阅读说明：本技术 用于酶促a1c检测和定量的样品制备系统和方法 (For enzymatic A1C detection and quantitative sample preparation system and method ) 是由 G·L·休斯 B·维尔纳 于 2017-12-12 设计创作，主要内容包括：用于制备含有血红蛋白HbAlc的样品用于通过电化学传感器测量的系统包括裂解制剂,该裂解制剂包括两性离子表面活性剂。该系统进一步包括氧化制剂,该氧化制剂包括阳离子表面活性剂和异噻唑啉衍生物以及蛋白酶制剂,该蛋白酶制剂包括包含唑的分子。(Being used to prepare system of the sample containing Hb H bAlc for measuring by electrochemical sensor includes cracking preparation, which includes zwitterionic surfactant.The system further comprises oxidation preparation, which includes cationic surfactant and isothiazoline derivative and protease preparation, which includes the molecule comprising azoles.)

用于酶促A1C检测和定量的样品制备系统和方法

背景技术

对于各种血液分析物和体液中的其它可检测量度的即时护理(“POC”)和家庭测试对于患者和医生是期望的。一种此类分析物是A1C，一类糖基化血红蛋白。高水平的血糖导致遍及全身的蛋白质包括血红蛋白的过度糖基化。血红蛋白的糖基化主要发生在β链的氨基末端处以及具有游离氨基的其它位点。血红蛋白A经历由葡萄糖的缓慢糖基化，其取决于在红血细胞的120天寿命内葡萄糖的时间平均浓度。糖基化血红蛋白A的最普遍和最有特色的种类是A1C，占健康个体中的总血红蛋白的大约3％至6％。A1C与血糖水平的相关性使其成为用于监测患有糖尿病的人中的长期血糖水平的有用方法。平均(平均值)血糖水平(MBG)是A1C水平的函数，且因此可推导。

在一个实施方案中，用于制备通过电化学传感器测量的含有血红蛋白A1C的样品的系统包括裂解制剂，该裂解制剂包括两性离子表面活性剂。该系统进一步包括氧化制剂，该氧化制剂包括阳离子表面活性剂和异噻唑啉衍生物以及蛋白酶制剂，该蛋白酶制剂包括包含唑的分子。在替代实施方案中，两性离子表面活性剂可以是另一种表面活性剂。在一个替代方案中，两性离子表面活性剂是Zwittergent 3-14。在另一个替代方案中，阳离子表面活性剂是1-十二烷基氯化吡啶鎓，并且异噻唑啉衍生物是1,2-苯并异噻唑-3(2H)-酮。可替代地，蛋白酶制剂包括中性蛋白酶。在一个替代方案中，唑是咪唑。任选地，咪唑在pH 7.5下为1M。

可替代地，该系统包括取样器/混合器装置，并且裂解制剂位于取样器/混合器装置中。在另一替代方案中，该系统包括测试条，并且氧化制剂和蛋白酶制剂位于测试条中。

在一个实施方案中，用于测定血红蛋白如HbAlC的糖基化百分比的系统包括第一电化学测试区域，该第一电化学测试区域提供了HbAlC的浓度；以及第二电化学测试区域，该第二电化学测试区域提供了血红蛋白的总量。该系统进一步包括裂解制剂，该裂解制剂包括两性离子表面活性剂。该系统进一步包括氧化制剂，该氧化制剂包括阳离子表面活性剂和异噻唑啉衍生物以及蛋白酶制剂，该蛋白酶制剂包括包含唑的分子。在一个替代方案中，第一电化学测试区域包括具有果糖基氨基酸氧化酶或果糖基肽氧化酶涂层的测试条。在另一个替代方案中，第一电化学测试区域包括三氯化六胺合钌介质。在另外一个替代方案中，第一电化学测试区域包括铁氰化物介质。可替代地，两性离子表面活性剂是Zwittergent 3-14。在另一个替代方案中，阳离子表面活性剂是1-十二烷基氯化吡啶鎓，并且异噻唑啉衍生物是1,2-苯并异噻唑-3(2H)-酮。可替代地，蛋白酶制剂包括中性蛋白酶。在一个替代方案中，唑是咪唑。任选地，咪唑在pH 7.5下为1M。在一个替代方案中，咪唑为0.5至2M。在另一个替代方案中，咪唑的pH为6-8。可替代地，该系统包括取样器/混合器装置，并且裂解制剂位于取样器/混合器装置中。在另一个替代方案中，该系统包括测试条，并且氧化制剂和蛋白酶制剂位于测试条中。

在一个实施方案中，制备用于电化学血红蛋白AlC测定的样品的方法包括接受血液样品。该方法进一步包括用裂解制剂裂解血液样品中的红血细胞，该裂解制剂包括两性离子表面活性剂。该方法进一步包括用氧化制剂氧化血液样品中的血红蛋白，该氧化制剂包括阳离子表面活性剂和异噻唑啉衍生物。该方法进一步包括用蛋白酶制剂消化血红蛋白，该蛋白酶制剂包括包含唑的分子。在一个替代方案中，两性离子表面活性剂是Zwittergent 3-14。在另一个替代方案中，阳离子表面活性剂是1-十二烷基氯化吡啶鎓，并且异噻唑啉衍生物是1,2-苯并异噻唑-3(2H)-酮。可替代地，蛋白酶制剂包括中性蛋白酶。在一个替代方案中，唑是咪唑。

附图说明

图1显示了使用4％十二烷基氯化吡啶鎓的血红蛋白氧化的滴定测量结果的图；

图2显示了通过向裂解的血液中添加1,2-苯并异噻唑啉的血红蛋白氧化的滴定测量结果的图；

图3显示了当使用十二烷基氯化吡啶鎓和1,2-苯并异噻唑啉两者时，血红蛋白氧化的滴定测量结果的图；

图4显示了将pH保持在7.5下的咪唑的滴定图；

图5显示了具有不同水平的咪唑的剂量应答图的图；

图6显示了如何使用献血者来测量内源性F-VH的图；

图7显示了使用1M咪唑作为稀释剂的稀释比较的图；

图8显示了与电化学测试仪的安培数相比，表示为果糖基-L-缬氨酰组氨酸的假设血红蛋白水平的图；

图9显示了用于HbAlc的电化学测试条的一个实施方案。

具体实施方案

某些术语在本文中使用仅为了方便起见，而不应视为对用于HbAlc的酶促检测和定量的样品制备系统和方法的实施方案的限制。本文所述的制备技术以及酶促检测和定量技术使得HbAlc的电化学检测成为可能。在附图中，在几个图自始至终，相同的附图标记用于指定相同的元件。

当葡萄糖结合血红蛋白的β链的N末端缬氨酸残基时，形成血红蛋白A1C。HbAlc在总血红蛋白中的百分比描述了最近三个月平均血糖测量的过程。它是糖尿病患者已将其糖尿病控制得如何好或如何差的指示剂，并且也可以是糖尿病前期的指示剂。

测量HbA1c使测量血红蛋白和糖基化血红蛋白成为必需，因为HbA1c被测量为总血红蛋白的百分比。血红蛋白可以用电化学方法测量，因为它能够与果糖基-L-缬氨酰组氨酸(F-VH)电化学反应(用果糖基氨基酸氧化酶作为酶或可替代地果糖基肽氧化酶)。这仅仅是电化学反应方案的实例，并且本文描述的许多技术可以与其它电化学测量方案一起使用。仅仅HbAlc的电化学反应不足以产生商业上可行的测定。这是因为全血样品不能立即提供待测量的HbAlc的可用性。然而，释放HbAlc的系统和方法可以引起测定的各个方面的干扰。

因此，为了提供可以对全血起作用的系统，可能需要多种技术来释放HbAlc。在许多实施方案中，酶促HbAlc测定涉及的步骤包括下述：

1.裂解红血细胞。

2.氧化血红蛋白。

3.允许蛋白酶消化血红蛋白以释放F-VH。

4.使F-VH与果糖基肽氧化酶反应。

5.测量F-VH的反应。

如所述的，相关申请提供了F-VH如何在电化学测试条上反应。此处所述的测试用电化学传感器进行测试，其中将试剂干燥以测试F-VH。关于下述测试的实验设置由将全血加入含有裂解试剂、氧化试剂或蛋白酶的试剂中组成。然后将该溶液计量加入电化学传感器上。

在许多实施方案中，提供测定中的第一步是裂解红血细胞。在许多实施方案中，可以使用表面活性剂来完成RBC裂解。可以获得许多表面活性剂，并且一些表面活性剂在裂解RBC方面更好或更有效。表面活性剂可以是非离子的、阴离子的、阳离子的或两性离子的。基于研究和实验，在一个实施方案中，使用两性离子表面活性剂，因为它将稍微变性的血红蛋白保持在溶液中。其它表面活性剂将裂解细胞，但Zwittergent 3-14看起来保持血红蛋白从溶液中脱离，并且不能与蛋白酶反应。这是表面活性剂的重要特征。Zwittergent 3-14的化学式为C₁₉H₄₁N0₃S，并且具有正十四烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸酯(n-tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propane sulfonate)的化学名称。因为Zwittergent 3-14包括强度相似的分子的强碱性部分和强酸性部分，所以可以出现这种特征。这种结构预防带正电和带负电的分子不可逆结合。由于HbAlc通常是带负电的，因此认为Zwittergent 3-14的这种特性预防HbAlc与表面活性剂的结合。认为可以使用其它表面活性剂，其具有将轻微变性的血红蛋白保持在溶液中的类似特征以及预防与表面活性剂的不可逆结合的特征。

在许多实施方案中，测定中的下一步是氧化血红蛋白。血红蛋白的氧化是测定的重要方面。如果血红蛋白在与介质接触之前未被氧化，则它将被介质氧化，产生电化学应答和不需要的背景。不幸的是，形成高铁血红蛋白的许多常见物质也是电化学活性的。在一个实施方案中，通过使用阳离子表面活性剂和异噻唑啉衍生物，能够以不电化学干扰的方式氧化血红蛋白以形成高铁血红蛋白。必须选择以适当浓度的阳离子表面活性剂和异噻唑啉衍生物，使得所有血红蛋白都被氧化。异噻唑啉本身完全不氧化血红蛋白(图2)，阳离子表面活性剂也完全不氧化血红蛋白(图1)。

不受特定理论的束缚，两个实体均需要以适当的浓度存在以完全氧化血红蛋白(图3)。与先前各方所做的研究形成对比，这两种组分的缺乏不提供血红蛋白的完全氧化。这在以前的研究中没有实现。优选的实例是1-十二烷基氯化吡啶鎓作为阳离子表面活性剂和1,2-苯并异噻唑-3(2H)-酮作为异噻唑啉衍生物。

图1显示了使用4％十二烷基氯化吡啶鎓的血红蛋白氧化的滴定测量结果，由于在1：1血液对试剂稀释液中多于2％的十二烷基氯化吡啶鎓的血红蛋白干扰，降低了电化学信号。然而，并非所有的血红蛋白都被氧化。期望背景电流小于200nA。使用以60％血细胞比容的单血液样品。在本文所示的各种图中，y轴提供了测量的纳米安培数(nA)。

图2显示了通过向裂解的血液中添加1,2-苯并异噻唑啉的血红蛋白氧化的滴定测量结果。存在一些血红蛋白氧化，但没有完全氧化。稀释因子为1：1的血液与A1C试剂。使用以60％血细胞比容的单血液样品。

图3显示了当使用十二烷基氯化吡啶鎓和1,2-苯并异噻唑啉两者时，血红蛋白氧化的滴定测量结果。血红蛋白被氧化成高铁血红蛋白。稀释因子为1：1的血液与A1C试剂。使用以60％血细胞比容的单血液样品。期望背景电流小于200nA。

在许多实施方案中，蛋白酶消化是该过程中的下一步。测量HbAlc的酶促途径始于使用蛋白酶，所述蛋白酶能够将糖基化血红蛋白选择性地降解为糖基化血红蛋白降解产物。中性蛋白酶是用于该反应的选择蛋白酶。反应方案中可以使用众多中性蛋白酶，以及由各种细菌产生的中性蛋白酶。反应参见下文。

中性蛋白酶是可以由芽孢杆菌属(Bacillus)物种产生的极其稳定的锌金属内肽酶。在替代方案中，它可以由多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)产生。

为了优化蛋白酶的消化，血红蛋白需要处于松弛状态并且能够扩散开。松弛状态提供了分子展开。用于医院分析仪的商业A1C测定具有较大的稀释因子(例如1份血液对100份试剂)。在电化学POC测定中，样品不能稀释那么多，并且仍具有足够的信号以读取。不能稀释样品的约束明显提出了使蛋白酶有效工作的挑战。为了克服这一挑战，在许多实施方案中，将咪唑用作配体。咪唑(C3H4N2)与血红蛋白结合，促使其处于松弛状态，并且因此允许蛋白酶更有效地反应(图4)。其它血红蛋白结合配体如叠氮化钠不具有与咪唑相同的效应。

图4显示了滴定咪唑，使pH保持在7.5下。在A1C试剂中的1M咪唑下，发生更多的蛋白酶消化，释放出更多的F-VH。稀释因子为1份血液(60％Hct)和1份A1C试剂。认为在各种pH下各种摩尔浓度的咪唑都可以起作用。在一些配置中，咪唑的浓度挑选为0.5至2M。在一些配置中，使用6-8的咪唑pH。以其最终浓度的咪唑的一种可能优化在1：5稀释度下为760mM。可以使用各种浓度的咪唑或各种类似物。在某些情况下，较低的浓度可能不足以增强蛋白酶的活性用于电化学测定的目的，所述电化学测定在适当的体积和时间段内起作用，用于即时护理用途和可销售性。这种销售适用于pH，因为极端pH水平可以扰乱测定的其它方面。

在各种替代方案中，可以使用咪唑的其它类似物。类似物可以包括苯并咪唑、二氢咪唑、吡咯、噁唑、噻唑、吡唑、***、四唑、五唑、呋咱(furazan)、异噻唑、噻唑、噻二唑和各种其它唑。另外，在各种替代方案中，可以使用具有咪唑作为侧链的分子例如组氨酸或者具有咪唑或咪唑类似物作为侧链的其它分子代替咪唑，可以增强蛋白酶。

咪唑虽然增强了蛋白酶的能力，但它本身不允许在最低限度稀释的溶液中的完全消化。血红蛋白的展开需要一定的空间。最初，在一个实施方案中，开发模型使用全血对试剂的1：1稀释液，希望使试剂在测试条上干燥。通过使用高浓度的咪唑，增加蛋白酶效率(图4)，但完全消化是不可能的(参见图5)。认为需要更多空间用于血红蛋白展开，添加水作为稀释剂，并且测试了1：2和1：3的稀释度。这种测试显示了信号中的按比例下降(图6)。仅对于血红蛋白增加更多的空间不足以使蛋白酶起作用。图5显示了即使在试剂中具有另外的咪唑，该测定也不能与使用外部F-VH的理论剂量应答相匹配。图6显示了如何使用献血者来测量内源性F-VH。血液与A1C试剂的比率(裂解/蛋白酶)为1：1，其中添加水作为额外的稀释剂。

使用水作为稀释剂以产生用于血红蛋白展开的空间并未显示更多的蛋白酶消化。然而，当1M咪唑溶液用作稀释剂时，对于1：1、1：2、1：3和1：4稀释度观察到相同的信号(图7)。只是在1：5稀释度下电化学信号才下降。该实验确认蛋白酶效率由空间(用于血红蛋白展开的空间)和咪唑(使血红蛋白处于松弛状态)两者决定。

图7显示了使用1M咪唑作为稀释剂，pH 7.5的稀释比较；电化学信号直到1：5稀释度才下降。

因此，基于这些实验结果，可以产生用于测定HbAlc的系统。在许多实施方案中，用于获得电化学酶促HbAlc测定的系统包括上述许多方面。在一个实施方案中，通过使用不电化学干扰的氧化系统，能够与血红蛋白反应以形成高铁血红蛋白。这是很重要的，使得介质不与血红蛋白反应。选择表面活性剂Zwittergent 3-14来裂解细胞，并且将轻微变性的血红蛋白保持在溶液中。使用具有低稀释度(1：5)的高浓度咪唑允许蛋白酶有效地释放所有F-VH。空间(稀释)和咪唑两者均是最佳的蛋白酶功能所需要的。

图8示出了所述系统的概念证明(内源性F-VH反应)。全血以1：5的稀释度与含有裂解表面活性剂、氧化剂、咪唑缓冲液和蛋白酶的试剂混合。血液样品由五个样品组成，所述样品改变以获得20％和60％的血细胞比容。获得极佳的相关性，其斜率等价于外部F-VH在1：5稀释度下的理论反应。可以看出R平方值为大约0.981。

在一个实施方案中，测试条设计包括这些技术中的许多。任何样品中的糖基化血红蛋白的量通常很小。另外稀释样品以使HbAlc的氧化和检测成为可能。为了容纳少量可检测的HbAlc，使用叉指电极来增强电化学信号。氧化剂和蛋白酶在跑道/通道上干燥，以被血液溶液重构。在将溶液沉积到电化学测试条上之前，使用取样器来收集血液，并且将其与裂解/咪唑溶液混合。图9显示了用于HbAlc的电化学测试条的一个实施方案。

测试条910包括样品沉积区域915。在使用中，取样器/混合器从用户收集样品。然后根据上述配置，将样品与裂解/咪唑溶液混合。取样器/混合器然后用于将混合的样品计量加入样品沉积区域915。测试条910包括第一轨道和第二轨道920、925。在测试条910的两个轨道920、925的传输通道节段930中，发生Hb的氧化和消化。传输通道节段930可以是管或设计为使样品流动到叉指电极940的其它通道。该通道可以开孔以增强样品的流动。任选地加热该通道以增强消化活性。加热可以通过与测试条910相关联的仪表施加。测试条910可以包括可以由仪表提供动力且启动的加热元件，或者仪表可以包括加热元件。温度传感器可以被包括在测试条910或相关联的仪表中，以调节温度水平。叉指电极940作为我们的触点950显示在测试条910的端部处，所述触点950被相应的仪表使用，以便测量测试条910的电活性。在替代实施方案中，可以省略运输通道节段，并且可以在取样器/混合器中添加氧化剂和蛋白酶。在一些实施方案中，样品/混合器可以包括用于混合过程的各个部分的2个或更多个区室。

尽管具体实施方案已在前述详细描述中得到详细描述并且在附图中示出，但本领域技术人员将了解，根据公开内容的总体教导及其广义的发明构思，可以开发对这些细节的各种修改和替代。因此，应理解，本公开内容的范围并不限于本文公开的特定实例和实施，而是预期覆盖如由所附权利要求及其任何和所有等价物限定的其精神和范围内的修改。