阅读说明：本技术 一种基于钨酸铋的均相阳极光电化学检测黄曲霉毒素的方法 (Homogeneous anode photoelectrochemical aflatoxin detection method based on bismuth tungstate ) 是由 王光丽 刘田利 孙冬雪 顾萌萌 于 2019-11-08 设计创作，主要内容包括：本发明属于分析检测领域,涉及一种基于钨酸铋的均相阳极光电化学检测黄曲霉毒素的方法。采用钨酸铋修饰的ITO电极作为光电阳极,信号分子(亚甲基蓝或硫磺素T)能够作为电子供体增大阳极光电流。在均相溶液中,结合黄曲霉毒素与适配体的识别反应所介导的滚环扩增(RCA)反应与信号分子特异性嵌入G-四链体的特性,构建了信号“增强型”检测平台。该发明对黄曲霉毒素的检测灵敏度很高,线性范围为0.01-10000pg/mL,检测限低至2.6fg/mL。与传统方法相比,本发明所提出的方法成本低,操作简便(无需标记及生物分子的电极固定),试剂用量小,实用性强,有望成为检测黄曲霉毒素的高效方法之一。(The invention belongs to the field of analysis and detection, and relates to a homogeneous anode photoelectrochemical detection method of aflatoxin based on bismuth tungstate. An ITO electrode modified by bismuth tungstate is used as a photoelectric anode, and a signal molecule (methylene blue or thioflavine T) can be used as an electron donor to increase anode photocurrent. In homogeneous solution, a signal 'enhanced' detection platform is constructed by combining the Rolling Circle Amplification (RCA) reaction mediated by the recognition reaction of the aflatoxin and the aptamer and the characteristic that signal molecules are specifically embedded into a G-quadruplex. The detection sensitivity of the kit to aflatoxin is high, the linear range is 0.01-10000pg/mL, and the detection limit is as low as 2.6 fg/mL. Compared with the traditional method, the method provided by the invention has the advantages of low cost, simple and convenient operation (no need of labeling and electrode fixation of biomolecules), small reagent dosage and strong practicability, and is expected to become one of efficient methods for detecting aflatoxin.)

一种基于钨酸铋的均相阳极光电化学检测黄曲霉毒素的方法

技术领域

本发明涉及一种分析检测技术,属于分析检测技术领域。

背景技术

描述与本发明最接近的现有技术的状况和存在的问题。

黄曲霉毒素主要由黄曲霉和寄生曲霉菌产生[Reverberi M,Ricelli A,ZjalicS,Fabbri A A,Fanelli C.Appl.Microbiol.Biotechnol.2010,87:899-911.]，是最具肝毒性、致癌和致畸的真菌毒素[Rawal S,Kim J E,Coulombe Jr R.Res.Vet.Sci.2010,89:325-331.]。国际癌症研究机构(IARC)将黄曲霉毒素归为第1组人类致癌物。在粮油食品天然污染中以黄曲霉毒素最多见，而且毒性和致癌最强，其中花生、花生油、玉米最严重，其毒性是***的10倍。食品生产商每年用于管理霉菌毒素的费用高达5至15亿美元[RobensJ,Cardwell K.Journal of Toxicology:Toxin Reviews 2003,22:139-152.]。黄曲霉毒素耐热和化学处理，在农业生产和食品加工中无处不在[Kabak B,Dobson A D,Var I IL.Crit.Rev.Food Sci.Nutr.2006,46:593-619.]，许多国家已经在食品和饲料中设定了黄曲霉毒素(黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2)的最大可耐受水平，通常为2-20ng/g。目前用于检测黄曲霉毒素的方法有高效液相色谱结合串联质谱分析法(HPLC-MS/MS)和免疫测定法，其中HPLC-MS/MS用到的仪器无法用于现场分析，免疫测定法，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)，微芯片和横向流动条均需要多次清洗步骤或复杂的制造过程。因此，开发高灵敏简便的分析方法用于食品中超低浓度的黄曲霉毒素检测具有重大意义。

光电化学(PEC)分析是基于光激发下的光活性材料与待分析物之间的直接或间接相互作用而建立起来的一种新型分析方法。凭借其低背景、高灵敏度以及价廉的仪器，近年来，PEC分析得到了快速发展并且被广泛应用到很多领域。

PEC分析的性能和光电极及溶液中存在的信号分子有很大关系。铋基化合物是由(Bi₂O₂)²⁺主体层和其他客体离子层所形成的层状结构，该层状结构有助于光生电子在层间的迁移，有效减少光生电子-空穴的复合，进而提高光生载流子的利用效率。因此，本发明采用Bi₂WO₆作为光电活性材料制备光电极，探索发现充当电子供体的信号分子可以通过与光生空穴作用显著促进其光电流信号。本发明结合目标物黄曲霉毒素适配体介导的滚环扩增(RCA)反应与信号分子特异性嵌入G-四链体的特性，构建了新型的PEC检测黄曲霉毒素的方法。该方法使用方便、快速，不需要生物分子在电极表面的固定以及生物探针的标记，灵敏度高、选择性好。

发明内容

技术问题：本发明要解决的技术问题，要达到的目标。

目前报道的针对黄曲霉毒素检测的光电化学免疫传感器或适配体传感器大多需要高成本的抗体或标记型核酸探针，具有高成本、操作步骤复杂、灵敏度低(因为表面固定的生物分子的识别效率往往会下降)等的缺陷。该发明的目的是提供一种低成本、方便、快速、灵敏度的新型阳极光电化学检测方法以实现黄曲霉毒素的检测。

我们基于信号分子对半导体材料钨酸铋的电流增大作用以及对核酸分子的嵌入作用提出了一种检测黄曲霉毒素的均相阳极光电化学方法。结合黄曲毒素与适体的识别反应所介导的滚环扩增反应与信号分子特异性嵌入G-四链体的特性，改变溶液中信号分子的浓度，进而改变光电流数值，构建了信号“增强型”检测方法。

技术方案：本发明完整的技术手段和方法。

本发明的目的可通过如下技术措施来实现：

本发明提供了一种检测黄曲霉毒素的均相阳极光电化学方法，通过如下技术措施实现：

a、Bi₂WO₆的制备：将20mL的硝酸铋溶液与20mL钨酸盐溶液混合并搅拌20分钟后，移入高压釜中，在一定温度下加热一定时间；自然冷却至室温后，用无水乙醇与蒸馏水交替洗涤产物，并在真空干燥箱中烘干过夜，得到粉末状产物；

b、Bi₂WO₆修饰ITO电极的制备：称取上述制备好的Bi₂WO₆粉末配制1mg/mL的悬浊液；在预先清洗处理过的ITO电极表面滴涂30μL的Bi₂WO₆悬浊液，40℃下烘干2小时备用；

c、生物识别及信号放大反应：在pH＝7.5的Tris-HCl缓冲中，将适配体探针与不同浓度的黄曲霉毒素溶液混合，37℃下震荡孵育1小时；加入锁式探针以及含有10mM MgCl₂的pH＝7.5的40mM Tris-HCl缓冲溶液，37℃下孵育1小时；然后，加入T4 DNA连接酶以及含有10mMMgCl₂、0.5mMATP的pH＝7.540mM Tris-HCl缓冲溶液，在22℃下孵育1小时；接下来加入phi29 DNA聚合酶以及含有10mM MgCl₂、50mM KCl、5.0mM(NH₄)₂SO₄的pH＝7.540mMTris-HCl缓冲溶液和脱氧核糖核苷三磷酸，30℃下进行2小时的扩增反应；最后将5×10^-6M的信号分子加入到上述溶液中，37℃下反应30min；

d、光电流的测定：通过电流-时间技术，将Bi₂WO₆修饰的ITO电极作为工作电极置于上述步骤c的反应液中，在相对于Ag/AgCl参比电极为0.2V的电压下，进行光电流测定。

本发明的目的还可通过如下技术措施来实现：

制备Bi₂WO₆时硝酸铋溶液与钨酸盐溶液物质的量浓度之比为2:1，采用的钨酸盐为钨酸铵或钨酸钠，高压釜中的反应温度为160-180℃，反应时间为10-16小时；生物识别及信号放大反应中采用的适配体碱基序列为5'–TGC ACG TGT TGT CTC TCT GTG TCT CGTGCTTTT TT–3'；锁式探针碱基序列为5'–AAC AGA GAG ACA CCC ACC CAC CCA CCCACACACAGAGCACG–3'；使用的信号分子为亚甲基蓝(MB)或硫磺素T(ThT)中的一种。当不存在目标物黄曲霉毒素时，适配体与锁式探针结合后可引起恒温滚环扩增，短时间内使核酸呈现指数增长，实现信号的高效放大。扩增反应最终产生出一条G碱基丰富的单链DNA，在K⁺作用下，形成的G-四链体可将溶液中游离的信号分子有效嵌入，从而产生与游离的信号分子不同的光电流信号，达到检测目的。

有益效果：本发明所带来的好处，所达到的指标。

本发明用于检测黄曲霉毒素的均相阳极光电化学生物传感器一方面不需要探针的标记，另一方面生物反应在均相溶液中进行(无需繁琐的生物分子在电极表面的固定以及电极的反复洗涤过程)，再者，利用滚环扩增放大反应获得高效的信号放大，具有成本低、操作简便、实用性强、灵敏度高等优势。

附图说明

说明各附图所表示的含义

附图说明：

图1是Bi₂WO₆修饰的ITO电极加入MB之前(a)和之后(b)的光电流。

图2A)是不同浓度的MB(a到h依次为0,0.005,0.01,0.05,0.1,0.5,1,10μmol/L)对实施实例1制备的Bi₂WO₆光电流影响；B)是相应的光电流变化与MB浓度的对数的线性关系。

图3是实施实例1所制备的Bi₂WO₆对不同浓度的黄曲霉毒素(a到h依次为0，0.01，0.1，1，10，100，1000，10000pg/mL)的响应。

图4是实施实例1的方法中得到的光电流变化与黄曲霉毒素浓度的对数的线性关系。

具体实施方式

根据权利要求所包含的内容举例说明

实施例1：

a、Bi₂WO₆的制备：称取0.3g五水硝酸铋溶于现配的20mLpH＝1的稀硝酸中，磁力搅拌直至溶解，计作溶液A；称取0.17g二水钨酸钠溶于20mL去离子水中，磁力搅拌直至溶解，计作溶液B；将溶液B逐滴加入到溶液A中，搅拌20分钟，移入50mL高压釜中，在180℃加热12小时；自然冷却至室温后，无水乙醇与蒸馏水交替洗涤并在真空干燥箱中60℃烘干过夜；

b、制备Bi₂WO₆/ITO电极：称取预先制备好的Bi₂WO₆粉末加入到去离子水中，超声得到浓度为1mg/mL悬浊液；在预先清洗处理过的ITO电极表面滴涂30μL Bi₂WO₆悬浊液，40℃下烘干2小时备用；

c、生物识别及信号放大反应：取20μL，1μM黄曲霉毒素适配体与不同浓度的黄曲霉毒素混合,加入30μLpH＝7.540mM Tris-HCl缓冲溶液，37℃下震荡孵育1小时；加入20μL 1μM锁式探针和30μL含有10mM MgCl₂的pH＝7.540mM Tris-HCl缓冲溶液，37℃下孵育1小时；然后，加入40U T4 DNA连接酶，42μL含有10mM MgCl₂、0.5mMATP的pH＝7.540mM Tris-HCl缓冲溶液，在22℃下孵育1小时；接下来，加入10U phi29 DNA聚合酶，94μL含有10mM MgCl₂、50mM KCl、5mM(NH₄)₂SO₄的pH＝7.540mM Tris-HCl缓冲溶液和6μL,10mM脱氧核糖核苷三磷酸，30℃下进行2小时扩增反应；最后，将30μL,5×10^-6M MB加入到上述溶液中，37℃下反应30分钟；

d、光电流的测定：通过CHI 800C电化学工作站电流-时间技术，将Bi₂WO₆修饰的ITO电极作为工作电极置于上述步骤c的反应液中，在相对于Ag/AgCl参比电极为0.2V的电压下，进行光电流测定。

实施例2：

a、Bi₂WO₆的制备：称取0.3g五水硝酸铋溶于现配的20mLpH＝1的稀硝酸中，磁力搅拌直至溶解，计作溶液A；称取1.49g钨酸铵溶于20mL去离子水中，磁力搅拌直至溶解，计作溶液B；将溶液B逐滴加入到溶液A中，搅拌20分钟，移入50mL高压釜中，在160℃加热16小时；自然冷却至室温后，无水乙醇与蒸馏水交替洗涤并在真空干燥箱中40℃烘干过夜；

b、制备Bi₂WO₆/ITO电极：称取预先制备好的Bi₂WO₆粉末加入到去离子水中，超声得到浓度为1mg/mL悬浊液；在预先清洗处理过的ITO电极表面滴涂30μL Bi₂WO₆悬浊液，40℃下烘干2小时备用；

c、生物识别及信号放大反应：取20μL，1μM黄曲霉毒素适配体与不同浓度的黄曲霉毒素混合,加入30μLpH＝7.540mM Tris-HCl缓冲溶液，37℃下震荡孵育1小时；加入20μL 1μM锁式探针和30μL含有10mM MgCl₂的pH＝7.540mM Tris-HCl缓冲溶液，37℃下孵育1小时；然后加入40U T4 DNA连接酶，42μL含有10mM MgCl₂、0.5mMATP的pH＝7.540mM Tris-HCl缓冲溶液，在22℃下孵育1小时；接下来，加入10Uphi29 DNA聚合酶，94μL含有10mM MgCl₂、50mM KCl、5mM(NH₄)₂SO₄的pH＝7.540.0mM Tris-HCl缓冲溶液和6μL,10mM脱氧核糖核苷三磷酸，30℃下进行2小时扩增反应；最后，将30μL,5×10^-6M ThT加入到上述溶液中，37℃下反应30分钟；

d、光电流的测定：通过CHI 800C电化学工作站电流-时间技术，将Bi₂WO₆修饰的ITO电极作为工作电极置于上述步骤c的反应液中，在相对于Ag/AgCl参比电极为0.2V的电压下，进行光电流测定。