阅读说明：本技术 辅酶q10制剂在治疗和预防大疱性表皮松解症中的用途 (Use of coenzyme Q10 preparation for treating and preventing epidermolysis bullosa ) 是由 N·R·纳莱恩 R·萨兰加拉詹 M·A·凯比施 于 2018-05-16 设计创作，主要内容包括：本发明部分地涉及在有需要的受试者中治疗大疱性表皮松解症(EB)的方法,其包括向该受试者局部施用包含治疗有效量的辅酶Q10(CoQ10)的药物组合物。(The present invention relates in part to a method of treating Epidermolysis Bullosa (EB) in a subject in need thereof, comprising topically administering to the subject a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of coenzyme Q10(CoQ 10).)

辅酶Q10制剂在治疗和预防大疱性表皮松解症中的用途

相关申请

本申请要求2017年5月17日提交的美国临时申请No.62/507,773的优先权，其全部内容通过引用整体并入本文。

背景技术

根据营养不良性大疱性表皮松解症研究协会(DebRA)的研究，每出生50,000个婴儿中就有1个受到大疱性表皮松解症(EB)的影响。在所有种族和族裔群体中以及在世界各地的男性和女性中都可以发现。EB包括一组由遗传确定的皮肤脆弱性疾病，其特征是轻度机械损伤后皮肤和粘膜起泡或撕裂。传统上，基于皮肤***和水疱的超微结构水平，有人认为遗传性EB有三大类，即单纯性EB、交界性EB和营养不良性EB(Pearson，R.W.，1988)。2007年，第三届EB诊断和分类国际共识会议在奥地利维也纳举行。根据这次会议的结果，EB现在分为4种主要类型。混合型(Kindler综合征)是第四大类型。单克隆抗体和多克隆抗体的可用性以及分子诊断技术的发展已将EB分为至少30种不同的亚型(Fine JD 2010)。

这些疾病的标志之一是由轻微的机械创伤、摩擦或热引起的水疱或伤口的形成，疾病的严重程度取决于存在的EB类型。EB患者的水疱和/或伤口愈合易延迟、易感染。所有形式的单纯性EB(EBS)都有脆弱的部位，易于破裂并在表皮内形成病变(Hanna,Silverman,Boxall,Krafchik,1983)，通常始于基底角质形成细胞的破坏。EBS通常是显性遗传的，涉及编码角蛋白5、14和网格蛋白的基因疾病。在罕见的EBS形式中，也可能存在凝集素突变和肌肉营养不良的可能性。相反，EB的连接和营养不良形式是基底膜区域内或附近结构断裂的结果。在交界性EB(JEB)中，皮肤破裂均匀地发生在真皮-表皮交界处的狭窄的电子稀疏上半部的透明层中。JEB是一种隐性遗传疾病，涉及表皮和真皮之间成分的许多基因，如层粘连蛋白332、网格蛋白和a6b4-整联蛋白。在营养不良性EB(DEB)中，破裂总是发生在致密层的水平之间，该层是表皮-表皮交界处电子密集的下半部分(真皮上层)。(Fine JD.，Schachner LA，1995年)。Kindler综合征约占EB患者的1％，涉及具有极度脆弱性的皮肤的所有层。

根据皮肤受累程度(局部性与全身性)、病变区域分布的特定性质、皮肤上存在的形态学病变的类型、皮外疾病活动的程度(如果存在)和多样性、以及遗传方式(常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传)，进一步将EB表型再分类。所有形式的EB的特征都是终生反复出现水疱和/或伤口，并持续感染。水疱可在皮肤表面的任何地方形成，包括在口腔内、眼睛的表面、呼吸道、胃肠道和/或泌尿生殖道内。除慢性水疱和伤口外，还会出现伤疤和肌肉骨骼畸形。

某些形式的EB与正常人的寿命有关。但是，几种形式的重度EB会导致严重的发病，并且由于EB的直接或间接结果而导致死亡率显著增加。许多EB患者由于伤口长期失血、营养摄入不足、铁吸收不良以及慢性炎症抑制骨髓而变得贫血。其他患者患有硒和肉碱或维生素D缺乏症，这使他们易于患骨质疏松症和/或心肌病。死亡通常发生在受严重影响的患者的前三个十年中。原因是营养不良的贫血患者反复感染。营养不良和交界形式的EB的另一个严重并发症是成年期侵袭性鳞状细胞癌的发展。大多数患者死于广泛的转移性疾病，无论诊断和治疗原发性肿瘤的时间和力度如何。气管咽喉梗阻也是少数患有各种形式的交界性EB的患者的风险。

皮肤受累(伤口)的范围从四肢的水疱到全身更广泛的伤口。根据受伤的部位和/或原因，伤口可以作为单个病变发生，也可以成簇出现。如果不及时治疗，EB患者的病灶有扩大的趋势，并且无法愈合。典型的伤口愈合(在不受EB影响的人群中)是组织性可预测事件的一系列精密的过程，涉及免疫细胞、血小板、角质形成细胞、成纤维细胞和巨噬细胞，其发挥着至关重要的作用(Demidova-Rice等,2012)。DEB有两种主要类型，一种是显性的，另一种是隐性的，都涉及VII型胶原蛋白的缺陷。EB患者皮肤中的遗传畸变会导致终生的皮肤问题，这些问题永远无法解决，并且对生活质量产生重大不利影响。

与正常的伤口愈合相反，慢性伤口(例如在EB患者中观察到的伤口)表现出持续的严重的炎症期，而没有发展到愈合期(Schober-Flores C.,2003)。由于这些伤口的长期、慢性的性质，它们易于持续感染。EB患者患有疼痛和不适，与复发性皮肤感染作斗争，生活方式选择受到严重限制，经常患有贫血、营养不良、便秘、骨质疏松症、心肌病、癌症和其他疾病。护理标准的伤口治疗不能有效治疗EB患者，因为他们的皮肤缺乏适当的结构和功能蛋白的表达，而这些结构和功能蛋白用于预防或修复环境因素(例如热量、湿度)和/或机械应力(例如摩擦、创伤)的损害，而且由于患者皮肤的遗传突变而无法治愈EB。

尚无经过证实的针对任何形式的EB的具体治疗方法，临床管理的主要依据是伤口护理、疼痛管理和避免诱发因素。目前，对遗传性EB的治疗基本上是支持性的。良好的局部治疗至关重要，主要包括无菌敷料和局部抗生素。护理标准包括在涂有凡士林的纱布或非粘性合成敷料覆盖的乳膏或药膏中使用抗生素。使用厚的管状纱布可保护易受伤害的区域避免重复损伤。这种敷料通常每天更换。当发生轻微感染时，需要间歇性使用全身性抗生素。

无论EB诊断的类型和病变的形式如何，适当和充分的伤口护理仍然是有效治疗的基石。尽管可获得用于正常愈合的皮肤中的伤口的多种伤口护理产品，但是在临床环境中，它们在EB中的用途极为有限。

因此，在本领域中仍然强烈需要针对各种形式的EB的改善的治疗选择。

发明内容

本发明至少部分基于令人惊奇的发现，即局部应用的辅酶Q10(CoQ10)可用于治疗EB患者。另外，局部施用的CoQ10可以在结构和功能上改善EB患者的皮肤完整性和皮肤伤口的愈合。不受理论的束缚，本发明报道了令人惊讶和出乎意料的发现，即CoQ10的局部施用可以促进从愈合的炎症阶段(其中EB水疱和/或伤口通常停滞)到增殖和重塑阶段的转变，从而允许消除水疱和/或伤口。本发明代表治疗EB患者的新疗法。

在本发明的一个实施方案中，局部CoQ10可以用于改变EB患者中缺失的结构和/或功能蛋白的表达，对其进行的校正可以改善皮肤的结构完整性。

本发明的另一个实施方案是在有需要的受试者中治疗大疱性表皮松解症(EB)的方法，其包括向所述受试者局部施用包含治疗有效量的CoQ10的药物组合物，其中所述受试者的治疗导致在施用有效量的CoQ10约四周的治疗持续时间后，一个或多个水疱和/或伤口的尺寸减少至少约70％。

本发明的另一个实施方案是一种在有需要的受试者中治疗与大疱性表皮松解症(EB)有关的伤口的方法，包括向所述受试者局部施用包含治疗有效量的CoQ10的药物组合物。

本发明的另一个实施方案是一种改善患有大疱性表皮松解症的受试者的皮肤的结构完整性的方法，包括将包含治疗有效量的CoQ10的药物组合物局部给予受试者的皮肤。

本发明的一个实施方案是一种在患有EB的受试者中增加皮肤水疱和/或伤口的愈合速率的方法，其包括向皮肤水疱和/或伤口局部施用包含治疗有效量的辅酶Q10(CoQ10)的药物组合物。

在另一个实施方案中，本发明是在患有大疱性表皮松解症的受试者中治疗或预防鳞状细胞癌的方法，其包括向受试者局部施用包含治疗有效量的CoQ10的药物组合物。

在以上任何实施方案中，大疱性表皮松解症是单纯性大疱性表皮松解症、交界性大疱性表皮松解症、营养不良性大疱性表皮松解症或Kindler综合征。

在任何上述实施方案中，将包含CoQ10的药物组合物施用于皮肤上的水疱和/或伤口。在以上任何实施方案中，将包含CoQ10的药物组合物施用于完整皮肤。在另一个实施方案中，局部药物组合物是选自软膏、乳膏、乳剂、洗剂和凝胶的制剂。在一个实施方案中，局部药物组合物为乳膏形式。在该实施方案的一方面，该局部药物组合物包含约1％至约5％(w/w)的CoQ10。在该实施方案的另一方面，该局部药物组合物包含约3％(w/w)的CoQ10。

在以上任何实施方案中，在使用有效量的CoQ10治疗后，本发明的CoQ10药物组合物的局部给药为患有EB的受试者提供一种或多种有益效果。在该实施方案的一些方面，一种或多种有益效果选自：减少与EB相关的疼痛；减少与EB相关的炎症；减少与EB相关的水疱和/或伤口的尺寸；减少与EB相关的水疱和/或伤口的数量；增加与EB相关的一个或多个水疱和/或伤口的愈合速率；增加患有EB的受试者的皮肤的结构完整性；减少与EB相关的皮肤感染的数量；增加与EB相关的伤口的伤口闭合；增加与EB相关的伤口的再上皮化；增加与EB相关的伤口的肉芽；减少与EB相关的水疱和/或伤口的表皮间隙距离；减少与EB相关的水疱和/或伤口愈合的时间；减少施用于受试者以治疗受试者的EB的伴随药物的量；减少与EB相关的疤痕形成；增加受试者皮肤中角质形成细胞的产生；和增加受试者皮肤中成纤维细胞的产生。

在一个实施方案中，与未治疗的水疱和/或伤口相比，施用包含治疗有效量的CoQ10的组合物减少了水疱和/或伤口的愈合时间。在另一个实施方案中，与未经治疗的水疱和/或伤口相比，施用包含治疗有效量的CoQ10的组合物改善了使用大疱性表皮松解症疾病活动性和瘢痕形成指数(Epidermolysis Bullosa Disease Activity and ScarringIndex，EBDASI)的愈合质量。在一个实施方案中，与未治疗的皮肤相比，施用包含治疗有效量的CoQ10的组合物增加了对皮肤机械损伤的抵抗力。在一实施例中，与未治疗的皮肤相比，施用包含治疗有效量的CoQ10的组合物减少了皮肤水疱和/或伤口的形成。在另一个实施方案中，将包含CoQ10的组合物施用于皮肤上的水疱和/或伤口。在另一个实施方案中，将包含CoQ10的组合物施用于完整的皮肤。

在另一方面，本发明的特征在于一种在患有大疱性表皮松解症的受试者中促进皮肤水疱和/或伤口愈合的方法，该方法包括向水疱和/或伤口局部施用包含治疗有效量的辅酶Q10(CoQ10)的组合物，从而促进受试者中皮肤水疱和/或伤口的愈合。在一个实施方案中，与未治疗的水疱和/或伤口的再上皮化速率相比，用CoQ10组合物治疗的水疱和/或伤口的再上皮化的速率增加。在一个实施例中，与未治疗的水疱和/或伤口的表皮间隙距离相比，水疱和/或伤口的表皮间隙距离减小。在一个实施方案中，与未治疗的水疱和/或伤口的表皮完整性的质量相比，用CoQ10组合物治疗的水疱和/或伤口的表皮完整性的质量得到改善。在另一个实施方案中，使用疱顶(blister roof)的组织学检查来评估表皮完整性的质量。在一个实施方案中，与未经处理的水疱和/或伤口中的一种或多种结构蛋白的表达水平相比，用CoQ10组合物处理的水疱和/或伤口中一种或多种结构蛋白的表达水平被调节。在另一个实施方案中，一种或多种结构蛋白选自角蛋白、胶原蛋白、凝集素、膜联蛋白、波形蛋白、丝质蛋白和层粘连蛋白。在另一个实施方案中，角蛋白选自角蛋白13(KRT13)、角蛋白14(KRT14)和角蛋白17(KRT17)。在另一个实施方案中，蛋白质是选自角蛋白5、角蛋白14、凝集素、层粘连蛋白332、a6b4-整联蛋白和VII型胶原的一种或多种蛋白。

在另一方面，本发明的特征在于一种治疗患有大疱性表皮松解症的受试者的方法，包括向受试者施用包含治疗有效量的CoQ10的组合物，从而治疗受试者。在一个实施方案中，该受试者被鉴定为在皮肤中一种或多种结构蛋白的表达具有改变。在另一个实施方案中，一种或多种结构蛋白选自角蛋白、胶原蛋白、凝集素、膜联蛋白、波形蛋白、丝质蛋白和层粘连蛋白。在另一个实施方案中，角蛋白选自角蛋白13(KRT13)、角蛋白14(KRT14)和角蛋白17(KRT17)。在该实施方案的另一方面，该蛋白质是选自角蛋白5、角蛋白14、凝集素、层粘连蛋白332、a6b4-整联蛋白和VII型胶原的一种或多种蛋白。在另一个实施方案中，一种或多种结构蛋白的表达导致受试者皮肤中的成纤维细胞和/或角质形成细胞增加。

在另一方面，本发明的特征在于一种在患有大疱性表皮松解症的受试者中治疗或预防鳞状细胞癌的方法，包括对该受试者局部施用包含治疗有效量的CoQ10的组合物，从而在该受试者中治疗或预防鳞状细胞癌。在一个实施方案中，将包含CoQ10的组合物施用于受试者的鳞状细胞癌细胞。在一个实施方案中，将包含CoQ10的组合物施用于受试者中包含鳞状细胞癌细胞的皮肤区域。在一个实施方案中，鳞状细胞癌是皮肤鳞状细胞癌(cSCC)。在该实施方案的一方面，本发明的组合物与另外的药剂一起施用。在该实施方案的一方面，另外的药剂是化疗剂。在该实施方案的一方面，化疗剂是顺铂、阿霉素、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、托泊替康或依托泊苷。在该实施方案的另一方面，化疗剂是5-氟尿嘧啶。在该实施方案的另一方面，所述另外的药剂是双氯芬酸、咪喹莫特或丁二醇甲酸酯。在该实施方案的另一方面，另外的药剂是在光动力疗法(PDT)中使用的药物。

在前述方面的一个实施方案中，包含CoQ10的组合物的施用调节受试者中一种或多种蛋白质的表达。在一个实施方案中，该蛋白质是应激蛋白质或结构蛋白质。在另一个进一步的实施方案中，该蛋白选自转醛缩酶1、NM23蛋白、热休克27kDa蛋白1、角蛋白1、角蛋白14、角蛋白13、蛋白酶体β7、蛋白酶体激活剂亚基3和rho GDP离解抑制剂α。在另一个实施方案中，该蛋白质选自：V-akt鼠胸腺瘤病毒致癌基因同源物1(AKTl)、与BCL2相关的致癌基因4(BAG4)、与BCL2相关的X蛋白(BAX)、BCL2样1(BCL2L1)、BCL2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白3(BNTP3)、胱天蛋白酶募集结构域家族的成员6(CARD6)、胱天蛋白酶6、凋亡相关半胱氨酸肽酶(CASP6)、胱天蛋白酶7、凋亡相关半胱氨酸肽酶(CASP7)、生长停滞和DNA损伤诱导型、α(GADD45A)、肿瘤蛋白p53(TP53)和肿瘤蛋白p73(TP73)。

在以上方面或实施方案中任一项的一个实施方案中，包含CoQ10的组合物包含1％至5％的辅酶Q10。在一个实施方案中，包含CoQ10的组合物包含约1％、约2％、约3％、约4％或约5％的辅酶Q10。在一个实施方案中，包含CoQ10的组合物包含约3％的辅酶Q10。在以上方面或实施方案中任一项的一个实施方案中，将包含CoQ10的组合物与包含另外的药剂的第二组合物一起施用。在以上方面或实施方案中任一项的一个实施方案中，包含CoQ10的组合物还包含另外的药剂。在以上方面或实施方案中任一项的一个实施方案中，包含CoQ10的组合物不包含任何其他药剂，即辅酶Q10是唯一的活性剂。

附图说明

图1是显示增加辅酶Q10暴露的浓度对癌症和正常细胞的细胞增殖的影响的图。

图2A和图2B显示了异柠檬酸脱氢酶(IDH-1)在用浓度增加的辅酶Q10(50μM或100μM)处理的SK-MEL-28黑素瘤细胞中的表达。图2A显示了IDH-1的蛋白质印迹和β-肌动蛋白加载对照的结果。图2B是显示IDH-1表达的变化作为对照的百分比的图。如图2B所示，用辅酶Q10处理SK-MEL-28细胞与IDH-1表达的浓度依赖性增加有关。

图3A和图3B显示了辅酶Q10处理(50μM或100μM)在SK-MEL-28黑色素瘤细胞中表达ATP柠檬酸裂合酶(ACL)上的效果。以人主动脉平滑肌细胞(HASMC)为对照。图3A显示了ACL和β-肌动蛋白加载对照的蛋白质印迹结果。图3B是显示ACL表达的变化相对于对照的百分比的图。如图3A和图3B所示，用辅酶Q10处理SK-MEL-28细胞与ACL表达的浓度依赖性降低有关。

图4A和图4B显示了辅酶Q10对SK-MEL-28黑素瘤细胞中p53、p14ARF和MDM2表达的影响。图4A显示了p53、P14ARF和MDM2的蛋白质印迹结果以及β-肌动蛋白加载对照的结果。图4B是显示p53、P14ARF和MDM2表达的变化作为对照百分比的图。

图5是蛋白质印迹，其显示响应辅酶Q10暴露(50μM或100μM)12或24小时的SK-MEL-28细胞中Bcl-2、Bax和Caspase 3的表达变化。Bcl-2、Bax和Caspase 3是调节细胞死亡途径的促凋亡和抗凋亡标志物。使用β-肌动蛋白加载对照。暴露于辅酶Q10后观察到抗凋亡bcl-2蛋白的浓度依赖性降低，并且暴露于辅酶Q10后观察到促凋亡bax表达的浓度依赖性增加。

图6是示出皮肤基底膜区(BMZ)的结构的示意图。

图7是显示EB患者受影响的皮肤层的示意图。

图8A显示了在施用CoQ10乳膏之前的第1周第1天，左下前腿上的目标病变(测量值为15.17cm)的照片。图8B显示了在第1周第3天相同目标病变(测量值为11.2cm)的照片。除了病变尺寸减小外，水疱内的液体也明显减少。图8C显示了在第2周第1天的目标病变(测量值为9.1厘米)。这些照片中的患者具有交界性EB，非Herlitz亚型。

图9A显示了在施用CoQ10乳膏之前的第1周第1天，患者左前大腿内侧的目标病变(测量值为5.28cm)的照片，该患者在施用CoQ10乳膏之前一个月发展。图9B显示了在第2周第1天的目标病变(测量值为0.28厘米)，显示了出现肉芽的情况下水疱明显减少和三个小侵蚀。图9C示出了在第8周第1天的目标病变(测量值为0.25cm)，几乎完全重新上皮化。这些照片中的患者具有单纯性EB，Dowling-Meara亚型。

图10A显示了在施用CoQ10乳膏之前的第1周第1天，在小腿内侧上的目标病变(测量值为36.96cm)的照片，该病变带有主水疱并有一些颗粒。图10B显示了在第2周第1天的目标病变(测量4厘米)，起泡减少，颗粒形成增加，并有干燥斑块。图10C显示了在第8周第1天仅出现疤痕的目标病变(测量0厘米)。这些照片中的患者具有交界性EB，非Herlitz亚型。

图11A显示了在施用CoQ10乳膏之前的第1周第1天，右上腹部的目标病变(测量21.76cm)的照片，显示出明显的渗出液和边界附近有颗粒的血液。图11B显示了在第2周第1天的目标病变(测量值15.19cm)，边界周围的肉芽明显增加。这些照片中的患者患有隐性营养不良性EB。

图12A示出了在施用CoQ10乳膏之前的第1周第1天，在右下前腿上具有数个颗粒状糜烂的目标病变(测量值为20.75cm)的照片。图12B示出了在第1周第3天的目标病变(测量值为14.4cm)，其中侵蚀的数量减少并且显著重新上皮化。图12C显示了在第8周第1天的目标病变，糜烂的数量进一步减少，再上皮化的细胞增多。这些照片中的患者患有交界性EB。

图13A-D显示了用吸引水疱CELLUTOME系统在受伤后48小时拍摄的皮肤镜图像。在未经治疗的伤口(13A，13C)中观察到弥漫性红斑，而在经过治疗的伤口(13B，13D)中出现小的或没有发红区域。

图14A显示了在第1周拍摄的RCM图像，图14B显示了在第8周拍摄的RCM图像。弥漫性炎症细胞和胶原束紊乱(图14A)在第1周出现，而在第8周则看不到炎性细胞、有组织的胶原束和各种角质形成细胞(图14B)。

图15A显示了在第1周拍摄的RCM图像，图15B显示了在第8周拍摄的RCM图像。第8周颗粒组织被大的角质细胞覆盖(图15B)，而在第1周就看到了一些带有颗粒组织的区域的炎性细胞(图15A)。

图16A显示了在第1周拍摄的RCM图像，图16B显示了在第8周拍摄的RCM图像。第8周出现较厚的胶原蛋白束(图16B)，而在第1周出现较薄的胶原蛋白束(图16A)。

具体实施方式

目前，尚无经过证实的针对任何形式的EB的具体治疗方法。所有类型的EB的特征都是皮肤持续起泡和伤口，需要积极处理，包括使用具有修复和治愈伤口能力的治疗方法。EB伤口为慢性伤口，难以愈合，无法通过与伤口愈合相关的典型阶段发展(Pope等，2013)。典型的伤口经历了四个愈合阶段：1)止血，2)炎症，3)增殖和4)重塑(Guo等，2010)。在EB中，炎症阶段通常会延长，而不会继续进行下一阶段的愈合。增生期可能由于感染、营养不良和组织氧合作用状态降低以及通常用于对症治疗的药物如皮质类固醇引起的代谢活性降低而受损(Marinkovich等，2014)。EB的重塑也可能受损，从而导致异常的伤口收缩，从而导致严重的瘢痕形成。在主要细胞类型(如角质形成细胞、成纤维细胞和与伤口闭合和愈合相关的内皮细胞)中靶向线粒体功能已被认为是实现改善伤口愈合的重要机制。线粒体代谢为伤口修复提供能量，通过产生活性氧来调节角质形成细胞的分化，并影响伤口愈合过程中关键基因的表达(Feichtinger等，2014)。

本发明基于局部应用辅酶Q10可用于治疗EB患者的令人惊讶的发现。在一个实施方案中，局部施用辅酶Q10可用于治疗EB患者的皮肤水疱和/或伤口。EB患者的特征是皮肤结构和功能蛋白的表达和/或活性存在缺陷和/或不足。特别地，在某些实施方案中，本发明提供了治疗特定的EB受试者群体的方法，该EB受试者的皮肤中一种或多种结构蛋白的表达发生改变，例如角蛋白、胶原蛋白、凝集素、膜联蛋白、波形蛋白、纤维蛋白、整联蛋白和层粘连蛋白。由于患有EB的受试者的皮肤在这些结构蛋白的表达和/或活性方面受到损害，因此伤口(例如皮肤水疱)的愈合过程在患有EB的受试者中是独特的。除了对各个器官的上皮组织造成破坏性损伤外，EB患者还遭受其他并发症，包括发育迟缓、贫血、肌肉营养不良和手足畸形。但是，成人EB发病率和死亡率的原因与恶性肿瘤的发生有关，其中皮肤鳞状细胞癌(cSCC)最显著。本发明还报告了令人惊讶的发现，即局部应用的辅酶Q10(CoQ10)可用于治疗和/或预防EB患者的cSCC。

包含本发明的辅酶Q10的药物组合物的局部施用已证明可增加成纤维细胞和角质形成细胞中几种结构蛋白如胶原蛋白、网格蛋白、层粘连蛋白、波形蛋白、膜联蛋白、KRT13、KRT14和KRT17的表达。同样，CoQ10的局部施用已显示出可阻断炎症细胞因子(IL6)的上调并减少SCC细胞的增殖。

1.定义

除非另有说明，否则本文中使用的所有术语具有以下给出的含义，并且通常与对本发明领域技术人员来说这些术语所具有的相同含义是一致的。从业者特别针对Sambrook等(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第二版),Cold Spring HarborPress,Plainview,N.Y.以及Ausubel F M等(1993)Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.，以了解本领域的定义和术语。应当理解，本发明不限于所描述的特定方法、方案和药剂，因为其可以变化。

本文中，冠词“一”和“一个”指的是本文的语法对象的一个或多个(即至少一个)。

术语“包括”在本文中用来表示短语“包括但不限于”并且与它们互换使用。

除非上下文另外明确指出，否则术语“或”在本文中用于表示术语“和/或”并与其互换使用。

如本文所用，术语“受试者”可以指人类或非人类动物，优选哺乳动物。在优选的实施方案中，受试者是人类。

如本文所用，术语“药剂”或“另外的药剂”是指可用于治疗大疱性表皮松解症和/或与EB相关的病症或症状，例如疼痛、炎症、失血、伤口愈合等等。“药剂”或“另外的药剂”可以进一步包括与EB相关的疾病和病症的治疗，例如鳞状细胞癌(SCC)、贫血等。

如本文所用，术语“治疗”、“处理”等在本文中通常用来表示与EB相关或由EB引起的任何症状的改善。如本文所用，“治疗”可以指受试者在施用CoQ10组合物后经历以下一种或多种：与EB相关的疼痛减轻、与EB相关的炎症减轻、水疱和/或伤口形成的减少、水疱和/或伤口的愈合速度增加、伤口闭合的速度增加、皮肤完整性增加(即，由于机械或环境压力导致的撕裂或起泡的可能性降低)、慢性水疱和/伤口的数量减少、控制EB症状所需的伴随药物数量减少、以及被感染的水疱和/或伤口数量减少等。这些症状中任何一种的改善可以根据本领域已知的标准方法和技术容易地评估。通过该疾病的方法治疗的受试者人群包括患有任何形式的EB的受试者。由于EB是遗传病，因此“治疗”不包括治疗性措施。

如本文所用，术语“预防”在本文中用于指全部或部分预防或减慢疾病或病症的发作或发展。如本文所用，预防是指完成以下一项或多项：(a)降低或减慢疾病或病症严重程度的进展速度；(b)与一般EB患者亚群发作的平均时间相比，预防或延迟疾病或病症的发展。

如本文所用，术语“治疗持续时间”在本文中是指受试者向特定的水疱、口和/或完整的皮肤施用CoQ10组合物的时间量。治疗持续时间应与水疱和/或伤口愈合和消退所需的时间一样长。通常，治疗持续时间将持续约1周至约12周，但对于特定的水疱和/或伤口，治疗时间可能会更长。由于EB是无法治愈的遗传病，并且患有EB的受试者可能随时出现新的水疱和/或伤口，如果采用标准的护理方式进行治疗，任何一种都可能是慢性的。可以预见，受试者可能有多个水疱和/或伤口，需要在任何给定时间施用本发明的CoQ10组合物，并且对于每个受影响的区域，治疗的开始日期和治疗的结束日期可能并不相同。此外，出于预防目的，施用本发明的CoQ10组合物可能没有严格的终点，但将由监督受试者治疗的医师确定。

如本文所用，相对于本发明的CoQ10组合物，术语“治疗有效量”是指足以诱导所需的生物学、药物或治疗结果的量。该结果可以是减轻疾病或病症的体征或症状，或生物系统的任何其他所需的改变。在本发明的一个实施方案中，结果将涉及促进和/或改善水疱和/或伤口的愈合，包括增加伤口闭合的百分比、缩短愈合时间、改善愈合质量、减少表皮间隙距离和/或皮肤完整性的改善。

如本文所用，术语“皮肤起泡”、“皮肤起疱”或“起泡”是指在皮肤的上层(表皮层和真皮层)中的特定类型的伤口。在EB中，对皮肤施加轻微的外伤、摩擦或加热可能会形成一个或多个皮肤水疱。

如本文所用，术语“伤口”是指由切割、打击或其他冲击引起的对活体组织的伤害，通常是皮肤被切割或破碎的伤害。同义词包括皮肤的“病变”、“撕裂”、“粉刺”和/或“劈开”。

根据EB的类型，可能会由于以下原因而形成皮肤水疱和/或伤口：(1)表皮基底层内的皮肤***，(2)基底膜区(表皮和真皮之间的关键界面)的透明层水平发生的皮肤和粘膜***，和/或(3)真皮内层的锚固原纤维水平下的层板下方的***。任何水疱和/或伤口可能是急性或慢性的。

如本文所用，术语“完整皮肤”是指其中没有水疱和/或伤口的皮肤。在某些实施方案中，完整的皮肤是指在表皮的基底层内没有皮肤***的皮肤，或者在基底膜区的透明层水平没有***的皮肤，或者在致密层下没有***的皮肤。

如本文所用，术语“结构蛋白”是指维持皮肤的上皮完整性的蛋白。在某些实施方案中，结构蛋白可以是角蛋白、胶原蛋白、凝集素、膜联蛋白、波形蛋白、纤维蛋白、整联蛋白和层粘连蛋白。在一个实施方案中，本发明的结构蛋白是一种蛋白质，其缺陷或缺乏与大疱表皮松解有关或由其引起。

如本文所用，术语“功能性蛋白质”是指具有对于维持或重建(例如，治愈)皮肤完整性必不可少的活性的蛋白质。在某些实施方案中，功能蛋白可以是角蛋白、胶原蛋白、凝集素、膜联蛋白、波形蛋白、丝质蛋白、整联蛋白和层粘连蛋白。在一个实施方案中，本发明的功能性蛋白质是一种蛋白质，大疱性表皮松解症与其缺陷或缺乏有关或由其引起。

如本文所用，术语“表达”是指从DNA产生多肽的过程。该过程涉及将基因转录成mRNA并将该mRNA翻译成多肽。取决于使用的上下文，“表达”可以指RNA、蛋白质或两者的产生。

术语“基因表达的水平”或“基因表达水平”是指mRNA的水平，以及前体mRNA新生转录本、转录本加工中间体、成熟的mRNA和降解产物、或细胞中基因编码的蛋白质水平。

如本文所用，术语“调节”是指反应的上调(即，激活或刺激)或下调(即，抑制或抑制)，或两者组合或单独。“调节剂”是调节的化合物或分子，并且可以是例如激动剂、拮抗剂、活化剂、刺激剂、抑制剂或抑制物。

如本文所用，术语“改变”是指增加或减少。在某些实施方案中，改变是指蛋白质表达的增加或减少。在其他实施方案中，改变是指基因表达的增加或减少。

现在将详细参考本发明的优选实施例。尽管将结合优选实施例对本发明进行描述，但是应当理解，并不旨在将本发明限制于那些优选实施例。相反，其意图是覆盖可以包括在由所附权利要求书限定的本发明的精神和范围内的替代、修改和等同物。

2.药物组合物和药物施用

A.辅酶Q10

在整个说明书中，术语“辅酶Q”和“CoQ10”可互换使用。CoQ10具有以下结构：

其中x为10。CoQ10包括完全氧化的形式(也称为泛醌或泛癸利酮)、部分氧化的形式(也称为半醌或泛半醌)或完全还原的形式(也称为泛醌)；或其任何混合物或组合。在某些实施方案中，用于本发明方法中的CoQ10化合物是泛癸利酮。

CoQ10是本领域公认的，并在国际公开号WO 2005/069916(申请号PCT/US2005/001581)、WO 2008/116135(申请号PCT/US08/57786)、WO2010/132507(申请号PCT/US2010/034453)、WO 2011/112900(申请号PCT/US2011/028042)，以及WO2012/174559(申请号PCT/US2012/043001)中进行了进一步描述，其全部内容通过引用明确地并入本文。CoQ10是真核细胞的线粒体电子传递系统中存在的一系列聚异戊二烯基2,3-二甲氧基-5-甲基苯醌(泛醌)之一。人细胞专有性地产生CoQ10，并在所有人细胞的细胞和线粒体膜中发现，其在具有高能量需求的器官(例如肝脏和心脏)中含量最高。

B.组合物

在一个优选的实施方案中，施用途径是局部的。在一个相关的实施方案中，该组合物是选自用于局部给药的软膏、乳膏、乳剂、洗剂和凝胶的制剂。在该实施方案的一方面，包含CoQ10的药物组合物是局部乳膏。

可以将包含辅酶Q10的组合物施用于水疱和/或伤口部位、包含部分或全部水疱和/或伤口的皮肤区域、完整的皮肤或整个皮肤表面、包括水疱和/或伤口部位和完整的皮肤，例如直接围绕水疱和/或伤口的完整皮肤。在某些示例性实施方案中，将包含CoQ10的组合物施用于皮肤上的水疱和/或伤口。在其他示例性实施方案中，将包含CoQ10的组合物施用于完整皮肤。在某些实施方案中，在水疱和/或伤口的每次常规敷料更换之后施用CoQ10组合物。

优选提供活性成分，即CoQ10，作为药物制剂。对于局部给药，活性成分可以占最终产品中制剂重量的约0.001％至约20％w/w，尽管它可以占多达30％w/w，优选为制剂的约1％至约20％w/w。本发明的局部制剂包含活性成分以及一种或多种可接受的载体以及任选的任何其他治疗成分。在与制剂的其他成分相容并且对其接受者无害的意义上，载体应该是“可接受的”。

在治疗中表现出感兴趣的疾病的受试者，例如患有大疱性表皮松解症的受试者，治疗有效量的一种或多种这些药物例如这些被施用。治疗有效剂量是指导致受试者症状改善或生存期延长的化合物的量。

根据本发明的乳膏是用于外部施用的活性成分的半固体制剂。它们可以通过具有油性或非油性的基质上，在合适的机械的辅助下，将精细粉碎的或粉末形式的活性成分单独或以溶液或悬浮液的形式混悬在水性或非水性流体中来制备。基质可以包含烃，例如硬、软或液体石蜡、甘油、蜂蜡、金属皂；黏液天然来源的油，例如杏仁、玉米、花生、蓖麻或橄榄油；羊毛脂或其衍生物，或脂肪酸(如硬脂酸或油酸)和醇(如丙二醇或大凝胶)。该制剂可以掺入任何合适的表面活性剂，例如阴离子、阳离子或非离子表面活性剂，例如脱水山梨醇酯或其聚氧乙烯衍生物。也可以包括诸如天然树胶、纤维素衍生物的悬浮剂或诸如硅质二氧化硅的无机材料，以及诸如羊毛脂的其他成分。

在本发明的某些实施方案中，提供了通过向对象局部施用有效量的辅酶Q10在有需要的受试者中用于治疗大疱性表皮松解症的方法。在该实施方案的一方面，向受试者施用的局部剂量的辅酶Q10至目标皮肤组织，例如皮肤起泡、伤口或完整的皮肤，每平方厘米皮肤约0.01毫克至约0.5毫克的辅酶Q10。在一个实施方案中，将辅酶Q10施加至靶组织，例如皮肤起泡、伤口或完整的皮肤，每平方厘米皮肤约0.09至约0.15mg CoQ10。在各种实施方案中，将辅酶Q10施用至靶组织，例如皮肤起泡、伤口或完整皮肤，范围为每平方厘米皮肤约0.001至约5.0mg、约0.005至约1.0mg、约0.005至约0.5mg、约0.01至约0.5mg、约0.025至约0.5mg、约0.05至约0.4mg、约0.05至约0.30mg、约0.10至约0.25mg或约0.10至0.20mg的CoQ10。在其他实施方案中，将辅酶Q10施加至靶组织，例如皮肤水疱、伤口或完整皮肤，剂量约为每平方厘米皮肤0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.30、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.40、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49或0.5mg CoQ10。在一个实施方案中，将辅酶Q10以每平方厘米皮肤约0.12mg CoQ10的剂量施用于靶组织。应当理解，具有这些值中的任何一个作为上限或下限的范围也意在成为本发明的一部分，例如每平方厘米皮肤约0.03至约0.12、约0.05至约0.15、约0.1至约0.20或约0.32至约0.49mg CoQ10。

在本发明的另一个实施方案中，辅酶Q10以辅酶Q10乳膏的形式给药，其中辅酶Q10乳膏包含约0.1％至25％之间的辅酶Q10。在其他实施方案中，CoQ10乳膏包含约0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％、15.5％、16％、16.5％、17％、17.5％、18％、18.5％、19％、19.5％、20％、20.5％、21％、21.5％、22％、22.5％、23％、23.5％、24％、24.5％或25％的辅酶Q10。在本发明的另一个实施方案中，辅酶Q10以辅酶Q10乳膏的形式给药，其中辅酶Q10乳膏包含约1％至5％之间的辅酶Q10。在一个实施方案中，辅酶Q10乳膏包含约3％的辅酶Q10。在其他实施方案中，辅酶Q10乳膏包含约1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％的辅酶Q10。在以上实施方案的各个方面中，以每平方厘米的皮肤约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10mg的CoQ10乳膏。应当理解，具有这些值中的任何一个作为上限或下限的范围也意在成为本发明的一部分，例如每平方厘米的皮肤约0.5至约5.0、约1.5至2.5或约2.5至5.5mg的CoQ10乳膏。

本发明的某些方面提供了一种通过在需要治疗的受试者中局部施用辅酶Q10以进行治疗的方法来治疗有需要的对象中的大疱性表皮松解症，其中所述辅酶Q10每24小时局部施用一次或多次，治疗持续时间为六周或更长时间。在本发明的某些方面，CoQ10乳膏每24小时施用两次，治疗持续时间为约一至约十二周。在本发明的某些方面，CoQ10乳膏每24小时施用一次，治疗时间为约一至约十二周。在本发明的某些方面，CoQ10乳膏每48小时施用一次，治疗持续时间为约一至约十二周。在本发明的某些方面，每周两次给予CoQ10乳膏，治疗时间为约一至约十二周。本发明的一个实施方案是一种在有需要的受试者中治疗大疱性表皮松解症(EB)的方法，其包括向所述受试者局部施用包含治疗有效量的CoQ10的药物组合物，其中所述受试者的治疗导致在服用有效量的辅酶Q10约四周后，一个或多个水疱和/或伤口的尺寸至少减少了约70％。本发明的一个实施方案是一种在有需要的受试者中治疗大疱性表皮松解症(EB)的方法，该方法包括局部施用包含治疗有效量的CoQ10至受试者，其中受试者的治疗导致在施用治疗有效量的CoQ10持续约四到八周的治疗持续时间之后，一个或多个水疱和/或伤口的尺寸减少了至少约20％至80％。在以上实施例的一方面，持续下列任何治疗持续时间，水疱和/或伤口尺寸的减少为约20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、31％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％。

在本发明的任何前述方面中，治疗的持续时间通常可以为两至十二周，或者直到起泡和/或伤口愈合。在本发明的一方面，治疗持续时间为约一周。在本发明的另一方面，治疗持续时间为约两周。在本发明的另一方面，治疗持续时间为约三周。在本发明的另一方面，治疗持续时间为约四周。在本发明的另一方面，治疗持续时间为约五周。在本发明的另一方面，治疗持续时间为约六周。在本发明的另一方面，治疗持续时间为约七周。在本发明的另一方面，治疗持续时间为约八周。在本发明的另一方面，治疗持续时间为约九周。在本发明的另一方面，治疗持续时间为约十周。在本发明的另一方面，治疗持续时间为约十一周。在本发明的另一方面，治疗持续时间为约十二周。在本发明的另一方面，治疗持续时间是直到目标病变被充分治愈。在本发明的另一方面，治疗持续时间是慢性的(没有严格的终点)，因为患有EB的受试者患有习惯性水疱和/或伤口，需要用包含本发明的CoQ10的药物组合物进行治疗。

在本发明的优选实施方案中，将包含CoQ10的组合物施用于皮肤上的水疱。在本发明的其他实施方案中，将包含CoQ10的组合物施用于完整的皮肤。在本发明的一方面，药物组合物是国际公开号WO2008/116135中描述的CoQ10 3％乳膏，其全部内容通过引用整体并入本文。

C.联合疗法

在某些实施方案中，CoQ10和/或其药物组合物可以与至少一种其他治疗剂联合治疗。CoQ10和/或其药物组合物和其他治疗剂可以相加或更优选地起协同作用。在一个实施方案中，辅酶Q10和/或其药物组合物与另一种治疗剂的施用同时施用。在另一个实施方案中，在施用另一种治疗剂之前或之后施用化合物和/或其药物组合物。

在一个实施方案中，用于本发明的治疗方法的另一种药剂是可以控制疼痛和瘙痒并解决并发症例如大疱性表皮松解症的感染的药剂。某些示例性的另外的药剂包括血管扩张药、血管收缩药、高血压药、抗菌药、抗生素、抗氧化剂、抗真菌药、非甾体抗炎药、甾体药和***。

在另一个实施方案中，用于本发明的联合疗法的另外的药剂是生物药剂。生物制剂是生物系统(例如生物体、细胞或重组系统)的产物。此类生物药剂的实例包括核酸分子(例如反义核酸分子)、干扰素、白介素、集落刺激因子、抗体(例如单克隆抗体)、抗血管生成剂和细胞因子。示例性生物制剂在下面更详细地讨论，并且通常属于多种类别，包括例如：激素、激素类似物和激素复合物，例如***和***类似物、孕酮、孕酮类似物和孕激素、雄激素、肾上腺皮质类固醇、抗***、抗雄激素、抗***、肾上腺类固醇抑制剂和抗叶黄素激素；以及酶、蛋白质、肽、多克隆和/或单克隆抗体、例如白介素、干扰素、集落刺激因子等。

应该注意的是，多于一种另外的药剂，例如1、2、3、4、5种，可以与CoQ10组合使用。例如，在一个实施方案中，可以将两种另外的药剂与辅酶Q10组合施用。在另一个实施方案中，可以施用化学治疗剂、生物剂和辅酶Q10。

可以使用各种形式的生物制剂。这些包括但不限于诸如形式上(proform)的分子、不带电荷的分子、分子复合物、盐、醚、酯、酰胺等的形式，其在施用于靶位点时被生物活化。

3.治疗方法

本发明基于令人惊讶的发现，即一种或多种结构和/或功能性蛋白质，例如但不限于角蛋白、胶原蛋白、凝集素、膜联蛋白、波形蛋白、纤维蛋白、整联蛋白和层粘连蛋白，在EB受试者的皮肤中有缺陷。因此，在某些实施方案中，本发明旨在通过增加在EB受试者的皮肤中有缺陷的一种或多种结构或功能蛋白的表达和/或活性来治疗EB受试者的水疱和/或伤口。

A.大疱性表皮松解症

大疱性表皮松解症(EB，Epidermolysis bullosa)是一种慢性遗传性水疱性皮肤病，其特征是当对皮肤施加较小的机械创伤、摩擦或热时会形成水疱和/或伤口。与没有EB的受试者的皮肤相比，患有EB的受试者的皮肤的特征在于极端的皮肤脆弱性。患有EB的人的皮肤非常脆弱，以至于轻度摩擦甚至环境条件(例如，高温和潮湿)都可能导致起水疱和/或伤口。EB的严重程度范围广：最温和的形式是局限性的单纯性EB，其症状包括主要在脚和手上起水疱，但其他形式，尤其是隐性营养不良性EB(RDEB)和交界性EB，其特点是范围更广的皮肤和粘膜受累、全身并发症、毁容性，并且通常严重限制了预期寿命。患有这些较严重形式的EB的人倾向于发展成终生的慢性伤口和感染(Pope等，2013)。

Pearson在1962年基于透射电子显微镜(TEM)的发现提出了一种用于EB的复杂分类系统(Pearson RW，1962)。根据自发性或轻微创伤后EB皮肤***形成的超微结构水平，他将EB分为三种主要类型：表皮溶解性(单纯性EB；EBS)，溶血性(交界性EB；JEB)和皮肤溶解性(营养不良性EB；DEB)。

先进的诊断技术，例如免疫荧光抗原图谱(IFM)或透射电子显微镜(TEM)，也可以用于诊断和分类EB。TEM的主要优点是，它可以可视化超微结构异常并提供对特定表皮角质形成细胞-基底膜区(BMZ)结构缺陷的半定量评估(McMillan，1998)。TEM对于轻度DEB或EBS患者可能特别有用；在这些情况下，IFM可能是正常的，但TEM显示锚定纤丝或中间丝的形态异常。有时在IFM样本中可能看不到裂缝，但TEM可能显示出超微结构裂缝。如在Kindler综合症中所见，多个***平面只能通过TEM来识别。IFM的诊断精度与TEM相似，其优点是执行和解释都更加简单快捷。此外，通过使用特异性单克隆抗体，IFM不仅可以提供对EB主要亚型的深入了解，而且还可以提供对最有可能发生突变的结构蛋白的深入了解(Fine等，2008)。最近的一项研究还显示，通过研究头三个月的绒毛膜绒毛活检，IFM可在某些类型的重度EB的产前诊断中发挥作用(D'Alessio等，2008)。

单纯性大疱性表皮松解症(EBS)：最常见单纯性EB类型是局部性单纯性EB，其在表皮基底层内发生皮肤***。水疱通常位于手掌和脚掌上，受热和摩擦加剧。遗传是常染色体显性遗传，伴轻度疾病。突变存在于角蛋白5或14中。Dowling-Meara是一种较不常见但常染色体显性遗传的类型，其特征是簇状远端水疱，并有一串珍珠状排列。尽管随着时间的推移，人们注意到痛苦的角化皮病，但随着年龄的增长，患者的症状趋于减轻。在EBS的情况下，所有抗体都位于水疱底部。可以使用其他EBS特异性抗体(例如，用于角蛋白5和14的凝集素和α6β4整联蛋白)；通常，蛋白质的表达是正常的，但常染色体隐性EBS除外，此时患者可能缺乏角蛋白14染色(Yiasemides E等，2008)。

交界性EB(JEB)：皮肤和粘膜的***发生在基底膜区域的透明层，包括皮肤、眼、气管咽喉、胃肠道、泌尿生殖道和肾系统的皮层区域。遗传方式通常是常染色体隐性遗传，其编码胶原XVII、α6β4整联蛋白或层粘连蛋白332的基因发生突变。Herlitz形式最严重(在口腔周围、指甲周围和裸露的尿布区域有旺盛的肉芽)，大多数情况下会在生命的最初1至2年内死亡。非Herlitz形式通常在婴儿期就很严重，但预期寿命要长得多。JEB中的主要靶蛋白是XVII型胶原蛋白(BP 180或BPAG2)和层粘连蛋白332(以前称为层粘连蛋白5)。XVII胶原蛋白在裂开的皮肤的顶部上表达，而其他抗体则在水疱的底部上可见。在由层粘连蛋白332的三个多肽链编码的基因之一发生突变而导致的严重的Herlitz形式的JEB(JEB-H)中，该蛋白的表达缺失或显著降低。如果使用非Herlitz JEB(JEB-nH)，层粘连蛋白332的染色减少。如果存在胶原蛋白XVII突变，则在BMZ中胶原蛋白的表达显著减少或不存在，而层粘连蛋白332则正常表达。在患有幽门闭锁的JEB中，对α6和β4整联蛋白亚基的染色减少或不存在(Pohla-Gubo G.等，2010)。所有JEB形式的IV型胶原蛋白染色均位于水疱底部。

营养不良性EB(DEB)：由于VII型胶原蛋白基因的突变，这种类型的EB涉及在真皮内的在锚定原纤维的水平上的致密板下方的***。所有的DEB亚型都是由VII型胶原蛋白的突变引起的，VII型胶原蛋白是锚定原纤维的主要成分。***的水平发生在水疱的顶部，在胶原蛋白XVII和层粘连蛋白332染色的粘膜下层中发生。在患有严重的全身隐性DEB(RDEB)的患者中，IFM显示出缺乏或几乎无法检测到的VII型胶原。在这些情况下，IV型胶原蛋白的免疫染色发生在屋顶上，表明经真皮溶胀起泡，从而证实了DEB。DEB的其他广义或局部亚型可能显示VII型胶原蛋白表达降低或正常表达(Pohla-Gubo G.等,2010；Cepeda-Valdés R等,2010)。常染色体显性遗传形式是第二大最常见的EB类型，患者在容易出现撞击或敲打的区域出现水疱，例如脚趾，膝盖，手指和肘部。常染色体隐性遗传形式通常使人更虚弱，从出生和假性鼻甲起水疱，脚趾和手指融合在一起。这种形式与终身慢性伤口以及在30到40年发展为侵袭性鳞状细胞癌有关。如果他们发展到50年中期，则90％的人将患有鳞状细胞癌。

Kindler综合征：这种罕见的EB形式可能导致上述3个水平中的任何一个***。早期的水疱逐渐被疤痕、角质层皮(手掌和脚掌增厚)、鬼臼皮(色素沉着和色素沉着过多，毛细血管扩张和萎缩)和光敏性所取代。它是由编码kindlin 1的基因突变引起的，kindlin1参与了局部接触处基底层角质形成细胞的粘附。尽管IV型和VII型胶原蛋白抗体在真皮-表皮交界处可能显示广泛的网状染色，但是使用标准的BMZ抗体组的IFM没有显示出染色强度的任何降低或主要改变。用新型的针对kindlin-1的多克隆抗体标记正常皮肤在表皮，尤其是基底角质形成细胞中以及沿真皮-表皮交界处，没有任何皮肤改变，显示出明亮的染色。相反，在Kindler综合征中，皮肤明显减少，在某些情况下，表皮中完全没有染色(AshtonGH.2004)。

皮肤基底膜区的结构如图6所示。

B.EB伤口愈合

炎性阶段是正常伤口愈合的第一阶段，并在创伤后立即发生。伤口愈合的第一步涉及血块的形成。然后是炎症，其特征在于局部的红斑、浮肿和压痛。一旦伤口的这种炎症消退，伤口愈合的增殖阶段就开始了。该处发生细胞增殖、成纤维细胞增殖和表皮细胞***。在此阶段，形成新的血管，肉芽组织逐渐充满伤口。一旦伤口充满肉芽组织，表皮细胞迁移沿着伤口边界发生，以便将其闭合。一旦表皮细胞迁移完成，伤口愈合的最后阶段即重塑阶段就开始了。在此阶段，疤痕组织已经形成并成熟，加强并逐渐变薄，软化并与未受伤的皮肤融合(Schober-Flores，2003)。

通常公认的是，EB患者的伤口愈合过程受到严重损害，长时间处于炎性阶段而没有进入愈合阶段(Schober-Flores，1999)。由于多种因素，包括感染、营养状况、组织氧合状况以及通常用于对症治疗的药物，例如皮质类固醇，会进一步损害愈合过程(Marinkovich等，2014)。

如上所述，患有EB的患者在一种或多种结构和/或功能蛋白(例如但不限于角蛋白、胶原蛋白、凝集素、膜联蛋白、波形蛋白、细丝蛋白、整联蛋白和层粘连蛋白，它们改变皮肤的基本特征并阻止其以正常方式愈合。

因此，一方面，本发明的特征在于一种改善患有EB的受试者的皮肤的结构完整性的方法，其包括向皮肤局部施用包含治疗有效量的CoQ10的组合物，从而改善皮肤的结构完整性。在一个实施方案中，该皮肤包括结构和/或功能蛋白的缺陷。在一个实施方案中，结构和/或功能蛋白的缺陷在表皮之内。在另一个实施方案中，结构蛋白和/或功能蛋白的缺陷在透明层内。在另一个实施方案中，结构和/或功能蛋白的缺陷是在致密板下区。在一个实施方案中，EB是单纯性大疱性表皮松解症。在另一个实施方案中，EB是交界性大疱性表皮松解症。在另一个进一步的实施方案中，EB是营养不良性大疱性表皮松解症。在另一个实施方案中，结构和/或功能蛋白的缺陷是蛋白活性或蛋白表达的缺陷。在另一个实施方案中，通过组织学检查、免疫荧光成像或实时定量PCR确定活性或表达的不足。在另一个实施方案中，通过组织学检查，透射电子显微镜(TEM)或来自受试者的皮肤活检的免疫荧光染色来确定结构完整性。

在某些实施方案中，通过量化与未用辅酶Q10治疗的EB的受试者的皮肤相比，在用CoQ10治疗的EB的受试者的皮肤上形成的新的水疱和/或伤口的数量来确定结构完整性的改善。可以使用对水疱和/或伤口照片的图像分析来确定量化。

在另一个实施方案中，与未使用CoQ10治疗的EB的受试者的皮肤相比，使用吸引水疱测试(suction blister test)在用CoQ10治疗的EB的受试者的皮肤上测量结构完整性。在另一个实施方案中，在用CoQ10治疗的皮肤中水疱形成的时间大于在未使用CoQ10处理的皮肤中水疱形成的时间。

在另一方面，本发明的特征在于一种治疗受试者皮肤伤口的方法，其中所述皮肤包含一种或多种结构和/或功能蛋白的缺陷，包括局部施用包含治疗有效量的辅酶Q10的组合物至伤口处，从而治疗受试者中的伤口。在另一个实施方案中，所述受试者患有大疱性表皮松解症(EB)，例如大疱性表皮松解症是单纯性大疱性表皮松解症、交界性大疱性表皮松解症、营养不良性大疱性表皮松解症或Kindler综合症。在一个实施方案中，结构或功能蛋白选自：角蛋白、胶原蛋白、凝集素、膜联蛋白、波形蛋白、丝质蛋白、整联蛋白和层粘连蛋白。例如，角蛋白可以选自：角蛋白5(KRT5)、角蛋白13(KRT13)、角蛋白14(KRT14)和角蛋白17(KRT17)。在另一个实施方案中，胶原蛋白选自胶原XVII或VII型胶原。在另一个实施方案中，层粘连蛋白是层粘连蛋白332。在另一个实施方案中，整联蛋白是α6β4整联蛋白。在一方面，包含CoQ10的药物组合物的局部给药导致胶原蛋白、血凝素、层粘连蛋白、波形蛋白、膜联蛋白、KRT13、KRT14和/或KRT17增加，以及成纤维细胞和/或角质形成细胞增加。

在某些实施方案中，通过用CoQ10治疗的受试者的伤口相对于初始伤口面积的伤口闭合百分比和未用CoQ10治疗的受试者的伤口相对于初始伤口面积的百分比确定伤口的治疗。例如，可以使用伤口照片的图像分析来确定伤口闭合的百分比。在一个实施例中，伤口闭合的百分比大于50％。在另一个实施方案中，伤口闭合的百分比大于75％。在另一个实施方案中，伤口闭合的百分比大于85％。在另一个实施方案中，伤口闭合的百分比大于90％。在另一个实施方案中，伤口闭合的百分比大于95％。在一个实施例中，伤口闭合的百分比在50-99％之间，例如51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％。

在另一方面，本发明的特征在于一种在患有EB的受试者中增加皮肤水疱和/或伤口的愈合速率的方法，其包括向皮肤局部施用包含治疗有效量的辅酶Q10(CoQ10)的组合物至皮肤水疱，从而增加受试者的皮肤水疱和/或伤口的愈合速率。在一实施方案中，结构和/或功能蛋白的缺陷在表皮之内。在另一个实施方案中，结构蛋白和/或功能蛋白的缺陷在透明层内。在另一个实施方案中，结构和/或功能蛋白的缺陷是在板下致密区。在一个实施方案中，EB是单纯性大疱性表皮松解症。在另一个实施方案中，EB是交界性大疱性表皮松解症。在另一个进一步的实施方案中，EB是营养不良性大疱性表皮松解症。在另一个实施方案中，EB是Kindler综合征。在另一个实施方案中，结构和/或功能蛋白的缺陷是蛋白活性或蛋白表达的缺陷。在另一个实施方案中，通过组织学检查、免疫荧光成像或实时定量PCR确定活性或表达的不足。

在一个实施方案中，愈合速率由与初始伤口面积相比用CoQ10治疗的受试者的伤口的伤口闭合百分比和未用CoQ10治疗的受试者的伤口相对于初始伤口面积确定。在一个实施例中，伤口闭合的百分比大于50％。在另一个实施方案中，伤口闭合的百分比大于75％。在另一个实施方案中，伤口闭合的百分比大于85％。在另一个实施方案中，伤口闭合的百分比大于90％。在另一个实施方案中，伤口闭合的百分比大于95％。在一个实施例中，伤口闭合的百分比在50-99％之间，例如51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％。在另一个实施方案中，愈合速率由与未治疗的水疱和/或伤口的再上皮化的速率相比的经CoQ10组合物治疗的皮肤水疱和/或伤口的再上皮化的速率来确定。在另一个实施方案中，通过与未治疗的皮肤水疱和/或伤口的表皮间隙距离相比，用CoQ10组合物治疗的皮肤水疱和/或伤口的表皮间隙距离的减小来确定愈合的速率。

一方面，本发明的特征在于在有需要的受试者中治疗皮肤水疱和/或伤口的方法，包括将包含治疗有效量的辅酶Q10(CoQ10)的组合物局部施用至受试者的皮肤，从而治疗受试者的皮肤水疱和/或伤口。在一实施方案中，所述受试者患有大疱性表皮松解症(EB)。

在本发明的一个实施方案中，与未治疗的水疱和/或伤口相比，施用包含治疗有效量的CoQ10的组合物减少了水疱和/或伤口的愈合时间。

在另一个实施方案中，与未经治疗的水疱和/或伤口相比，施用包含治疗有效量的辅酶Q10可以改善使用大疱性表皮松解症疾病活动性和瘢痕形成指数(EBDASI，Epidermolysis Bullosa Disease Activity and Scarring Index)的治疗质量。

在其他方面，本发明的特征还在于在患有大疱性表皮松解症的受试者中促进皮肤水疱和/或伤口愈合的方法，其包括向水疱局部施用包含治疗有效量的辅酶Q10(CoQ10)的组合物，从而促进受试者的皮肤水疱和/或伤口的愈合。

在一个实施方案中，与未治疗的水疱的再上皮化率相比，用CoQ10组合物治疗的水疱的再上皮化率增加。下文描述了评估再上皮化率的方法。

在一个实施方案中，与未治疗的水疱和/或伤口的表皮完整性的质量相比，用CoQ10组合物治疗的水疱和/或伤口的表皮完整性的质量得到改善。下文描述了评估表皮完整性的方法。在一个实施例中，使用水疱顶部的组织学检查来评估表皮完整性的质量。

患有EB的受试者的皮肤缺少将正常皮肤粘合在一起的锚或蛋白质。结果，皮肤上极小的压力会导致起泡。CoQ10影响参与皮肤结构和功能维持的结构蛋白表达的能力，以及影响伤口愈合过程关键阶段的能力，为其在EB伤口潜在治疗中的实用性提供了令人信服的理由。因此，本发明部分基于以下鉴定：在患有EB的受试者的皮肤中某些结构蛋白的表达增加或减少，并且用本发明的CoQ10组合物治疗可以改变特定结构蛋白的表达。

在某些实施方案中，与未经治疗的水疱和/或伤口中的一种或多种结构蛋白的表达水平相比，用CoQ10组合物治疗的水疱和/或伤口中的一种或多种结构蛋白的表达水平被调节。结果，可以选择一种或多种特定结构蛋白的表达发生变化的特定患者群体，以用本发明的CoQ10组合物进行治疗。因此，本发明的特征还在于治疗患有大疱性表皮松解症的受试者的方法，包括向受试者施用包含治疗有效量的CoQ10的组合物，从而治疗受试者。在一个实施方案中，该受试者被鉴定为在皮肤中一种或多种结构蛋白的表达具有改变。

在某些实施方案中，结构蛋白包括胶原蛋白、凝集素、膜联蛋白、波形蛋白、纤维蛋白和层粘连蛋白。在特定的实施方案中，结构蛋白是角蛋白，特别是角蛋白5(KRT5)、角蛋白13(KRT13)、角蛋白14(KRT14)和角蛋白17(KRT17)。

在另一方面，本发明的特征是一种在患有大疱性表皮松解症的皮肤病的受试者中治疗或预防鳞状细胞癌的方法，该方法包括对该受试者局部施用包含治疗有效量的CoQ10的组合物，从而在该受试者中治疗或预防鳞状细胞癌。在一个实施方案中，将包含CoQ10的组合物施用于受试者的鳞状细胞癌细胞。在另一个实施方案中，鳞状细胞癌是皮肤鳞状细胞癌。在一个实施方案中，包含CoQ10的组合物的施用调节受试者中一种或多种蛋白质的表达。在另一个实施方案中，蛋白质是应激蛋白质或结构蛋白质。在另一个进一步的实施方案中，该蛋白选自转醛酶1、NM23蛋白、热休克27kDa蛋白1、角蛋白1、角蛋白14、角蛋白13、蛋白酶体β7、蛋白酶体活化剂亚基3和rho GDP解离抑制剂α。在另一个实施方案中，该蛋白质选自：V-akt鼠胸腺瘤病毒癌基因同源物1(AKT1)、与BCL2相关的致癌基因4(BAG4)、与BCL2相关的X蛋白(BAX)、与BCL2类似的1(BCL2L1)、BCL2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白3(BNIP3)、胱天蛋白酶募集结构域家族、成员6(CARD6)、胱天蛋白酶6、凋亡相关的半胱氨酸肽酶(CASP6)、胱天蛋白酶7、凋亡相关的半胱氨酸肽酶(CASP7)、生长停滞和DNA损伤诱导、α(GADD45A)，肿瘤蛋白p53(TP53)和肿瘤蛋白p73(TP73)。

4.评估辅酶Q1O组合物治疗效果的方法

CoQ10组合物在有需要的受试者(例如患有EB的受试者)中治疗皮肤起泡和/或伤口的治疗作用。可以通过多种不同的方法对其进行评估，包括减轻疼痛、改善生活质量、治愈时间、治愈质量、增加的抗药性以及减少水疱和/或伤口形成。

在某些实施方案中，可以使用大疱性表皮松解症疾病活动性和瘢痕形成指数(Epidermolysis Bullosa Disease Activity and Scarring Index,EBDASI)评价治愈质量。EBDASI在活动性和损害方面量化整体皮肤、头皮、粘膜、指甲和其他上皮表面受累的严重程度。EBDASI的优势在于能够从损害中单独区分对治疗有反应的活动评分能力，从而使医生能够追踪可能是可逆的预防损害的疾病活动。EBDASI是一份四页的文档(请参阅Loh等，2014年，在此通过引用将其全部内容并入)。在EBDASI中，按顺序从上到下在12个不同的解剖部位检查了皮肤的每个区域。在每个区域中，活动性(起泡/侵蚀/结皮)的得分为10分。损坏的特征(红斑、色素沉着、皮肤异色病、皮肤萎缩、角化过度/结垢、疤痕、粟粒疹)在每个部位为0(缺失)和1(存在)。对于头皮、粘膜、指甲和其他上皮表面，该过程继续进行。

可以用于伤口评估的另一个框架是修改的测量范式(MEASURE paradigm)(测量尺寸、渗出液[数量和特征]、外观[基部或肉芽组织]、痛苦[疼痛]、破坏[以厘米为单位的深度]，重新评估和边缘)(Keast等，2004，通过引用整体并入本文)。该文档可以很好地评估当前状态下的伤口范围，并且是监视愈合过程的良好工具。Pope等，2013年概述了针对EB患者定制的改良模型。

在某些实施方案中，通过连续摄影定量EB对象中肉芽组织的形成。

可以将愈合时间评估为起泡和/或伤口被“治愈”(完全闭合而无引流)或“未被治愈”。在某些实施方案中，愈合时间可以定义为观察到愈合的第一个日期减去首次发现水疱和/或伤口的日期。例如，如果在第1天首先识别出水疱和/或伤口，而在第10天将其识别为“已愈合”，则治愈时间为9天。在一个实施例中，通过照片、皮肤镜照片和反射共聚焦显微镜(RCM)评估来记录伤口愈合的时间过程。

反射共聚焦显微镜

反射共聚焦显微镜(RCM)提供了体内非侵入性成像技术，其分辨率在细胞水平上与组织病理学密切相关。RCM可以对病变和体内进行快速评估，并可以实时显示表皮和上皮。因此，可以使用反射共聚焦显微镜(RCM)评估皮肤起泡和/或伤口的愈合。

在20世纪90年代，RCM被开发用于实时成像皮肤并适合临床应用。(RajadhyakshaM等，1999)商业上可买到的RCM(VIVASCOPE 1500，Lucid Inc，美国纽约州罗彻斯特)使用近红外830nm二极管激光器和高达22mW的低功率激光束进行成像。光束扫描皮肤以获得水平光学截面，并呈现灰度图像(500×500μm视野)以及皮肤的镶嵌图像(“Vivablock”)。另外，它可以在组织中的同一点产生一系列垂直堆叠的单个图像(“Vivastack”)。RCM最大体内成像深度约为250-350μm。(Reflectance confocal microscopy of cutaneous tumors:anatlas with clinical,dermoscopic and histological correlations.:InformaHealthcare；2008)。

正常皮肤层(角质层、棘突和颗粒状、基底上、真皮-表皮交界处和浅表真皮)已使用RCM进行了表征。这些结果是可重复的。另外，已经鉴定出其他皮肤结构和细胞，包括血管、毛囊、汗腺、角质形成细胞、炎性细胞和黑素细胞。当前，RCM用于基础皮肤研究、美容研究和临床皮肤病学。它的主要用途是早期发现黑色素瘤和非黑色素瘤皮肤。(Yamashita等，2005；Langley等，2001)

传统上，常规伤口评估是基于伤口特征的临床评估。尽管目视检查是临床皮肤病学中已建立的方法，但该方法本质上是主观的，通常对伤口状况没有准确的描述，并且不允许对伤口组织进行超微结构分析。(Lange-Asschenfeldt等，2012)。因此，常规组织学仍然是皮肤伤口愈合形态评估的金标准。然而，尽管组织学在皮肤研究中仍起着重要作用，但仍然存在很大的局限性。活检的侵入性特征不允许随时间对进行活检的同一组织区域进行评估，并且活检对于评估大的或复发性伤口或伤口愈合严重受损或高感染风险的患者可能不可行。另外，组织去除和组织学处理可能导致伪影，从而进一步限制了其临床适用性。

考虑到这些局限性，已经评估了许多非侵入性成像技术的适用性，以评估伤口愈合不同阶段的人皮肤伤口。这些技术可用于本发明中，以评估EB患者的皮肤水疱和/或伤口的愈合。其中，体内RCM代表了一种创新的光学成像工具，可以实时对皮肤进行非侵入性评估。Altintas及其同事首先采用RCM评估烧伤创面，从而描述了微循环、炎症和组织形态学方面。共聚焦显微镜也已用于评估部分激光治疗后的急性表皮伤口愈合(Sattler等，2013年)和人体冷冻手术引起的组织损伤模型(Terhorst等，2011)。

共聚焦显微镜的完全非侵入性和高分辨率能力使其成为伤口愈合研究中的有用工具，并且鉴于其对表皮和表皮皮肤结构的细胞分辨率，特别适用于表皮损伤模型中的伤口愈合。这项研究对伤口愈合过程的特性描述可能会提高我们在该主题上的知识，为评估临床实践中的伤口愈合提供有价值的工具，并提供一种非侵入性技术来测试局部产品在治疗过程中的影响伤口愈合。

在某些实施方案中，通过照片、皮肤镜照片和RCM评估来记录伤口愈合的时间过程。RCM评估参数将包括在细胞、形态学和结构学层面上皮肤伤口修复的特征，以及动态过程，例如血流和炎症以及伤口愈合的后续事件。

在其他实施例中，可以使用Lansky表现量表(Lansky Performance Scale)和儿童皮肤病生存质量指数(Children’s Dermatology Life Quality Index)来衡量生存质量，如本文和Lewis-Jones等，1995中所述，其通过引用整体并入本文。

在一个实施方案中，与未治疗的水疱和/或伤口的再上皮形成率相比，用CoQ10组合物治疗的水疱和/或伤口的上皮再形成速率增加。可以使用反射共聚焦显微镜(RCM)评估并比较上皮形成的速率。

在一个实施例中，与未治疗的水疱和/或伤口的表皮间隙距离相比，水疱和/或伤口的表皮间隙距离减小。表皮间隙距离的变化可以通过间隙宽度来确定，间隙宽度可以量化为横跨水疱的两个迁移的多层上皮前沿之间的间隙距离，并表示为开放水疱/伤口的百分比＝[水疱/伤口的宽度(mm)*100/起泡/伤口大小]。此外，苏木精和曙红(HE)染色可用于检查组织形态。

在一个实施方案中，与未治疗的水疱和/或伤口的表皮完整性的质量相比，用CoQ10组合物治疗的水疱和/或伤口的表皮完整性的质量得到改善。表皮完整性的质量可以通过RCM评估来确定。

对于本领域技术人员而言显而易见的是，本文描述的本发明的方法的其他合适的修改和改变是显而易见的，并且可以使用合适的等同物来进行，而不背离本发明或本文公开的实施例的范围。现在已经详细描述了本发明，通过参考以下实施例将更清楚地理解本发明，这些实施例仅出于说明的目的而被包括，并不旨在限制本发明。

实施例

实施例1、外用辅酶Q10乳膏在大疱性表皮松解症患者中的作用

进行了一项1期研究，以评估大疱性表皮松解症患者中局部辅酶Q10(CoQ10)乳膏的安全性、药代动力学和治疗效果。

试验目标

该试验的主要目的是评估使用3.0％CoQ10乳膏局部治疗时EB患者的安全性和耐受性，按照指示隔天至每周两次施用至受伤的皮肤，并且按照指示每天施用至一块完整的皮肤。所评估的安全性观察和测量包括研究药物暴露、异常的局部皮肤反应、不良事件、实验室数据(血液学、凝血和血清化学)、生命体征和伴随用药。

该试验的次要目标是评估该患者群体中CoQ10 3.0％乳膏的药代动力学(PK)，并评估该患者群体中局部CoQ10 3.0％乳膏的治疗效果，其通过减轻疼痛、改善生存质量、愈合时间、愈合质量，对创伤的抵抗力增强以及水疱形成减少来衡量。大疱性表皮松解症疾病活动性和瘢痕形成指数(EBDASI)和温哥华瘢痕量表(Vancouver Scar Scale)用于量化伤口愈合和瘢痕形成。EBDASI和温哥华瘢痕量表是本领域已知的，并且例如在Journal ofthe American Academy of Dermatology 2014；70:89-97中描述，其通过引用整体并入本文。

研究产品

辅酶Q10 3.0％是深橙黄色粉末，疏水性很强，熔点约为48℃。据文献报道，活性成分CoQ10 3.0％乳膏、泛癸利酮、USP可能受热和光的不利影响。用溶解在聚山梨酯80中的各种浓度(25-60％)的CoQ10进行的实验表明，当在55℃下加热数小时时，该混合物中的CoQ10没有可测量的分解。将混合物加热到50-55℃(即，高于CoQ10的熔点2-7℃)大大加快了CoQ10的溶解。为了制造局部使用的CoQ10乳膏，将两个CoQ10浓缩相(CoQ10/聚山梨酸酯80和水-卵磷脂-乙二醇-苯氧基乙醇)分别加热至50-55℃，并将水相加入到溶解的CoQ10中，并在高剪切力下混合。均质化以形成CoQ10的微乳液浓缩物。然后将CoQ10浓缩物添加至油包水(W/O)乳膏乳剂基质中以产生最终的CoQ10乳膏。乳膏中CoQ10的最终浓度为3.0％。CoQ10 3％乳膏在国际公开号WO2008/116135中进一步描述，其全部内容通过引用整体并入本文。

试验人群

本研究招募了十名已诊断出任何亚型的大疱性表皮松解症患者。患者必须满足以下条件才能纳入临床试验：1.筛查时至少12岁的男性或女性；2.已确认EB诊断；3.没有其他可能对伤口愈合产生不利影响的皮肤病；4.愿意在治疗期间避免使用未经批准的乳液或乳膏，并避免在待下次使用之前清洗治疗区域；5.愿意在研究期间避免暴露于过度的直射阳光或紫外线下；6.具有研究计划中列出的测试的实验室值在中央实验室定义的参考范围内，或具有研究者临床上可以接受的“超出范围”的测试结果。可接受的“超出范围”的值通常是由于同时用药或疾病过程(INR和PT/APTT除外)而在患者正常基线水平之内的值；7.有能够遵循学***方厘米之间。

试验设计

患者/护理人员按照指示，每隔一天至每周两次将3％的CoQ10乳膏涂抹在受伤的皮肤上，包括研究人员选择的作为指标伤口的伤口，并按照指示每天在一块完整的皮肤上使用。通过临床评估和照片跟踪指标伤口的伤口愈合情况。指标伤口优选地位于四肢或躯干上(但如果患者使用尿布，则不在三叉区域或尿布区域上)。选择一块完整的皮肤用于评估吸引水疱并每天使用3％CoQ10乳膏。如果患者体重不足15千克，则完整的皮肤部分位于大腿前部或中下部。试验药物(CoQ10 3.0％乳膏)的总施用面积不得超过20％BSA。安全审核小组(SRG)持续监控安全。如果不良事件(AE)和所有其他安全参数均可接受，则研究将按计划进行。如果SRG确定存在重大安全隐患，则在进行全面评估之前，不会对任何患者进行进一步治疗。如果SRG确定继续治疗存在危险，则停止研究。

安全性和耐受性评估包括对所有AE和严重不良事件(SAE)报告的持续监视和记录、对皮肤刺激性症状和体征的定期监视、生命体征的定期测量、体格检查以及临床实验室测试(化学和血液学)，包括血红蛋白、血细胞比容、白细胞(WBC)计数和差异(单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞)的百分比和绝对值、红细胞(RBC)计数、血小板计数和PT/APTT/INR白蛋白、碱性磷酸酶、总胆红素、碳酸氢盐/二氧化碳、钙、胆固醇、氯化物、肌酐、肌酸激酶、γ-GT、葡萄糖、LDH、无机磷、脂肪酶、淀粉酶、镁、钾、总蛋白、AST、ALT、钠、甘油三酸酯、尿素和尿酸。如果总胆红素浓度增加到正常上限的1.5倍以上，则应区分直接和间接反应胆红素。

试验治疗的给药

试验治疗：研究治疗(CoQ10 3.0％乳膏)的首次使用是在诊所的第1周第1天进行，并由诊所工作人员进行监测和指导，以确认该疗法适用于指标伤口和其他受伤皮肤以及未受影响的皮肤选择皮肤。此后，所有研究患者或其护理人员都必须在家中(包括在试验中心就诊日)进行研究治疗。按照指示，每隔一天至每周两次对受伤的皮肤以及每天按指示对一块完整的皮肤使用试用药物。

治疗持续时间：每个患者的总体参与时间预计最长为18周。筛选时间长达2周。治疗期为12周。随访时间为4周。

先前和伴随的药物：在研究过程中未在治疗区域使用其他乳膏或乳液。在筛选期间记录了过去3个月内服用的所有药物，包括非处方(OTC)药物和营养补品(包括CoQ10补品)。此后，记录了在研究过程中服用的所有药物，包括非处方药和营养补品。有关总日剂量、给药途径、开始和终止日期以及适应症的信息记录在患者的病例报告表(CRF)中。

概览

所有患者均在本协议规定的日期访问试验中心。该试验的完整评估时间表如下表1所示。

表1

¹血红蛋白，血细胞比容，白细胞(WBC)计数与差异(单核细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，嗜中性粒细胞，淋巴细胞)的百分比和绝对值，红细胞(RBC)计数，血小板计数和PT/APTT/INR，白蛋白，碱性磷酸酶，总胆红素，碳酸氢盐/CO₂，钙，胆固醇，氯化物，肌酐，肌酸激酶，γ-GT，葡萄糖，LDH，无机磷，脂肪酶，淀粉酶，镁，钾，总蛋白，AST，ALT，钠，甘油三酸酯，尿素和尿酸。如果总胆红素浓度增加到正常上限的1.5倍以上，则应区分直接和间接反应胆红素。

²仅在第1周和第8周的第1天和第3天以及在第1周第1天的给药后4小时抽取PK样本(2cc)。

³EB子类型-如果需要。

⁴在吸水疱手术后0、4和48小时的RCM评估。

⁵每天应用IP于选定的完整皮肤和吸引水疱区域。为了靶向EB伤口，研究小组可酌情决定隔天一次至一周两次应用IP。

⁶护理人员提供敷料。第12周时未使用或分发试验药物(CoQ10 3.0％乳膏)。注意：指标伤口和吸引水疱区域的敷料由迈阿密大学提供。

⁷在第12周就诊后大约第4周(约第16周)查看所有患者，以评估是否有任何持续的不良事件。

筛选

在研究人员或指定人员在场的情况下获得签署的知情同意书后，在开始研究治疗的第1天前的14天内，由研究人员或指定人员收集、审查、并确定是否可接受筛查评估。这些包括出生日期、性别、种族、族裔、身高、体重和并发诊断。此外，如果需要，还可以进行伤口评估和EB子分型(过去接受的任何EB子分型也是可以接受的-无需重做)。同时进行血液学、血液化学和尿液检查。对于有生育能力的女性患者，将进行尿液妊娠试验。确定纳入/排除标准。根据研究者的评估记录治疗方法以及其他相关的医学和外科历史。进行生命体征和身体检查，包括皮肤的皮肤病学一般检查。选择、记录和测量指标伤口。

基线/入选

在第1周的第1天，对患者进行评估，以在开始治疗之前重新检查并确认其资格。对所选治疗区域进行治疗前评估，包括局部皮肤反应(LSR)、照片、色素沉着和疤痕形成。分配试用药物(CoQ103.0％乳膏)。使用大疱性表皮松解症疾病活动性和瘢痕形成指数(EBDASI)和温哥华瘢痕量表，如Journal of the American Academy of Dermatology 2014；70:89-97中所述，其通过引用整体并入本文。

试验治疗期

研究治疗的最初应用是在临床的第1天进行的，并由诊所工作人员进行监控和指导，以确认对病灶以及所选完整皮肤的正确应用。此后，所有研究患者(或看护者)都需要在家中自行应用研究治疗药物，包括在试验中心就诊日。在研究期间的任何时候都可以看到患者，以评估可能的不良事件。这些被捕获为计划外访问。

药物的制备和给药(CoQ103.0％乳膏)

患者或护理人员应按每隔一天至每周两次的指示，对受伤的皮肤(包括指标伤口)施予试验药物(CoQ103.0％乳膏)，并按指示每天对完整的皮肤部分施予。在所有就诊时，在研究中心将试验药物(CoQ103.0％乳膏)和敷料应用于指标伤口以及选择完整的皮肤。将少量豌豆大小的乳膏放在占主导地位的食指上。将试验药物(CoQ103.0％乳膏)均匀地散布在选定的治疗部位和病变周围区域5-10秒，以使用乳膏覆盖的皮肤总面积约为治疗病变大小的两倍。用患者或看护人从可接受的局部敷料的选定列表中选择的敷料将局部敷料伤口施加到受伤的皮肤上。

护理标准

所有治疗组的所有患者均接受以下护理标准：识别并修改了导致起泡的因素(例如紧身衣服)；采取了减少皮肤摩擦的措施，特别是在指标伤口周围的区域和完整的皮肤部分进行了吸引评估。通过用温和的肥皂和水温和清洁来保持皮肤清洁(但仅在试用药物(CoQ103.0％乳膏)应用6小时后)；使用了非研磨性和非粘性伤口敷料；通过使用指定的敷料保持中等湿润的病变环境；对于除指标伤口以外的病变，如果治疗医师建议，使用非致敏性抗生素软膏；并及时发现并治疗感染。

试验结果衡量

安全性结果分析：概述了出现任何导致治疗或试验过早中断的治疗紧急不良事件(TEAE)、SAE、AE、LSR的患者数量(百分比)，并列出了与治疗相关的AE和严重AE。

疗效结果分析：提出了使用EBDASI量表评估改善/瘢痕形成以及生活质量改善的评估。

参与者入组和随访：总共入组10名患者，并用CoQ10组合物治疗最多12周。在第16周左右对仍待试验12周的患者进行随访。对使用试验药物(CoQ10 3.0％乳膏)有良好反应的患者，应额外提供研究药物，并每六个月随访一次，观察是否有不良事件。

试用结果

案例研究1：29岁男性，患有非Herlitz型交界性EB

在第1周第1天的目标病变，治疗前(图8A)，测量为15.17cm，并显示出高度的红斑。在第1周的第3天，两次施用CoQ10乳膏后(图8B)，目标病变已减少至11.2cm，并且水疱中的水分明显减少。到第2周(图8C)，目标病变已减少至9.1cm，液体和肿胀进一步减少。

案例研究2：19岁女性，患有单纯性EB，Dowling Meara型

在临床试验中治疗前一个月，受试者大腿内侧的目标病变(测量值为5.28cm，图9A)已经存在。到第2周时，慢性伤口已减少至0.28cm(图9B)。在第8周就诊时，几乎完全重新上皮化，仅剩下0.25cm病变(图9C)。

案例研究3：16岁女性，非Herlitz型交界性EB

在第1周第1天的目标病变，治疗前(图10A)，测量为36.96cm，有一些颗粒。在第2周，病变显示出肉芽增加，大小明显减小至4cm(图10B)。到第8周时，病变已完全上皮化，仅显示疤痕(图10C)。

案例研究4：17岁男性，营养不良性EB，隐性

在第1周第1天的目标病变，治疗前，测量为21.76厘米(图11A)并且在第一次施用CoQ10乳膏之前具有大量的渗出物和血液。在到第2周时，目标病变已缩小至15.19厘米，并在边界附近显示出明显的干燥和肉芽。

案例研究5：59岁男性，交界性EB

在第1周第1天的目标病变，治疗前包括数个颗粒状糜烂且测量为20.75厘米(图12A)。在第1周第3天(在用CoQ10乳膏进行两次治疗之后)，病变的尺寸已减小至14.4cm，并显示出明显的上皮再生(图12B)。到第8周时，目标病变已得到明显治愈，糜烂次数进一步减少，并且再次上皮化(图12C)。

结论

向患有各种形式的EB的患者局部施用本发明的3％CoQ10乳膏可大大提高水疱和伤口的愈合，甚至在治疗前存在数周的慢性伤口也是如此。照片显示，即使仅用本发明的组合物进行了几次处理，仍可观察到巨大的积极效果-伤口闭合、水疱收缩、肉芽增多、再上皮化增加、肿胀降低和/或水疱减少。这与在临床试验开始之前就采用的EB伤口护理标准形成鲜明对比，并且显然没有产生任何明显的缓解作用。

实施例2、CoQ10成分对促进吸引伤口水疱愈合的影响

用于共聚焦成像的吸引水疱试验还用于评估CoQ10 3.0％乳膏在EB患者的未受影响皮肤上使用时促进伤口愈合的功效。使用反射共聚焦显微镜(RCM)评估比较基线和第8周时诱导的吸水疱再上皮化的速率。在基线和第8周时使用水疱顶部的组织学检查评估表皮完整性的质量。RCM评估参数包括在细胞、形态和结构水平上皮肤伤口修复的功能，以及动态过程(例如血流和炎症)以及伤口愈合的连续事件的文档。所有图像均进行了描述性形态分析。

我们评估了4名12岁以上的确诊为EB的患者。在第1周第1天(基线)，我们通过抽吸完整皮肤的表皮层，使用CELLUTOME系统创建了直径为1.8毫米的均匀伤口。在受伤的0、4和48小时后进行反射共聚焦显微镜(RCM)成像之前，对所有伤口进行临床和皮肤镜检查。在第1周进行48小时RCM评估后，指示患者每天在伤口和周围区域使用CoQ10 3.0％乳膏，直到第8周的第3天。在第8周第1天，用局部CoQ10 3.0％乳膏处理过的区域类似地重现了CELLUTOME的水疱。我们在受伤的0、4和48小时再次进行了RCM分析。在每个RCM期间，我们在伤口的不同级别捕获了6张图像。我们分析了所有RCM图像，以描述和比较EB患者伤口愈合期间基线(在用CoQ10 3.0％乳膏治疗之前)和局部用CoQ10 3.0％乳膏8周后的细胞和形态变化。

皮肤镜检查和RCM图像显示由CELLUTOME系统在治疗的皮肤上形成的清晰伤口。此外，在受伤后48小时，在未经治疗的伤口中存在红斑且占主导地位(图13A、13C)，而治疗后的伤口在基线和48小时的红斑明显减少(图13B，13D)。

在未经治疗的(基线)伤口中，RCM图像显示胶原束和弥漫性炎性细胞在受伤后48小时持续存在(图14A)。此外，我们还观察到颗粒状组织和很少的多边形角质细胞(图14A)。相比之下，治疗后炎症细胞明显较少(图14B)。此外，我们在第8周看到了有组织的胶原束和各种角质细胞(图14B)，这是促进愈合的有力证据。治疗会导致大量胶原蛋白的产生和组织，如在未经治疗的皮肤上显示细束的RCM图像所示(图16A)，而治疗后出现的较厚、更有组织的胶原束(图16B)。此外，未经治疗的皮肤之间炎症细胞和肉芽的数量存在明显差异(图。15A)和治疗过的皮肤(图15B)。在经过治疗的皮肤中，受伤后4小时出现炎症细胞，但在48小时时炎症细胞明显减少。此外，受伤48小时后出现广泛的颗粒组织和几个多边形角质细胞(图15B)。

患者还报告了在使用CoQ10 3.0％乳膏时有更好的愈合。上面讨论的患者图像显示，CoQ10 3.0％乳膏可改善EB患者的皮肤完整性。还显示了CoQ10 3.0％乳膏减少炎症伤口愈合阶段并增加增殖阶段的成分，这将导致EB患者成功治愈。没有对CoQ10 3.0％乳膏的不良反应的报告。

实施例3、CoQ10组成对结构蛋白的影响

伤口愈合需要结合新的***基质即肉芽组织，并且伤口收缩需要多种细胞类型，包括成纤维细胞和角质形成细胞。这两种细胞类型均产生许多结构蛋白，这些蛋白对于伤口的重新上皮形成和重建以完成愈合过程至关重要。因此，具有调节细胞外基质关键成分表达能力的药物将潜在地改善组织再生并促进伤口愈合。发现用CoQ10组合物处理成纤维细胞和角质形成细胞与各种结构蛋白表达的改变有关。在成纤维细胞中用CoQ10组合物处理影响了各种结构蛋白的表达，包括胶原蛋白、血凝素、膜联蛋白、波形蛋白、纤维蛋白和层粘连蛋白，所有这些都涉及与EB相关的各种病理。类似地，用辅酶Q10组合物处理的角质形成细胞表现出结构蛋白表达的变化，所述结构蛋白包括几种角蛋白，分别包括KRT13、KRT14和KRT17。CoQ10组合物影响参与维持皮肤结构和功能的结构蛋白表达的能力，以及影响伤口愈合过程关键阶段的能力，为其在EB伤口治疗中的实用性提供了令人信服的理由。

实施例4、CoQ10组合物在大疱性表皮松解症患者中治疗皮肤鳞状细胞癌的用途

除了对各个器官的上皮组织造成破坏性损伤外，EB患者还遇到其他并发症，包括生长迟缓、贫血、肌肉营养不良和手足畸形。但是，成人EB发病率和死亡率的原因与恶性肿瘤的发生有关，其中皮肤鳞状细胞癌(cSCC)非常显著。

隐性营养不良性EB(RDEB)患者中皮肤SCC的发生率最高，一生中35、45和55岁的累积风险分别达到67.8％、80.2％和90.15％。与美国非EB患者的皮肤SCC终生风险相比，EB的发生率要高得多，在白种人中为7-11％。此外，尽管采取了积极的外科手术干预措施，近80％的EB患者仍死于转移性SCC。在交界性EB(JEB)患者人群中也观察到了cSCC的发病率，其25岁时的终生累积风险约为18.2％。

与非EB患者相比，在EB患者中观察到的较高的发病率和皮肤SCC的侵袭性表明cSCC的分子病因病理学存在差异。已经建立了包括p53突变、基质金属蛋白酶(MMPs)、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)和黑皮质素1受体(MC1R)多态性在内的分子标记，作为cSCC起始和进展的主要决定因素。相反，缺乏一致的证据暗示EB患者的cSCC病因中存在特定途径。已经提出许多因素，包括组织压力(由于伤口愈合中的EB相关缺陷)、由于EB相关突变导致的角质形成细胞的恶变前势、生长因子和其他免疫监控减弱，是导致EB患者中cSCC的发作/进展的主要因素。分子分析已确定了凋亡调节因子(例如p53)、生长因子(例如EGFR、FGF)、蛋白酶(MMP，胶原酶)和表观遗传学(HDAC)与EB患者cSCC的发生和发展有关。

令人感兴趣的是观察到在肾移植患者的cSCC中的角蛋白(例如，KRT6、KRT16、KRT17)和MMP(1、3、9、10)受到最强烈的调节。鉴于胶原蛋白(例如Col7A、Col17)、角蛋白(例如KRT5、KRT14)和层粘连蛋白(例如层粘连蛋白5)等结构蛋白的畸变已与EB相关，并且EB和移植患者中的蛋白酶如MMPs(1、2、3、5、9)和胶原酶与cSCC相关，这被认为是阻碍细胞骨架结构蛋白和蛋白酶活性的分子网络相交与细胞周期调节和凋亡的结合最有可能影响EB患者cSCC的启动和进展。

迄今为止，似乎没有定义或管理这些患者的任何标准准则。手术切除、化学疗法和/或放疗是护理标准的三种方式，其反应和长期预后差异很大。化疗和放疗均与不良反应的发生率相关。当前，对于隐性营养不良性大疱性表皮松解症(RDEB)患者，治疗cSCC的方法非常有限。

肿瘤抑制因子p53被认为是基因组的守护者，它调节DNA修复机制以避免激活凋亡途径以消除受损的角质形成细胞。在表皮中，内部/外部损伤有可能诱发DNA损伤(例如UV暴露)导致p53活化，如果可能的话，协调DNA修复，或者如果DNA损伤无法修复，则使细胞凋亡(Ortonne，2002)。另外，p53本身可能是损伤/损伤/应激的直接靶标，并且功能丧失p53可导致不受控制的增殖和凋亡功能丧失。在皮肤癌中经常观察到p53的突变，并且其在各种皮肤癌中的频率是高度可变的(Einspahr等，1999)。

由于高加索人群的日晒和发病率/死亡率，高累积日照所致的SCC病因一直是研究的主要领域。除EB患者外，在接受免疫抑制治疗的患者中，人***瘤病毒感染期间SCC的发生率也更高(Pons等，2006)。光化性角化病和原位SCC是浸润性SCC的浸润前阶段。已在超过60％的SCC和AK中鉴定出p53突变，并且这种突变是紫外线辐射诱导的突变特征(Pons等，2006)。除了在p53位点丧失杂合性(LOH)(17p.13.1)，还鉴定了其他携带LOH的染色体(Boukamp，2005)。其他因素包括炎症(例如TNF-α，IL-6)，脂质过氧化，活性氧和线粒体DNA损伤与SCC的发生和发展有关(Bachelor等，2009)。人们普遍认为，多种遗传、生理和微环境因素有助于SCC的扩散和侵袭性。

组织特有的损伤(即AK/BCC中的紫外线诱导的细胞损伤可被认为是肿瘤发生过程中的“起始”步骤，但不足以使肿瘤病变获得恶性肿瘤。这些肿瘤性病变的克隆扩增与总体遗传、蛋白质组和表型改变相结合对于获得恶性表型和转移潜力至关重要。从奥托·沃伯格(Otto Warburg)的经典研究开始，现在已经充分认识到，肿瘤病变中的代谢转化对于获得恶性功能至关重要，也是必需的。这可以通过高度增殖的肿瘤来证明，这些肿瘤表现出沃伯格表型，利用葡萄糖作为在细胞质中产生ATP并绕过线粒体氧化磷酸化的主要来源(Weinhouse，1956；Burk等，1956)。考虑到AK和BCC与低度恶性肿瘤以及恶性表型发作所需的潜伏期延长(数十年)有关，这表明存在致癌性损害，而缺乏代谢转换。相比之下，AK原位转移到SCC与肿瘤病变的缓慢而渐进的克隆性扩张以及恶性表型特征的基因，蛋白质和代谢特征的改变有关(Berhane，2002)。Aldara的功效还可能涉及炎症因子，而Aldara的功效专门针对Toll样受体，其使用与重大副作用的发生有关。已经研究了多种旨在规避驱动葡萄糖利用以生成ATP的细胞生物能网络的多种策略，作为癌症的潜在疗法(Yeluri等，2009)。高度转移性癌症(例如转移性SCC和黑色素瘤)的特征在于代谢表型，这对于维持其恶性能力至关重要(Scatena等，2011；Hersey等，2009)。开发了一种新型的含有辅酶Q10的制剂，作为一种选择性影响癌症中细胞生物能途径而不影响正常细胞功能的手段。CoQ10是线粒体电子转移链中不可或缺的组成部分，用于产生三磷酸腺苷(ATP)(细胞的主要能源)。除了在能量代谢中的作用外，CoQ10还可以用作抗氧化剂、膜稳定剂和自由基清除剂。已研究了CoQ10制剂作为肿瘤、心脏、神经、代谢和遗传疾病的治疗方法。辅酶Q10专门针对细胞生物能源网络，将能量产生从细胞质(在代谢活跃的增生性癌症中观察到)转移到线粒体氧化磷酸化(在正常组织中观察到)。

通过引用整体并入本文的国际申请号PCT/US2005/001581描述了降低动物受试者中肿瘤生长速率的CoQ10的局部制剂。

CoQ10的体外研究表明，在正常细胞不存在明显毒性的情况下，它能够选择性地影响癌细胞的活力。图1描述了鳞状细胞癌和黑色素瘤细胞系细胞增殖速率的剂量依赖性降低，但对正常人角质形成细胞和成纤维细胞没有影响。

对黑素瘤(SK-MEL-28)和鳞状细胞癌(SCC-25)细胞系观察到的细胞增殖速率的浓度依赖性降低表明辅酶Q10在选择性地影响癌细胞而对正常细胞系(即正常人)无毒性的情况下角质形成细胞和成年成纤维细胞。当局部应用于裸鼠的黑色素瘤肿瘤时，1.0％的CoQ10制剂可抑制生长和血管生成。该机制涉及细胞生物能从细胞质糖酵解向线粒体氧化磷酸化的转变(AACR 2011)。癌症(包括SCC和黑素瘤)中细胞代谢途径的改变，通过以有助于细胞死亡的方式重新建立促凋亡Bcl-2/Bax比值的平衡，导致p53调节的凋亡潜力得以重现。

异柠檬酸脱氢酶(IDH-1和IDH-2)是NADP+依赖性酶，可催化异柠檬酸氧化脱羧成酮戊二酸。IDH-1是胞质亚型突变，与人类脑癌的发生率有关(Parsons等，2008)。此外，与功能障碍的酶相关的突变IDH-1的表达与Hif-1a的表达增加相关(Zhao S等，2009)。功能异常的IDH酶与各种癌症的发病率有关，这表明正常IDH酶表达的增加应与正常氧化磷酸化的概括有关。黑色素瘤细胞中辅酶Q10的治疗与IDH-1表达的浓度依赖性增加相关(图2)，表明线粒体氧化磷酸化增加。

ATP柠檬酸裂解酶(ACL)是负责将葡萄糖衍生的胞质柠檬酸转化为乙酰CoA的主要酶，用于脂质和胆固醇的生物合成(Bauer等，2005)。此外，ATP柠檬酸裂合酶生成的乙酰辅酶A对响应生长因子刺激和分化过程中的组蛋白乙酰化至关重要(Wellen KE等，2009)。已经提出，ACL活性的降低可能与线粒体中柠檬酸的氧化增加有关，导致TCA循环活性增加和氧化磷酸化(Board M和Newsholme E，1996)。因此，辅酶Q10诱导黑素瘤细胞系中ACL表达的降低(图3)表明，脂质和胆固醇生物合成的降低对于组蛋白的增殖和乙酰化至关重要，而脂质和胆固醇的生物合成在与癌细胞生长和分化相关的转录活性的调节中是必需的。响应辅酶Q10处理，在正常(HASMC)细胞中未观察到类似的ACL表达下降。因此，用辅酶Q10处理癌细胞以与线粒体氧化磷酸化增强相一致的方式改变蛋白质的表达，并伴随着持续增殖必不可少的途径减少。

在另一组实验中，用辅酶Q10组合物治疗黑素瘤细胞(SK-MEL-28)导致p53和p14ARF的浓度依赖于浓度的进行性增加，而p53和p14ARF可以调节细胞凋亡途径。MDM2是p53表达和活性的负调节剂，因此，图4中所示的表达降低代表响应辅酶Q10处理的p53表达增加的间接验证。

图5描述了调节黑色素瘤细胞系中细胞死亡途径的促凋亡和抗凋亡标记物的表达。暴露于辅酶Q10后，观察到抗凋亡bcl-2蛋白的浓度依赖性降低以及促凋亡bax表达的增加。半胱天冬酶caspase 3的表达在剂量上的逐步依赖依赖性增加表明辅酶Q10能够使癌细胞参与凋亡过程。

接下来，对鳞状细胞癌的体外模型SCC细胞系(SCC-25)进行蛋白质组学分析，以描述本发明的CoQ10组合物的潜在的机械调节作用。上面显示并在下面复制的表1列出了经鉴定在6和24小时内对SCC细胞中100uM CoQ10处理具有不同反应的蛋白质。

表2

在SCC模型中，用CoQ10进行治疗与转醛缩酶-1(其为调节核酸中间体的生物合成的磷酸戊糖途径中的一种酶)的降低相关。此外，转醛缩酶-1还参与维持细胞还原当量(NADPH)平衡和基于谷胱甘肽的氧化还原状态。另外，SCC中CoQ10的暴露与应激蛋白和角蛋白表达的变化有关。EB中已经记录了角蛋白14的缺陷，其中一种角蛋白的表达响应于SCC模型中的CoQ10组成而增加。

上面显示并在下面转载的表3列出了通过凋亡阵列分析时100uM Q10治疗调节的SCC细胞中的基因。

表3

响应CoQ10暴露，分析SCC细胞中转录表达的变化与24小时内p53转录物持续增加有关。相反，TP73转录本先下降，然后上升。响应CoQ10处理而在SCC细胞系中观察到的其他主要变化是AKT1的下降与促凋亡标记物(包括Bax和多个胱天蛋白酶)的上调串联在一起。总体而言，来自表1和表2的数据表明SCC细胞系中的CoQ10暴露与代谢表型的变化、p53的活化和细胞凋亡有关。

大量的体外和体内研究为辅酶Q10改变细胞生物能通过线粒体氧化磷酸化促进ATP合成提供了支持。细胞生物能学从糖酵解转向辅酶Q10诱导的氧化磷酸化的后果是凋亡、血管生成、线粒体和核功能的改变、选择性靶向癌细胞在正常细胞不存在毒性的情况下死亡。

本文提供的结果表明，辅酶Q10是一种能够选择性地干扰癌症的代谢网络的分子，从而将癌症对葡萄糖的直接利用的依赖性转移到支持线粒体氧化磷酸化的途径，由此直接产生葡萄糖。辅酶Q10暴露在细胞生物能利用网络中向线粒体氧化磷酸化的转变与p53介导的凋亡途径的重新概括(校正)有关，而凋亡途径已经在癌细胞中消失。辅酶Q10的活性和作用机理明确证明其在有效治疗转移性SCC中的实用性，其特点是在真正的致癌环境中观察到高代谢活性。

总之，本文提供的结果支持辅酶Q10组合物的潜在用途，其包含具有渗透增强剂的专有脂质纳米分散体中的CoQ10，以促进靶组织中的大量摄取，以用于SCC的一般治疗，以及用于治疗在EB患者中观察到的侵袭性cSCC。

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