蛋白c活性测定试剂盒

文档序号:1553671 发布日期:2020-01-21 浏览:36次 >En<

阅读说明:本技术 蛋白c活性测定试剂盒 (Protein C activity determination kit ) 是由 廖婉露 温昶钰 王高煊 包文海 于 2019-11-20 设计创作,主要内容包括:本发明涉及蛋白C活性测定试剂盒,包括:含有蛋白C激活剂的试剂R1和含有发色底物的试剂R2。本发明试剂盒中的试剂R1和试剂R2均为液体,制备工艺简单,成本低,具有显著提升的稳定性和抗血红蛋白干扰效果,可广泛应用于各级医院、卫生部门、医学生物科研单位等机构。(The invention relates to a protein C activity determination kit, which comprises: a reagent R1 containing a protein C activator and a reagent R2 containing a chromogenic substrate. The reagent R1 and the reagent R2 in the kit are both liquid, the preparation process is simple, the cost is low, the stability and the hemoglobin interference resistance effect are obviously improved, and the kit can be widely applied to institutions such as hospitals, health departments, medical and biological research institutions at all levels.)

蛋白C活性测定试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学领域,具体涉及一种蛋白C活性测定试剂盒。

背景技术

蛋白C(简称PC)是一种维生素K依赖的血浆丝氨酸蛋白酶酶原,主要在肝脏中合成,肾脏、睾丸中也可以合成一部分,相对分子质量为62kD,半衰期6小时。它在凝血酶或凝血酶-血栓调节蛋白复合物的作用下被转变成活化蛋白C(简称APC)。APC与其辅因子蛋白S(简称PS)形成复合物,有灭活Va和VIIIa及增加纤溶的活性,因此具有抗凝作用。当PC缺乏时,因子Va和VIIIa灭活减少及血循环纤溶能力降低,因此促使纤维蛋白形成过多,而导致血栓形成。

PC在抗凝血、抗炎症、抗细胞凋亡及保护血管内皮细胞等方面都发挥着重要的作用,其众多的生物学功能,决定了其与临床很多疾病都有着密切联系。如脓毒血症、败血症、弥散性血管内凝血(DIC)、血栓性疾病和肝脏疾病,如肝硬化和慢性肝炎等,均可检测到PC水平有不同程度的降低。因此,对PC的测定,对于疾病的预防、监控和治疗有重要作用。由此可见,建立一种能准确检测血浆中PC活性的简便方法,对于上述各类疾病的预防诊断、观察病情及判断预后,具有重要价值。

目前,蛋白C的检测一般可分为2大类:一类是对其抗原含量的检测(PC:Ag),另一类是对其活性的检测(PC:AC)。

PC:Ag可以用放射免疫分析法、火箭电泳法、酶联免疫吸附法(ELISA)等对PC抗原进行定量分析。火箭电泳法特异性差、敏感性低、且受抗血清制备规模的限制,因而有很大的局限性;放射免疫分析法需要特殊仪器,一般实验室难以进行;因此一般采用特异性较高、较为简便的ELISA法测其含量。

PC:AC的测定可以用活化部分凝血活酶试剂法(APTT)和发色底物法(CSA)。APTT法的测定结果的判定往往以检验人员的经验而定,直接影响测定结果的准确性和重复性。CAS法则因采用较特异性的发色底物,使得操作简便,测定结果的准确性和重复性也较好。

获得性PC缺乏症患者PC:Ag和PC:AC的变化是平行的,因此大多数疾病中测定PC:Ag和PC:AC具有相同的临床意义,一般采用ELISA法或发色底物法(CSA)测定PC:Ag或PC:AC。

世界卫生组织(World Health Orgnization,WHO)推荐的PC检测方法为发色底物法(CSA)。目前,市售的蛋白C活性检测试剂盒也主要采用发色底物法,该方法能准确、特异地反映PC活性,不仅结果真实稳定,而且操作简便易行,具有快速的优点,只需数分钟就能完成检测。

目前市售的蛋白C活性测定试剂盒中所采用的激活剂绝大多数从蝮蛇蛇毒中分离纯化而得。然而,自蝮蛇蛇毒中提取的蛋白C激活剂的稳定性较差,为延长试剂的保存时间,目前市售的蛋白C活性测定试剂盒中,试剂均为冻干粉末。但冻干试剂具有以下弊端:制备工艺繁琐、成本高;试剂的瓶间差异大;实际使用前需要对冻干试剂进行复溶,操作不方便;复溶后的试剂稳定性差,需要在较短时间内完成使用,否则易造成试剂浪费。

因此,本领域亟需一种制备简单、成本更低、稳定性好且使用方便,易于在各级医院、***门等推广使用的液体型蛋白C活性测定试剂盒。

发明内容

为解决上述问题,本发明的目的是提供一种稳定性好的液体型蛋白C活性测定试剂盒。

在第一方面,本发明提供一种蛋白C活性测定试剂盒,包含试剂R1和试剂R2。试剂R1中包含蛋白C激活剂、缓冲液、聚乙二醇、PC300和醇胺类化合物;试剂R2中包含发色底物和缓冲液。

PC300,即ProClin300,其主要包含2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮。PC300的示例性用量为0.5~10.0mL/L,例如,可以选择0.5mL/L、1mL/L、2mL/L、3mL/L、4mL/L、5mL/L、6mL/L、7mL/L、8mL/L、9mL/L、10mL/L。

在一些实施方式中,试剂R1的pH值为7.2~8.5,例如,可以是7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5。在一些实施方式中,试剂R2的pH值为6.0~7.2,例如,可以是6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1或7.2。

在一些实施方式中,蛋白C激活剂是指从蝮蛇蛇毒中提取的能特异性激活蛋白C的成分。蛋白C激活剂示例性用量为0.05~0.50IU/ml,例如,可以是0.05IU/ml、0.1IU/ml、0.15IU/ml、0.2IU/ml、0.25IU/ml、0.3IU/ml、0.35IU/ml、0.4IU/ml、0.45IU/ml或0.5IU/ml。

在一些实施方式中,聚乙二醇选自PEG-20000、PEG-4000、PEG-6000中的一种或两种以上的组合。作为进一步优选的实施方式中,聚乙二醇为PEG-20000。聚乙二醇示例性的用量为0.5~15.0g/L,例如,可以是0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L或15g/L。

在一些实施方式中,醇胺类化合物选自氨基丁三醇、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、一乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、3-丙醇胺、一异丙醇胺、二异丙醇胺、三异丙醇胺、N,N-二甲基乙醇胺和N,N-二乙基乙醇胺中的一种或两种以上的组合。作为进一步优选的实施方式中,醇胺类化合物选自氨基丁三醇、三乙醇胺和2-氨基-2-甲基-1-丙醇中的一种或两种以上的组合。作为进一步优选的实施方式中,醇胺类化合物为三乙醇胺。醇胺类化合物的示例性用量为1~40g/L,例如,可以是1g/L、3g/L、5g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L、25g/L、26g/L、27g/L、28g/L、29g/L、30g/L、32g/L、34g/L、36g/L、38g/L、39g/L、40g/L。

在一些实施方式中,试剂R1和试剂R2中的缓冲液选自HEPES酸缓冲液、Tris缓冲液、咪唑缓冲液、巴比妥缓冲液中的一种或两种以上的组合。缓冲液的示例性用量为5.0~30.0g/L

在一些实施方式中,试剂R1中还包含稳定剂。稳定剂可选自蛋白质、糖类、氨基酸、抗氧剂、助悬剂中的一种或两种以上的组合。作为进一步优选的实施方式,稳定剂选自牛血清白蛋白、海藻糖、甘露醇、山梨醇中的一种或两种以上的组合。作为更进一步优选的实施方式,稳定剂为牛血清白蛋白和海藻糖的组合。稳定剂的用量为本领域的常规用量,例如,牛血清白蛋白示例性的用量为5.0~30.0g/L,海藻糖示例性的用量为0.5~20.0g/L。

在一些实施方式中,试剂R2中的发色底物选自PyroGlu-Pro-Arg-pNA·HCl、p-glu-pro-arg-MNA、THC-Pro-Arg-pNA中的一种,发色底物的示例性用量为0.1~0.8mg/ml。

在一些实施方式中,试剂R2中还包括无机盐。无机盐可选自NaCl、KCl或CSCl,在某些实施方式中,无机盐优选为CSCl。无机盐的示例性用量为1.0~30.0g/L。

在一些实施方式中,试剂R2中还包括稳定剂。试剂R2中的稳定剂与试剂R1中的稳定剂类似,可选自蛋白质、糖类、氨基酸、抗氧剂、助悬剂中的一种或两种以上的组合,其中,蛋白质可以是牛血清白蛋白;糖类可以是海藻糖、甘露醇、山梨醇等,氨基酸可以是组氨酸、精氨酸等。在某些

具体实施方式

中,试剂R2中的稳定剂为精氨酸。稳定剂的示例性用量为1.0~20.0g/L。

在一些实施方式中,试剂R2中还包括防腐剂。防腐剂可选自叠氮化钠(Na3N)、MIT(即,2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)、CMIT(即,5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)、苯酚、ProClin系列中的一种或多种。在某些具体实施方式中,试剂R2中的防腐剂为叠氮化钠。防腐剂的示例性用量为0.1~10.0g/L。

在一些实施方式中,蛋白C活性测定试剂盒包括试剂R1和试剂R2,

试剂R1包括:

HEPES缓冲液:5.0~30.0g/L;

蛋白C激活剂:0.05~0.50IU/ml;

牛血清白蛋白:5.0~30.0g/L;

海藻糖:0.5~20.0g/L;

PEG-20000:0.5~15.0g/L;

PC300:0.5~10.0mL/L;

三乙醇胺:10~30mL/L;

试剂R2包括:

HEPES缓冲液:5.0~30.0g/L;

发色底物:0.1~0.8mg/ml;

稳定剂:1.0~20.0g/L;

无机盐:1.0~30.0g/L;

防腐剂:0.1~10.0g/L。

在一些实施方式中,蛋白C活性测定试剂盒包括试剂R1和试剂R2,

试剂R1包括:

HEPES缓冲液:5.0~30.0g/L;

蛋白C激活剂:0.05~0.50IU/ml;

牛血清白蛋白:5.0~30.0g/L;

海藻糖:0.5~20.0g/L;

PEG-20000:0.5~15.0g/L;

PC300:0.5~10.0mL/L;

三乙醇胺:10~30mL/L;

试剂R2包括:

HEPES缓冲液:5.0~30.0g/L;

发色底物:0.1~0.8mg/ml;

精氨酸:1.0~20.0g/L;

氯化铯:1.0~30.0g/L;

防腐剂:0.1~10.0g/L。

另一方面,本发明提供一种蛋白C活性测定试剂盒的制备方法,包括以下内容:

试剂R1的配制:将蛋白C激活剂、缓冲液、聚乙二醇、PC300和醇胺类化合物进行混合,调节pH值至7.2~8.5;

试剂R2的配制:将发色底物和缓冲液进行混合,调节pH值至6.0-7.2。

在上述的蛋白C活性测定试剂盒的制备方法中,PC300,即ProClin300,PC300的示例性用量为0.5~10.0mL/L,例如,可以选择0.5mL/L、1mL/L、2mL/L、3mL/L、4mL/L、5mL/L、6mL/L、7mL/L、8mL/L、9mL/L、10mL/L。

在上述的蛋白C活性测定试剂盒的制备方法中,蛋白C激活剂是指从蝮蛇蛇毒中提取的能特异性激活蛋白C的成分。蛋白C激活剂示例性用量为0.05~0.50IU/ml,例如,可以是0.05IU/ml、0.1IU/ml、0.15IU/ml、0.2IU/ml、0.25IU/ml、0.3IU/ml、0.35IU/ml、0.4IU/ml、0.45IU/ml或0.5IU/ml。

在上述的蛋白C活性测定试剂盒的制备方法中,聚乙二醇选自PEG-20000、PEG-4000、PEG-6000中的一种或两种以上的组合。作为进一步优选的实施方式中,聚乙二醇为PEG-20000。聚乙二醇示例性的用量为0.5~15.0g/L,例如,可以是0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L或15g/L。

在上述的蛋白C活性测定试剂盒的制备方法中,醇胺类化合物选自氨基丁三醇、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、一乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、3-丙醇胺、一异丙醇胺、二异丙醇胺、三异丙醇胺、N,N-二甲基乙醇胺和N,N-二乙基乙醇胺中的一种或两种以上的组合。作为进一步优选的实施方式中,醇胺类化合物选自氨基丁三醇、三乙醇胺和2-氨基-2-甲基-1-丙醇中的一种或两种以上的组合。作为进一步优选的实施方式中,醇胺类化合物为三乙醇胺。醇胺类化合物的示例性用量为1~40g/L,例如,可以是1g/L、3g/L、5g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L、25g/L、26g/L、27g/L、28g/L、29g/L、30g/L、32g/L、34g/L、36g/L、38g/L、39g/L、40g/L。

在上述的蛋白C活性测定试剂盒的制备方法中,制备试剂R1和试剂R2中的缓冲液选自HEPES酸缓冲液、Tris缓冲液、咪唑缓冲液、巴比妥缓冲液中的一种或两种以上的组合。缓冲液的示例性用量为5.0~30.0g/L。

在上述的蛋白C活性测定试剂盒的制备方法中,制备试剂R1中采用的稳定剂可选自蛋白质、糖类、氨基酸、抗氧剂、助悬剂中的一种或两种以上的组合。作为进一步优选的实施方式,稳定剂选自牛血清白蛋白、海藻糖、甘露醇、山梨醇中的一种或两种以上的组合。作为更进一步优选的实施方式,稳定剂为牛血清白蛋白和海藻糖的组合。稳定剂的用量为本领域的常规用量,例如,牛血清白蛋白示例性的用量为5.0~30.0g/L,海藻糖示例性的用量为0.5~20.0g/L。

在上述的蛋白C活性测定试剂盒的制备方法中,试剂R2中的发色底物选自PyroGlu-Pro-Arg-pNA·HCl、p-glu-pro-arg-MNA、THC-Pro-Arg-pNA中的一种,发色底物的示例性用量为0.1~0.8mg/ml。

另一方面,本发明提供一种蛋白C活性测定试剂盒的制备方法,包括以下内容:

试剂R1的配制:将蛋白C激活剂、缓冲液、牛血清白蛋白、海藻糖、PEG-20000、PC300和三乙醇胺进行混合,调节pH值至7.2~8.5;

试剂R2的配制:将发色底物、缓冲液、稳定剂、无机盐和防腐剂进行混合,调节pH值至6.0~7.2;

其中,试剂R1和试剂R2中的缓冲液选自HEPES酸缓冲液、Tris缓冲液、咪唑缓冲液、巴比妥缓冲液中的一种或两种以上的组合。

在某些实施例中,试剂R1中蛋白C激活剂的示例性用量为0.05~0.50IU/ml,例如,可以是0.05IU/ml、0.1IU/ml、0.15IU/ml、0.2IU/ml、0.25IU/ml、0.3IU/ml、0.35IU/ml、0.4IU/ml、0.45IU/ml或0.5IU/ml。

在某些实施例中,试剂R1中的缓冲液为HEPES缓冲液,其用量为5.0~30.0g/L。

在某些实施例中,试剂R1中的牛血清白蛋白示例性的用量为5.0~30.0g/L,海藻糖示例性的用量为0.5~20.0g/L。

在某些实施例中,试剂R1中的PEG-20000示例性的用量为0.5~15.0g/L,例如,可以是0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L或15g/L。

在某些实施例中,试剂R1中的PC300,即ProClin300,其示例性用量为0.5~10.0mL/L,例如,可以选择0.5mL/L、1mL/L、2mL/L、3mL/L、4mL/L、5mL/L、6mL/L、7mL/L、8mL/L、9mL/L、10mL/L。

在某些实施例中,试剂R1中的三乙醇胺的示例性用量为10~30mL/L,例如,可以是10mL/L、12mL/L、14mL/L、15mL/L、17mL/L、19mL/L、20mL/L、22mL/L、24mL/L、26mL/L、28mL/L、30mL/L。

在某些实施方式中,试剂R2中的发色底物选自PyroGlu-Pro-Arg-pNA·HCl、p-glu-pro-arg-MNA、THC-Pro-Arg-pNA中的一种,发色底物的示例性用量为0.1~0.8mg/ml。

在某些实施方式中,试剂R2中的缓冲液为HEPES缓冲液。试剂R2中缓冲液的示例性用量为5.0~30.0g/L。

在某些实施方式中,试剂R2中的稳定剂可选自蛋白质、糖类、氨基酸、抗氧剂、助悬剂中的一种或两种以上的组合,其中,蛋白质可以是牛血清白蛋白;糖类可以是海藻糖、甘露醇、山梨醇等,氨基酸可以是组氨酸、精氨酸等。在某些具体实施方式中,试剂R2中的稳定剂为精氨酸。稳定剂的示例性用量为1.0~20.0g/L。

在某些实施方式中,试剂R2中的防腐剂可选自叠氮化钠(Na3N)、MIT(即,2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)、CMIT(即,5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)、苯酚、ProClin系列中的一种或多种。在某些具体实施方式中,试剂R2中的防腐剂为叠氮化钠。防腐剂的示例性用量为0.1~10.0g/L。

有益效果

本发明提供的蛋白C活性测定试剂盒,具有显著提升的稳定性和抗血红蛋白干扰效果。本发明试剂盒为液体型试剂盒,由于试剂盒中的试剂R1和试剂R2均为液体,无需冷冻干燥,制备工艺更简单,降低了生产成本;在试剂盒的实际使用前,无需复溶操作,使用更方便,且减少了瓶间差。

本发明提供的蛋白C活性测定试剂盒,制备简单、成本更低、稳定性好且使用方便,可广泛应用于各级医院、***门、医学生物科研单位等机构。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例,具体阐述本发明,本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解,这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明,而非限制本发明。

实施例1:蛋白C活性测定试剂盒的制备

按照表1-表3进行蛋白C活性测定试剂盒的配制:

表1

Figure BDA0002280129770000071

表2

Figure BDA0002280129770000072

Figure BDA0002280129770000081

表3

Figure BDA0002280129770000082

实施例2:蛋白C活性测定试剂盒的稳定性考察

实验仪器:SYSMEX CS-2100i全自动凝血分析仪

质控血浆:正常质控血浆(Control Plasma N)、异常质控血浆(Control PlasmaP)

实验操作:

将实施例1中实验组1-7的蛋白C活性测定试剂盒分别对两种质控血浆进行蛋白C活性的测定,得到的测定值为初始测定值;

将上述实验组1-7的蛋白C活性测定试剂盒放置在37℃环境中进行热破坏,热破坏一定时间(例如,1天、3天、7天、10天、14天)后,分别对两种质控血浆测定蛋白C活性,得到不同热破坏时间下的测定值;

将热破坏后测定值与初始测定值进行相对偏差计算,相对偏差在±10%以内视为稳定。

实验组1-5和实验组7的蛋白C活性测定试剂盒的稳定性结果如表4所示:

(由于实验组6的试剂盒校准曲线信号值整体偏低,不能满足临床需求,其稳定性检测结果没有记录在表4中)

表4

Figure BDA0002280129770000091

Figure BDA0002280129770000111

表4中质控水平1和2分别代表两个不同蛋白C活性的样本,质控水平N代表正常水平,质控水平P代表异常水平,每个水平进行3次重复试验取均值。从表4可看出,实验组1-3的蛋白C活性测定试剂盒在热破坏(37℃)10天后,测定的活性值与初始测定值的相对偏差大于10%,表明实验组1-3的试剂盒的稳定性较差。实验组7的蛋白C活性测定试剂盒,在热破坏(37℃)14天后,异常质控血浆相对偏差<±2.5%,该试剂盒的热稳定效果最佳。

此外,发明人还在实验组7的试剂盒配方基础上,将实验组7的试剂R1中的三乙醇胺替换成氨丁三醇(用量:10.519g/L)、或者将实验组7的试剂R1中的三乙醇胺替换成2-氨基-2-甲基-1-丙醇(用量:3.2mL/L),其他成分与实验组7相同。然后将上述两种替换的试剂盒分别按照实施例2中的方式进行稳定性考察,其稳定性效果与实验组7的效果均相当。

实施例3:市售蛋白C活性测定试剂盒的稳定性考察

将市售进口的蛋白C活性测定试剂盒(发色底物法)进行复溶,然后将复溶后的液体试剂按照实施例2中的方法,进行稳定性检测,得到的稳定性结果如表5所示:

表5

Figure BDA0002280129770000121

从表5可看出:市售的蛋白C活性测定试剂盒为冻干粉,将其复溶后,溶液状态下的试剂盒在热破坏(37℃)10天后,异常质控血浆的相对偏差>±10%,即放置10天后的稳定性较差。

实施例4:抗血红蛋白干扰效果考察

将实验组7和市售进口的蛋白C活性测定试剂盒,分别进行抗血红蛋白干扰效果的考察:

(1)血红蛋白样本的制备:制备高浓度血红蛋白母液(5.0g/L),再按比例将其添加到混合血浆中(4小时以内的人正常血浆,且已使用0.9%生理盐水去除基质效应),分别制备成浓度为0.0(即混合血浆)、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0g/L的含血红蛋白样本;

(2)分别使用实验组7和市售进口的蛋白C活性测定试剂盒,按样本中血红蛋白含量从小到大进行检测,并分别计算血红蛋白浓度为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0g/L样本的检测结果与血红蛋白含量为0.0g/L样本的相对偏差(即变化率),相对偏差在±10%以内视为合格,且相对偏差越小,说明检测结果受样本中血红蛋白影响越小,试剂的抗血红蛋白干扰能力越好。

抗血红蛋白干扰的结果如表6所示:

表6

Figure BDA0002280129770000131

从表6可看出:本发明试剂盒在检测血红蛋白含量≤5.0g/L的样本时,检测结果稳定,相对偏差较小,均在±10%以内;而市售试剂盒在检测血红蛋白含量为3.0g/L的样本时,相对偏差开始维持在10%以上,血红蛋白含量为4.0及5.0g/L时,由于干扰严重,检测曲线剧烈波动,无法测定出结果,说明本发明试剂盒与市售进口试剂盒相比,具有显著提升的抗血红蛋白干扰能力,检测结果受血红蛋白干扰更小。

实施例5:随机血浆样本检测的相关性考察

随机收集正常人和患者血浆样本共33例,其中男17例,女16例。用本发明试剂盒(实施例1中的实验组7)与德国Siemens公司蛋白C测定试剂盒(发色底物法),货号为OUVV15,分别对样本重复测定2次,计算测定均值,计算两者的相关系数,并进行线性回归。

检测结果:两种试剂盒的相关系数r=0.997,线性回归方程为y=0.9637x+5.3915。根据美国临床实验室标准化组织(CLSI)文件的要求r>0.975得出:本发明试剂盒与德国Siemens公司蛋白C测定试剂盒(发色底物法)的检测结果具有很好的一致性。

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