针：TTG GTC TGG TGC TAC ACT CGT CTC GGT TTT CCG AGA CGA GTC CTCGGC GCG ATC GTG ATG AAC CAT(SEQ ID NO：5)；

纳米金探针1：Au-TTTTTT-ATG GTT CaT CAC GAT(SEQ ID NO：6)；

纳米金探针2：GTA GCa CCA GAC CAA(SEQ ID NO：7)-TTTTTT-Au。

为增加纳米金探针杂交的效率，在纳米金探针序列上增加LNA修饰以提高其杂交效率，其中序列中小写字母为LNA修饰碱基。

该试剂盒反应液体积为20μL，其组分分别为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)、1μM引物(上游引物、下游引物)、1μM探针(上游探针、下游探针、发夹探针)、0.1μM纳米金探针(纳米金探针1、纳米金探针2)、0.2mM dNTP、0.5U Taq DNA聚合酶和内切酶AfuFEN，纳米金探针分别包含无LNA修饰的纳米金探针及有LNA修饰的纳米金探针。向体系中依次加入10⁵及0拷贝的待测核酸(模板序列为：5-AGC CCA ACA CTC CAC CAC ACC CAG GCA CAC ACT ACA CACACC CAC CCG TCT CAG GGT CCC CTC GGA CAG CTC CTA AGA AGG CAC CGG TCG CCC AGTCCT-3，SEQ ID NO：8)。反应体系构成为反应程序为：95℃，20s；99℃，2s，70℃，30s，35循环；63℃，10min；55℃，5min。反应结束后，结果示于图1中。图1的结果显示不论有无LNA修饰的纳米金探针，本发明试剂盒对阴性和阳性均可区分检测，但是相比无LNA修饰的纳米金探针，含有LNA修饰的纳米金探针的反应体系阴性结果的读数更小，显然含有LNA修饰的纳米金探针更有效的参与了杂交反应，使阴性反应结果的信号值更低，最终使结果的区分更为显著。

实施例2 EBV核酸检测方式优化

本实施例应用所述的EBV核酸检测试剂盒，分别检测了EBV质粒模板和阴性参考品，通过验证不同的数据处理方式以实现更好的区分检测结果，同时以更好的方式符合使用者的习惯、增强检测试剂盒的使用者体验度。

该试剂盒反应液体积为20μL，其组分分别为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)、1μM引物(上游引物、下游引物)、1μM探针(上游探针、下游探针、发夹探针)、0.05μM纳米金探针(纳米金探针1、纳米金探针2)、0.2mM dNTP、0.5U Taq DNA聚合酶和内切酶AfuFEN。向体系中依次加入10⁵及0拷贝的待测核酸(模板序列为SEQ ID NO：8所示)。反应体系构成为反应程序为：95℃，20s；99℃，2s，70℃，30s，35循环；63℃，10min；55℃，5min。反应结束后，结果示于表1中。表1的结果显示本发明试剂盒阴性和阳性检测数据差异明显，这显示能够明显区分阴阳性结果。

根据检测结果进行分析，采用两种不同的数据处理方式完成：第一种数据处理方式为Delta T＝T_610nm-T_510nm；第二种数据处理方式为Delta T’＝Delta T_max-(T_610nm-T_510nm)。容易看出，两种数据处理方式均可以很容易判读检测结果的阴阳性。通常情况下，我们习惯性的认为阳性结果的检测值应大于阴性结果检测值，第二种方式较第一种方式更符合习惯性的判读思维，从该角度出发，显然第二种数据处理方式更适合用于结果的分析和数据处理，因此本发明中采用该种数据处理方式进行结果数据分析处理。

表1 EBV核酸检测结果及数据处理

	Positive	Negative
			Delta T	0.013	0.356
Delta T'	0.343	0

实施例3 EBV核酸检测试剂的灵敏度

本实施例应用所述的EBV核酸检测试剂盒，分别检测了不同浓度的EBV质粒模板，用来验证本发明所述方法的可行性。

该试剂盒反应液体积为20μL，其组分分别为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)、1μM引物(上游引物、下游引物)、1μM探针(上游探针、下游探针、发夹探针)、0.05μM纳米金探针(纳米金探针1、纳米金探针2)、0.2mM dNTP、0.5U Taq DNA聚合酶和内切酶AfuFEN。向体系中依次加入10⁵、10⁴、10³、10²、10、1及0拷贝的待测核酸(模板序列为SEQ ID NO：8所示)。反应体系构成为反应程序为：95℃，20s；99℃，2s，70℃，30s，35循环；63℃，10min；55℃，5min。反应结束后，结果示于图2中。图2的结果显示本发明试剂盒阴性和阳性能够明显区分，且能够检测低至10拷贝/反应的质粒模板。

实施例4 EBV核酸检测试剂的抗干扰性

本实施例应用所述的EBV核酸检测试剂盒，分别检测了加入不同干扰物质(血红蛋白、白蛋白、胆固醇、乙醇)的样本，用来验证本发明所述检测方法检测实际样本时干扰物质对结果的影响。

该试剂盒反应液体积为20μL，其组分分别为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)、1μM引物(引物1序列SEQ ID NO.1、引物2序列SEQ ID NO.2)、1μM探针(探针1序列SEQ ID NO.3、探针2序列SEQ ID NO.4、探针3序列SEQ ID NO.5)、0.05μM纳米金探针(探针1序列SEQ ID NO.6、探针2序列SEQ ID NO.7)、0.2mM dNTP、0.5U Taq DNA聚合酶和内切酶A。向体系中依次加入10⁴及0拷贝的待测核酸(模板序列为SEQ ID NO：8所示)，向该体系中分别加入不同干扰物质(0.1mg/ml血红蛋白、0.01mmol/L白蛋白、0.2mmol/L胆固醇、0.1％乙醇)。反应体系构成为反应程序为：95℃，20s；99℃，2s，70℃，30s，35循环；63℃，10min；55℃，5min。反应结束后，与不加任何干扰物质的阳性和阴性参考品检测结果进行比较，结果示于图3中。图3的结果显示不同干扰物质(血红蛋白、白蛋白、胆固醇、乙醇)不会影响本发明试剂盒的检测结果。

实施例5 EBV核酸检测的特异性

本实施例应用所述的EBV核酸检测试剂盒，分别检测了不同来源的核酸样本(分别有人gDNA、HBV DNA、HPV DNA、HCV RNA)，用来验证本发明所述的方法检测实际样本时的特异性。

该试剂盒反应液体积为20μL，其组分分别为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)、1μM引物(上游引物、下游引物)、1μM探针(上游探针、下游探针、发夹探针)、0.05μM纳米金探针(纳米金探针1、纳米金探针2)、0.2mM dNTP、0.5U Taq DNA聚合酶和内切酶AfuFEN。向体系中依次加入不同来源的核酸(分别有人gDNA、HBV DNA、HPV DNA、HCV RNA)及阳性对照模板(模板序列为SEQ ID NO：8所示)。反应体系构成为反应程序为：95℃，20s；99℃，2s，70℃，30s，35循环；63℃，10min；55℃，5min。反应结束后，与EBV阳性对照进行比较，结果示于图4中。图4的结果显示不同来源的核酸(分别有人gDNA、HBV DNA、HPV DNA、HCV RNA)检测结果均为阴性，显示了本检测试剂盒良好的特异性。

实施例6 EBV核酸检测试剂检测实际临床样本

本实施例应用所述的EBV核酸检测试剂盒，分别检测了12例临床实际样本，用来评价本发明所述的检测方法检测实际样本的能力。

该试剂盒反应液体积为20μL，其组分分别为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)、1μM引物(上游引物、下游引物)、1μM探针(上游探针、下游探针、发夹探针)、0.05μM纳米金探针(纳米金探针1、纳米金探针2)、0.2mM dNTP、0.5U Taq DNA聚合酶和内切酶AfuFEN。向体系中依次加入不同临床样本及阳性对照模板(模板序列为SEQ ID NO：8所示)。反应体系构成为反应程序为：95℃，20s；99℃，2s，70℃，30s，35循环；63℃，10min；55℃，5min。反应结束后分析结果，结果示于图5中，其中S1～S12代表不同的样本，对照为阳线对照。图5的结果与实时荧光PCR检测结果(图6)一致，这显示本发明检测试剂盒能够正常的反映临床样本的检测结果。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州市宝创生物技术有限公司

<120> EBV病毒检测试剂盒

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

gctaagccca acactccacc ac 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

ccttcttagg agctgtccga ggg 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

acccaggcac acactacact 20

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 4

cgcgccgagg acacccaccc gtc 23

<210> 5

<211> 66

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<400> 5

ttggtctggt gctacactcg tctcggtttt ccgagacgag tcctcggcgc gatcgtgatg 60

aaccat 66

<210> 6

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<400> 6

atggttcatc acgat 15

<210> 7

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 7

gtagcaccag accaa 15