阅读说明：本技术 稳定的vamp报告子检测 (Stable VAMP report son detection ) 是由 巴兹贝克·达夫列托夫 安德鲁·亚历山大·佩登 亚历山大·米卡埃尔·鲁道夫·鲁斯特 席亚拉·路易 于 2018-02-14 设计创作，主要内容包括：本申请提供了一种多肽,其包含具有荧光素酶活性的N-末端多肽结构域和具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的C-末端多肽结构域,其中VAMP代表囊泡相关膜蛋白。还提供了相应的核酸分子、表达载体和遗传修饰的细胞。本发明还提供了这些的方法和用途。(This application provides a kind of polypeptides, it includes the N- terminal polypeptide structural domain with uciferase activity and have the active C- terminal polypeptide structural domain of VAMP1, VAMP2 or VAMP3, wherein VAMP represents vesicle-associated membrane albumen.Additionally provide the cell of corresponding nucleic acid molecules, expression vector and genetic modification.The present invention also provides these method and purposes.)

稳定的VAMP报告子检测

本申请提供了一种多肽，其包含具有荧光素酶活性的N-末端多肽结构域和具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的C-末端多肽结构域，其中VAMP代表囊泡相关膜蛋白。还提供了相应的核酸分子、表达载体和遗传修饰的细胞。本发明还提供了这些的方法和用途。

背景技术

破伤风是由破伤风梭菌(Clostridium tetani)引起的急性毒素介导的疾病。在有利的厌氧条件下，例如在坏死的伤口中，这种无处不在的杆菌可以产生破伤风毒素——一种非常强效的神经毒素。破伤风神经毒素(本文也称为“TeNT”或“TNx”)阻断中枢神经系统中的抑制性神经传递，导致特征性肌肉僵硬和痉挛(1)。即使有现代化重症监护，病死率也很高(高达80％)。

破伤风神经毒素和相关的肉毒杆菌神经毒素(BoNT)是大型多结构域蛋白，主要由于它们与神经元特异性神经节苷脂和蛋白质的相互作用而以高亲合力结合神经元(1,5)。该结合由50kDa的结合结构域介导，该结合结构域在结构上与效应部分分开。在神经元结合后，神经毒素被内化到内吞囊泡中，由于酸化，它们在内吞囊泡中经历构象变化。这种pH引发的结构变化使得蛋白酶(也称为轻链)释放到蛋白水解靶标所在的胞质溶胶中。具体的蛋白水解靶标将取决于具体的神经毒素，其中破伤风神经毒素、B型肉毒杆菌神经毒素、D型肉毒杆菌神经毒素、F型肉毒杆菌神经毒素和G型肉毒杆菌神经毒素均裂解囊泡相关膜蛋白(VAMP)1、2和3(尽管在不同的裂解位点)。

VAMP1、2和3对于神经传递是必需的，它们的裂解导致神经递质分泌的阻断，这可能导致死亡(1,5)。例如，VAMP2的裂解导致神经递质释放的强效阻断，随后发生神经肌肉麻痹。不幸的是，裂解的VAMP2很快被未知的神经元内机制降解，因此几乎不可能检测到裂解的VAMP2分子。

在人和受监管的动物中，通过用含有破伤风类毒素(一种去毒形式的TeNT)的疫苗进行免疫来预防破伤风。破伤风类毒素由TeNT制备，通过用甲醛将其去毒，而不破坏其免疫特性。破伤风疫苗的生产包括(i)TeNT的生产、(ii)TeNT的化学灭活和(iii)检测残留的TeNT活性(2)。生产方法使得类毒素不应恢复到毒素。

在破伤风疫苗的生产过程中，残留神经毒素活性的检测是必不可少的。几十年来，用于评估破伤风产品安全性的传统工具几乎没有变化，评估仍然依赖于啮齿动物生物测定，其中致死效应与神经肌肉麻痹相关。根据WHO指南，每个新的类毒素批次必须在豚鼠或小鼠中进行残留TeNT麻痹活性检测(2)。动物安全性检测是昂贵、费力且耗时的(3,4)。即使在疫苗生产之后，还要对破伤风疫苗的储存特性进行另外的啮齿动物生物测定，以确定可能的TeNT活性逆转。考虑到WHO最近宣布了其目标：人类完全抗破伤风覆盖率达到80亿，需要新的、先进的且更有效的方法来生产和评估破伤风类毒素。

尽管用破伤风类毒素进行泛人类(pan-human)免疫已经达到了WHO的目标，但是许多家养动物不仅针对破伤风而且还针对D型肉毒杆菌进行了常规免疫(6)。肉毒杆菌疫苗还必须在开发过程中进行测试，以确定是否存在任何残留的神经毒素活性。对于破伤风疫苗，通常使用啮齿动物生物测定来评估肉毒杆菌疫苗的安全性。

需要新的动物替代测定来检测破伤风类毒素和肉毒杆菌类毒素的残留神经毒素活性。此外，B型肉毒杆菌神经毒素是一种受批准的药物，需要对其效力进行检测。一般认为，动物替代测定应说明神经毒素作用的所有三个步骤：细胞表面结合、内在化和底物(例如VAMP2)裂解。迄今为止，两个主要问题阻碍了这种基于细胞的检测方法的发展：缺乏能与破伤风神经毒素和肉毒杆菌神经毒素牢固结合的连续细胞系，以及裂解产物的快速降解(因此无法检测神经毒素作用的产物)。

发明内容

发明人开发了一种新型报告分子，其包含具有荧光素酶活性的N-末端多肽结构域和具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的C-末端多肽结构域。该报告分子能够被破伤风神经毒素、B型肉毒杆菌神经毒素、D型肉毒杆菌神经毒素、F型肉毒杆菌神经毒素和/或G型肉毒杆菌神经毒素(及其修饰形式，包括保留神经毒素活性的嵌合体)裂解。报告分子的裂解产生两种裂解产物；第一片段，其包含具有荧光素酶活性的N-末端多肽结构域和具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的多肽结构域的一部分；和第二片段，其包含具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的多肽结构域的剩余部分。令人惊讶的是，具有荧光素酶活性的N-末端多肽结构域降低或阻止第一片段的细胞内降解。有利地，该新型报告分子因此提供了用于定量测量神经毒素活性的新机制。

本发明人通过生成一种新型核酸分子来举例说明了本发明，所述核酸分子编码一种新型报告分子，所述报告分子包含与C-末端VAMP2多肽连接的N-末端荧光素酶多肽。该核酸分子在遗传修饰的SiMa神经母细胞瘤细胞系中表达。将细胞在合适的肉毒杆菌神经毒素或破伤风神经毒素的存在下培养，并研究所述报告分子的神经毒素诱导的裂解。令人惊讶的是，由于裂解产物的降解降低，可以定量检测神经毒素诱导的新型报告分子的裂解。

VAMP1、VAMP2和VAMP3的功能、结构和神经毒素裂解位点非常相似且高度保守。因此，尽管使用包含C-末端VAMP2多肽结构域(即，具有VAMP2活性的多肽结构域)的新型报告构建体举例说明了本发明，但本发明同样适用于其中具有VAMP2活性的多肽结构域被替换为具有VAMP1活性或VAMP3活性的多肽结构域的报告构建体。

本文还提供了编码此类多肽的核酸分子和表达载体。核酸分子和/或表达载体可以存在于任何合适的宿主细胞(即，遗传修饰的细胞)内。

在一个方面，本发明提供了一种多肽，其包含具有荧光素酶活性的N-末端多肽结构域和具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的C-末端多肽结构域。

合适地，具有VAMP2活性的多肽结构域包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或其保守氨基酸序列变体。

合适地，具有VAMP1活性的多肽结构域包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或其保守氨基酸序列变体。

合适地，具有VAMP3活性的多肽结构域包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：3的氨基酸序列，或其保守氨基酸序列变体。

合适地，具有荧光素酶活性的多肽结构域包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或其保守氨基酸序列变体。

在一个方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码根据本发明所述的多肽。

在一个方面，本发明提供了一种表达载体，其包含根据本发明所述的核酸分子。

在一个方面，本发明提供了一种遗传修饰的细胞，其包含根据本发明所述的核酸分子或根据本发明所述的表达载体。

合适地，所述遗传修饰的细胞选自由以下组成的组：SiMa神经母细胞瘤细胞、LAN5神经母细胞瘤细胞、NG108神经母细胞瘤细胞、永生化神经元和原代神经元。

在一个方面，本发明提供了根据本发明所述的多肽、核酸分子、表达载体或遗传修饰的细胞用于检测神经毒素活性的用途，其中所述神经毒素活性选自由以下组成的组：破伤风神经毒素活性、B型肉毒杆菌神经毒素活性、D型肉毒杆菌神经毒素活性、F型肉毒杆菌神经毒素活性和G型肉毒杆菌神经毒素活性，或其任意组合。

合适地，在包含药物产品、食物样品、临床样品、环境样品或其任意组合的测试样品中检测神经毒素活性。

合适地，在包含破伤风类毒素或肉毒杆菌类毒素或其组合的测试样品中检测神经毒素活性。

合适地，在包含破伤风神经毒素、B型肉毒杆菌神经毒素、D型肉毒杆菌神经毒素、F型肉毒杆菌神经毒素或G型肉毒杆菌神经毒素或其任意组合的测试样品中检测神经毒素活性。测试样品可包含天然存在的(一种或多种)神经毒素和/或其修饰的(例如人工修饰的，包括嵌合体)形式。

在一个方面，本发明提供了一种检测测试样品中神经毒素活性的方法，所述方法包括：

(a)在以下条件下培养根据本发明所述的遗传修饰的细胞，所述条件允许表达包含具有荧光素酶活性的N-末端多肽结构域和具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的C-末端多肽的多肽；

(b)在以下条件下在测试样品的存在下培养(a)的细胞，所述条件允许包含具有荧光素酶活性的N-末端多肽结构域和具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的C-末端多肽的多肽的神经毒素诱导的裂解；和

(c)确定所述多肽的神经毒素诱导的裂解的水平，其中所述多肽的神经毒素诱导的裂解的检测指示神经毒素活性；

其中所述神经毒素活性选自由以下组成的组：破伤风神经毒素活性、B型肉毒杆菌神经毒素活性、D型肉毒杆菌神经毒素活性、F型肉毒杆菌神经毒素活性和G型肉毒杆菌神经毒素活性，或其任意组合。

合适地，培养步骤(a)和(b)同时进行。

合适地，在培养基中提供测试样品。

合适地，通过ELISA、免疫印迹或活细胞成像检测所述多肽的神经毒素诱导的裂解。

合适地，测试样品包括药物产品、食物样品、临床样品、环境样品或其任意组合。

合适地，测试样品包含破伤风类毒素或肉毒杆菌类毒素，或其组合。

合适地，测试样品包含破伤风神经毒素、B型肉毒杆菌神经毒素、D型肉毒杆菌神经毒素、F型肉毒杆菌神经毒素或G型肉毒杆菌神经毒素或其任意组合。测试样品可包含天然存在的(一种或多种)神经毒素和/或其修饰的(例如人工修饰的，包括嵌合体)形式。

在一个方面，本发明提供了一种用于检测神经毒素活性的试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)编码多肽的核酸分子，所述多肽包含具有荧光素酶活性的N-末端多肽结构域和具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的C-末端多肽结构域；和

(b)用于检测神经毒素活性的阳性对照，其中所述阳性对照能够裂解由(a)的核酸分子编码的多肽。

神经毒素活性可选自由以下组成的组：破伤风神经毒素活性、B型肉毒杆菌神经毒素活性、D型肉毒杆菌神经毒素活性、F型肉毒杆菌神经毒素活性和G型肉毒杆菌神经毒素活性。

合适地，核酸分子是表达载体的一部分。

合适地，核酸分子在遗传修饰的细胞内。

合适地，所述遗传修饰的细胞选自由以下组成的组：遗传修饰的SiMa神经母细胞瘤细胞、LAN5神经母细胞瘤细胞、NG108神经母细胞瘤细胞、永生化神经元和原代神经元。

合适地，所述试剂盒还包含用于检测荧光素酶活性的试剂。

在本说明书的整个说明书和权利要求书中，词语“包含”和“含有”及其变体意指“包括但不限于”，并且它们不旨在(并且不)排除其他部分、添加物、组分、整体或步骤。

在本说明书的整个说明书和权利要求书中，除非上下文另有要求，否则单数形式包含复数形式。特别地，在使用不定冠词的情况下，除非上下文另有要求，否则说明书应被理解为考虑多个以及单个(singularity)。

结合本发明的特定方面、实施方案或实施例描述的特征、整体、特点、化合物、化学部分或组应理解为适用于本文描述的任何其他方面、实施方案或实施例，除非与其不相容。

本文提及的专利、科学和技术文献确定了在提交时本领域技术人员可获得的知识。所公开的专利、公开和未决的专利申请以及本文引用的其他出版物的全部公开内容通过引用并入本文，其程度如同每个被具体且单独地指明通过引用并入。在任何不一致的情况下，以本公开为准。

下面进一步详细描述本发明的各个方面。

附图说明

在下文中参考附图进一步描述本发明的实施方案，其中：

图1示出了图A：绿色荧光蛋白(GFP)-VAMP2构建体，其被***到指定的病毒载体中以感染细胞。图B：在嘌呤霉素选择后神经母细胞瘤细胞表现出强GFP-VAMP2表达。示出了明场和GFP荧光图像。图C：在表达与mCherry蛋白融合的破伤风轻链后(右下)，定位于囊泡结构的GFP-VAMP2(顶部)可释放到胞质溶胶中(左下)。图D：可以使用GFP抗体通过常规免疫印迹检测到稳定的裂解的GFP-VAMP2产物。

图2示出了永生化小鼠神经元对D型肉毒杆菌神经毒素敏感，如由裂解的GFP-VAMP2产物的出现所证明的。请注意毒素敏感细胞中GFP-VAMP2的裂解(印迹)和GFP-VAMP2的胞质溶胶转移(右图)。

图3示出了VAMP2与过氧化物酶APEX2(APX2)和荧光素酶(NanoLuc)的融合体在病毒转导的SiMa神经母细胞瘤细胞中以稳定的形式表达；两种构建体均携带HA标签(用于免疫印迹，左图)。融合蛋白定位于囊状结构，如使用HA标签免疫染色所揭示的(右图)。

图4示出了经工程改造以携带NanoLuc-VAMP2报告分子的SiMa神经母细胞瘤细胞在用10nM B型和D型肉毒杆菌神经毒素处理48小时后表现出裂解。APEX2-VAMP报告分子对肉毒杆菌裂解具有抗性。使用总VAMP2抗体通过免疫印迹记录了裂解的VAMP2产物的出现。与B型肉毒杆菌裂解的产物相比，D型肉毒杆菌裂解的产物明显更快的迁移，这与VAMP在Lys59位置而不是Gln76裂解一致。

图5示出了用BoNT B和D(nM)滴定后的免疫印迹，揭示SiMa细胞对BoNT/B的敏感性高于BoNT/D。使用抗VAMP2抗体的检测显示BoNT/B的裂解低至1nM，BoNT/D的裂解低至10nM。使用高度特异性的BoNT/B裂解的VAMP2和BoNT/D裂解的VAMP2抗体进行检测显示，BoNT/B的裂解低至300pM，BoNT/D的裂解低至10nM。分别针对肽ALQAGASQ和肽KVLERDQK生成了抗BoNT/B裂解的VAMP2和抗BoNT/D裂解的VAMP2抗体。

图6示出了免疫印迹和NanoLuc ELISA测定之间的灵敏度比较，两种技术之间具有类似的EC₅₀。但是，NanoLuc测定显示出更高的灵敏度，检测低至30pM的BoNT/B裂解VAMP的能力高于基线(右图)。NanoLuc ELISA测定涉及将肉毒杆菌裂解的NanoLuc-VAMP产物捕获在微板上，所述微板携带高特异性的BoNT裂解的VAMP2的抗体，随后在微板光度计上读取发光读数。

图7示出了免疫印迹、NanoLuc测定均可用于检测破伤风毒素对VAMP2的裂解，但是，在SiMa神经母细胞瘤细胞的敏感性低于BoNT/B和BoNT/D。

图8提供了人VAMP1的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。人VAMP1的氨基酸40至118标有下划线(SEQ ID NO：7)。

图9提供了人VAMP2的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。人VAMP2的氨基酸38至116标有下划线(SEQ ID NO：8)。

图10提供了人VAMP3的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。人VAMP3的氨基酸21至100标有下划线(SEQ ID NO：9)。

图11提供了NanoLuc的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。

图12提供了HA-APEX-VAMP2构建体的核酸序列(SEQ ID NO：5)。

图13提供了HA-NanoLuc-VAMP2的核酸序列(SEQ ID NO：6)。

图14示出了表达Nanoluc-VAMP2的细胞可用于区分BoNT/B的新合成形式(在此将其命名为I-IV)的效力。在应用指定范围(nM)的BoNT/B制剂I-IV 65小时后，免疫印迹显示出不同程度的Nanoluc-VAMP2裂解。使用裂解的VAMP2的抗体(其是针对肽ALQAGASQ生成的)进行检测。抗SNAP25抗体用作上样对照。

图15示出了人VAMP1的氨基酸40至118(SEQ ID NO：7)(在本文中也称为VAMP1的核心氨基酸序列)。

图16示出了人VAMP2的氨基酸38至116(SEQ ID NO：8)(在本文中也称为VAMP2的核心氨基酸序列)。

图17示出了人VAMP3的氨基酸21至100(SEQ ID NO：9)(在本文中也称为VAMP3的核心氨基酸序列)。

具体实施方式

几十年来，一直强烈希望用能够对破伤风和/或肉毒杆菌神经毒素作用中的所有关键步骤进行敏感评估的体外试验替代繁琐的动物试验。理论认为，连续细胞系缺乏开发可以替代小鼠生物测定的测定所必需的敏感性，但同时，使用原代神经元或源自胚胎细胞的神经元面临着自身的挑战，因为它们必须是从动物组织中新鲜获得，或者它们需要复杂的操作流程和数周/数月才能完全分化。使用SiMa神经母细胞瘤细胞系测量A型肉毒杆菌神经毒素的SNAP25裂解活性的第一个基于细胞的效力测定法优于(EC50～1U/孔)小鼠生物测定法(11)。然而，由于VAMP裂解产物的快速降解，开发一种用于测量破伤风和/或肉毒杆菌神经毒素的VAMP裂解活性的等效测定法具有挑战性。

发明人现在开发了一种新型报告分子，其包含具有荧光素酶活性的N-末端多肽结构域和具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的C-末端多肽结构域。报告分子能够被破伤风神经毒素、B型肉毒杆菌神经毒素、D型肉毒杆菌神经毒素、F型肉毒杆菌神经毒素和/或G型肉毒杆菌神经毒素(及其修饰形式，包括保留神经毒素活性的嵌合体)裂解。报告分子的裂解产生两种裂解产物；第一片段，其包含具有荧光素酶活性的N-末端多肽结构域和具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的多肽结构域的一部分；和第二片段，其包含具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的多肽结构域的剩余部分。令人惊讶的是，具有荧光素酶活性的N-末端多肽结构域降低或阻止第一片段的降解。有利地，该新型报告分子因此提供了用于定量测量神经毒素活性的新机制。预期使用这种新型报告分子(例如，在使用永生化神经元细胞系的基于细胞的测定法中)可加速肉毒杆菌疫苗和破伤风疫苗的生产，并促进治疗性肉毒杆菌毒素产品的检测和肉毒杆菌的诊断性检测。

通过本发明实用性的另一个实例，表明表达Nanoluc-VAMP2的细胞可用于区分BoNT/B新合成形式的效力(参见图14)。

多肽

提供了一种多肽，其包含具有荧光素酶活性的N-末端多肽结构域和具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的C-末端多肽结构域。

术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。

术语多肽“结构域”是指多肽序列的一部分，其可以独立于多肽链的其余部分进化、发挥功能和存在。通常，多肽内的每个结构域可以形成紧凑的三维结构，并且通常可以独立地稳定和折叠。本公开内容中的多肽“结构域”的实例是具有荧光素酶活性的结构域、具有VAMP1活性的结构域、具有VAMP2活性的结构域或具有VAMP3活性的结构域。

蛋白质的N-末端(N-terminus)(也称为氨基末端、NH₂-末端、N-末端(N-terminalend)或胺基末端)是以具有游离胺基(-NH₂)的氨基酸终止的蛋白质或多肽的起始端。按照惯例，肽序列从N-末端到C-末端(从左到右)书写。C-末端(C-terminus)(也称为羧基末端(carboxyl-terminus)、羧基末端(carboxy-terminus)、C-末端尾部(C-terminal tail)、C-末端(C-terminal end)或COOH-末端)是以游离羧基(-COOH)终止的氨基酸链(蛋白质或多肽)的末端。

如本文所用，术语“N-末端”和“C-末端”用于描述例如结构域在多肽内的相对位置。因此，“N-末端”结构域的位置距离多肽的N-末端比距离C-末端更近(相对而言)。相反，“C-末端”结构域的位置(相对而言)距离多肽的C-末端比距离N-末端更近。如本文所用，术语“位置(positioned)”是指例如结构域在多肽的线性氨基酸序列内的位点。

术语“N-末端”和“C-末端”可用于描述两个或更多个结构域在多肽内的相对位置。在本文中，“N-末端”结构域的位置比“C-末端”结构域更靠近(相对而言)多肽的N-末端。相反，“C-末端”结构域的位置比“N-末端”结构域更靠近(相对而言)多肽的C-末端。

“N-末端”结构域可以但不一定必须位于多肽的N-末端(也就是说，它可以但不一定必须位于以具有游离胺基的氨基酸终止的多肽的起始端)。换句话说，N-末端结构域的第一个氨基酸不需要是(但是可以是)多肽的第一个氨基酸。这意味着，在多肽的N-末端和“N-末端”结构域的起始端之间可能存在其他氨基酸、多肽结构域(例如标签，例如HA标签)等(只要该结构域的位置距离多肽的N-末端比距离C-末端更近；或者，当用于描述两个或更多个结构域的相对位置时，只要该结构域的位置比“C-末端”结构域更靠近N-末端)。

同样，“C-末端”结构域可以但不一定必须位于多肽的C-末端(也就是说，它可以但不一定必须位于以具有游离羧基的任意氨基酸终止的多肽的末端)。换句话说，C-末端结构域的最后一个氨基酸不需要是(但是可以是)多肽的最后一个氨基酸。这意味着，在多肽的C-末端和“C-末端”结构域的末端之间可能还存在其他氨基酸、多肽结构域等(例如标签)(只要该结构域的位置距离多肽的C-末端比距离N-末端更近；或者，当用于描述两个或更多个结构域的相对位置时，只要该结构域的位置比“N-末端”结构域更靠近C-末端)。

包含N-末端多肽结构域(A)和C-末端多肽结构域(B)的多肽通常被写为A-B，即从N-末端到C-末端(从左到右)。举例来说，包含N-末端酶荧光素酶(例如NanoLuc或“Nluc”)结构域和C-末端VAMP2结构域的多肽通常被写做Nluc-VAMP2(或NlucVAMP2)。

举例来说，本发明的多肽可以在具有荧光素酶活性的多肽结构域的N-末端包含HA标签。其他合适的标签在本领域中是众所周知的，并且可以附加地或替代地使用。

在具有荧光素酶活性的结构域和具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的结构域之间还可以存在接头(linker)，例如可以使用脯氨酸甘氨酸接头。其他合适的接头在本领域中是众所周知的，并且可以附加地或替代地使用。

本文提供的多肽包含具有酶促荧光素酶活性的N-末端多肽结构域。

具有“荧光素酶活性”的多肽结构域是指保留了荧光素酶的功能活性的多肽结构域，即，其能够通过氧化光子发射底物(如荧光素和furimazine)而产生生物发光[ACS Chem Biol.2012Nov 16；7(11):1848–1857‘Engineered Luciferase Reporter from a DeepSea Shrimp Utilizing a Novel Imidazopyrazinone Substrate’Hall等人]。如本文所用，具有“萤光素酶活性”的多肽包括来自萤光素酶类别的氧化酶(其通过氧化萤光素或furimazine而产生生物发光)的任何多肽(即，其包括任何功能性萤光素酶)。本领域技术人员使用本领域已知的常规实验很容易知道如何鉴定具有荧光素酶活性的多肽结构域。[Beyond D-luciferin:Expanding the Scope of Bioluminescence Imaging invivo.Spencer T.Adams,Jr.,Stephen C.Miller Curr Opin Chem Biol.2014；0:112–120]中总结了适用于鉴定功能性萤光素酶的实验。

在一个实施方案中，具有萤光素酶活性的多肽结构域包含SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列，或其功能变体(或功能片段)。此类变体可以是SEQ ID NO：4的天然存在的功能变体(例如，等位基因功能变体)、合成的功能变体或合成改进的功能变体。术语“变体”还涵盖同源物。

功能变体通常仅包含SEQ ID NO：4的一个或多个氨基酸的保守取代，或蛋白的非关键区域中的非关键氨基酸的取代、缺失或***。因此，SEQ ID NO：4的功能变体可以是SEQID NO：4的保守氨基酸序列变体，其中该变体具有萤光素酶活性。

非功能变体是不具有萤光素酶活性的SEQ ID NO：4的氨基酸序列变体。非功能变体通常含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的非保守取代、缺失或***或过早截短(prematuretruncation)或关键氨基酸或关键区域的取代、***或缺失。用于鉴定功能性和非功能性变体(例如功能性和非功能性等位基因变体)的方法是本领域普通技术人员所熟知的。

[Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing anovel imidazopyrazinone substrate.Hall MP,Unch J,Binkowski BF,Valley MP,Butler BL,Wood MG,Otto P,Zimmerman K,Vidugiris G,Machleidt T,Robers MB,BeninkHA,Eggers CT,Slater MR,Meisenheimer PL,Klaubert DH,Fan F,Encell LP,WoodKV.ACS Chem Biol.2012,7(11):1848-57]中提供了荧光素酶中关键和非关键氨基酸的总结。因此，本领域技术人员将能够很容易地鉴定可以被取代的氨基酸以提供SEQ ID NO：4的功能变体(或功能片段)，例如保守氨基酸序列变体。本领域普通技术人员还可以使用标准序列比对程序很容易地确定SEQ ID NO：4的同源物。

具有荧光素酶活性的多肽可以包括与SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其部分或片段具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。合适地，同一性百分比可以计算为与参考序列(例如SEQ ID NO：4)的整个长度或其部分或片段的同一性的百分比。

SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列是荧光素酶NanoLuc(由Promega销售)的氨基酸序列。术语“NanoLuc”和“NLuc”在本文中可互换使用。关于NanoLuc荧光素酶的更多细节可见Hall等人,ACS chem Biol 2012,7,第1848页至第1857页。

合适的萤光素酶的替代实例包括来自萤火虫Photinus pyralis的萤火虫萤光素酶(FLuc；EC 1.13.12.7)。萤火虫萤光素酶是一种球蛋白，其可以利用ATP和分子氧来催化萤光素的氧合作用，从而产生氧化萤光素(oxyluciferin)，这是一种高度不稳定的单线态激发化合物，在弛豫至基态时会发光。多种其他生物在各种发光反应中使用不同的萤光素酶来调节其光产生(例如南瓜灯蘑菇Omphalotus olearius、几种海洋生物例如海肾(seapansy)(Renilla reniformis，带有萤光素酶海肾荧光素2单加氧酶(Renilla-luciferin2-monooxygenase)；RLuc)和鞭毛藻类的萤光素酶)。萤光素酶的其他实例包括修饰的萤火虫萤光素酶(Ultra-Glo；源自Photuris pennysylvanica)、叩头虫萤光素酶(CBLuc；源自Pyrophorus plagiophthalamus)、桡足类甲壳动物萤光素酶(GLuc；源自Gaussiaprinceps)和介形亚纲甲壳动物荧光素酶(CLuc；源自Cypridina noctiluca)。本领域中常用的不同荧光素酶的综述可见Thorne等人,Chem Biol.2010Jun 25；17(6)；646-657。

本文提供的多肽还包含具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的C-末端多肽结构域。

如本文所用，“具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性”的多肽结构域是指能够作为VAMP1、VAMP2或VAMP3蛋白起作用的多肽结构部。

VAMP涵盖以C-末端整合膜(integral membrane)结构域为特征的蛋白质家族。N-末端(氨基酸1-90或更多，取决于同种型和物种)面向胞质溶胶，并且包含SNARE基序，用于与SNAP-25和突触融合蛋白(syntaxin)相互作用。所有VAMP都参与膜融合过程。VAMP通过其N-末端链与突触融合蛋白和SNAP-25家族成员相互作用，形成融合核心或SNARE复合物，作为胞吐作用的必要条件。在分析VAMP敲除动物模型时，已经证明了VAMP对囊泡融合的基本作用。

VAMP1和VAMP2被称为小突触囊泡蛋白(synaptobrevin)，并且在脑、脊髓和外周神经元中表达。它们是突触小泡的组成成分，它们在突触小泡中参与神经递质的释放。VAMP3(也被称为小细胞小泡蛋白(cellubrevin))普遍表达，并作为分泌颗粒和分泌囊泡的组成成分参与调节型胞吐作用和组成型胞吐作用[Nature Reviews Molecular Cell Biology2,98-106(February 2001)‘SNARE-mediated membrane fusion’Y.A.Chen&R.H.Scheller]。

VAMP1、VAMP2和VAMP3都是破伤风神经毒素(TeNT)、B型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/B)、D型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/D)、F型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/F)和G型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/G)的已知底物。神经毒素在保守的裂解位点序列处裂解VAMP1、VAMP2和VAMP3底物，如下表1所示。

表1

具有“VAMP1活性”的多肽结构域是指一种多肽结构域，其(i)保留了VAMP1的功能活性，也就是说，它存在于囊泡中，并且能够形成SNARE复合物，并且(ii)能够被破伤风神经毒素(TeNT)、B型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/B)、D型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/D)、F型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/F)和G型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/G)中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或至少全部裂解。

本领域技术人员使用本领域已知的常规实验很容易知道如何鉴定具有囊泡相关VAMP1活性的多肽结构域。[Identification of a minimal core of the synaptic SNARE complex sufficient for reversible assembly and disassembly.Fasshauer D,Eliason WK,Brünger AT,Jahn R.Biochemistry.1998Jul 21；37(29):10354-62.]以及[Vesicular restriction of synaptobrevin suggests a role for calcium inmembrane fusion.Hu K,Carroll J,Fedorovich S,Rickman C,Sukhodub A,DavletovB.Nature.2002Feb 7；415(6872):646-50]中总结了适用于鉴定功能性VAMP1的实验。

本领域技术人员使用本领域已知的常规实验还很容易知道如何鉴定能够被破伤风神经毒素(TeNT)、B型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/B)、D型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/D)、F型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/F)和G型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/G)中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或至少全部裂解的多肽结构域。[Specificity of botulinum protease for human VAMP family proteins.Yamamoto H,等人Microbiol Immunol,2012Apr.PMID22289120]中总结了适用于鉴定能够如上所述被裂解的多肽结构域的实验。此外，表1中提供了VAMP1的适当裂解位点序列的充分指导。在多肽结构域中存在一个(或多个)这些保守的裂解位点序列也可以表明它能够被破伤风神经毒素(TeNT)、B型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/B)、D型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/D)、F型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/F)和/或G型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/G)在适当时裂解。

在一个实施方案中，具有VAMP1活性的多肽结构域包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列，或其功能变体(或功能片段)。此类变体可以是SEQ ID NO：1的天然存在的功能变体(例如，等位基因功能变体)、合成的功能变体或合成改进的功能变体。术语“变体”还涵盖同源物。

在一个实施方案中，具有VAMP1活性的多肽结构域包含SEQ ID NO：1的氨基酸40至118，或其功能变体(或功能片段)。此类变体可以是SEQ ID NO：1的天然存在的功能变体(例如，等位基因变功能变体)、合成的功能变体或合成改进的功能变体。术语“变体”还涵盖同源物。

SEQ ID NO：1的氨基酸40至118代表用于BoNT相互作用和裂解的核心VAMP1氨基酸序列(氨基酸40至118在本文中也称为SEQ ID NO：7，并且显示于图8(仅标下划线的氨基酸)和图15中)。VAMP1氨基酸序列、BoNT相互作用和裂解位点是本领域熟知的(参见例如Yamamoto H,Ida T,Tsutsuki H,Mori M,Matsumoto T,Kohda T,Mukamoto M,Goshima N,Kozaki S,Ihara H.Microbiol Immunol.2012Apr；56(4):245-53)。因此，本领域技术人员也可以很容易地确定具有VAMP1活性的其他合适的多肽结构域。

功能变体通常仅包含SEQ ID NO：1的一个或多个氨基酸的保守取代，或蛋白的非关键区域中的非关键氨基酸的取代、缺失或***。因此，SEQ ID NO：1的功能变体可以是SEQID NO：1的保守氨基酸序列变体，其中该变体具有VAMP1活性。

非功能变体是不具有VAMP1活性的SEQ ID NO：1的氨基酸序列变体。非功能变体通常含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的非保守取代、缺失或***或过早截短(prematuretruncation)或关键氨基酸或关键区域的取代、***或缺失。用于鉴定功能性和非功能性变体(例如功能性和非功能性等位基因变体)的方法是本领域普通技术人员所熟知的。

[Proc Natl Acad Sci U S A.1998Dec 22；95(26):15781-6.Conservedstructural features of the synaptic fusion complex:SNARE proteinsreclassified as Q-and R-SNAREs.Fasshauer D,Sutton RB,Brunger AT,Jahn R]中提供了VAMP1中关键和非关键氨基酸的概述。因此，本领域技术人员将能够很容易地鉴定可以被取代的氨基酸以提供SEQ ID NO：1的功能变体(或功能片段)，例如保守氨基酸序列变体。本领域普通技术人员还可以使用标准序列比对程序很容易地鉴定SEQ ID NO：1的同源物。

具有VAMP1活性的多肽可以包括与SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其部分或片段具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。合适地，同一性百分比可以计算为与参考序列(例如SEQ ID NO：1)的整个长度或其部分或片段的同一性的百分比。

SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列是天然存在的人VAMP1的氨基酸序列。关于人VAMP1的更多细节可见[Specificity of botulinum protease for human VAMP familyproteins.Yamamoto H,等人Microbiol Immunol,2012Apr.PMID22289120]。

具有“VAMP2活性”的多肽结构域是指一种多肽结构域，其(i)保留了VAMP2的功能活性，即，它存在于囊泡中，并且能够形成SNARE复合物，并且(ii)能够被破伤风神经毒素(TeNT)、B型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/B)、D型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/D)、F型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/F)和G型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/G)中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或至少全部裂解。

本领域技术人员使用本领域已知的常规实验很容易知道如何鉴定具有囊泡相关VAMP2活性的多肽结构域。J Biol Chem.1999May 28；274(22):15440-6.Mixed and non-cognate SNARE complexes.Characterization of assembly and biophysicalproperties.Fasshauer D,Antonin W,Margittai M,Pabst S,Jahn R.]以及[Nature.2002.Feb 7；415(6872):646-50.Vesicular restriction of synaptobrevinsuggests a role for calcium in membrane fusion.Hu K,Carroll J,Fedorovich S,Rickman C,Sukhodub A,Daveltov B.]中总结了适用于鉴定功能性VAMP2的实验。

本领域技术人员使用本领域已知的常规实验还很容易知道如何鉴定能够被破伤风神经毒素(TeNT)、B型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/B)、D型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/D)、F型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/F)和G型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/G)中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或至少全部裂解的多肽结构域。[Specificity of botulinum proteasefor human VAMP family proteins.Yamamoto H,等人Microbiol Immunol,2012Apr.PMID22289120]中总结了用于鉴定能够如上所述被裂解的多肽结构域的合适实验。此外，表1中提供了VAMP2的适当裂解位点序列的充分指导。在多肽结构域中存在一个(或多个)这些保守的裂解位点序列也可以表明它能够被破伤风神经毒素(TeNT)、B型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/B)、D型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/D)、F型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/F)和/或G型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/G)(视情况而定)裂解。

在一个实施方案中，具有VAMP2活性的多肽结构域包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，或其功能变体(或功能片段)。此类变体可以是SEQ ID NO：2的天然存在的功能变体(例如，等位基因功能变体)、合成的功能变体或合成改进的功能变体。术语“变体”还涵盖同源物。

在一个实施方案中，具有VAMP2活性的多肽结构域包含SEQ ID NO：2的氨基酸38至116，或其功能变体(或功能片段)。此类变体可以是SEQ ID NO：2的天然存在的功能变体(例如，等位基因功能变体)、合成的功能变体或合成改进的功能变体。术语“变体”还涵盖同源物。

SEQ ID NO：2的氨基酸38至116代表用于BoNT相互作用和裂解的核心VAMP2氨基酸序列(氨基酸38至116在本文中也称为SEQ ID NO：8，并且显示于图9(仅标下划线的氨基酸)和图16中)。VAMP2氨基酸序列、BoNT相互作用和裂解位点是本领域熟知的(参见例如Yamamoto H,Ida T,Tsutsuki H,Mori M,Matsumoto T,Kohda T,Mukamoto M,Goshima N,Kozaki S,Ihara H.Microbiol Immunol.2012Apr；56(4):245-53)。因此，本领域技术人员也可以很容易地确定具有VAMP2活性的其他合适的多肽结构域。

功能变体通常仅包含SEQ ID NO：2的一个或多个氨基酸的保守取代，或蛋白的非关键区域中的非关键氨基酸的取代、缺失或***。因此，SEQ ID NO：2的功能变体可以是SEQID NO：2的保守氨基酸序列变体，其中该变体具有VAMP2活性。

非功能变体是不具有VAMP2活性的SEQ ID NO：2的氨基酸序列变体。非功能变体通常含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的非保守取代、缺失或***或过早截短(prematuretruncation)或关键氨基酸或关键区域的取代、***或缺失。用于鉴定功能性和非功能性变体(例如功能性和非功能性等位基因变体)的方法是本领域普通技术人员所熟知的。

[Proc Natl Acad Sci U S A.1998Dec 22；95(26):15781-6.Conservedstructural features of the synaptic fusion complex:SNARE proteinsreclassified as Q-and R-SNAREs.Fasshauer D,Sutton RB,Brunger AT,Jahn R]和[Proc Natl Acad Sci U S A.2006May 30；103(22):8378-83.Conformation of thesynaptobrevin transmembrane domain.Bowen M,Brunger AT.]中提供了囊泡相关VAMP2中关键和非关键氨基酸的总结。因此，本领域技术人员将能够很容易地鉴定可以被取代的氨基酸以提供SEQ ID NO：2的功能变体(或功能片段)，例如保守氨基酸序列变体。本领域普通技术人员还可以使用标准序列比对程序很容易地鉴定SEQ ID NO：2的同源物。

具有VAMP2活性的多肽可以包括与SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其部分或片段具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。合适地，同一性百分比可以计算为与参考序列(例如SEQ ID NO：2)的整个长度或其部分或片段的同一性的百分比。

SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列是天然存在的人VAMP2的氨基酸序列。关于人VAMP2的更多细节可见[Substrate recognition of VAMP-2by botulinum neurotoxin Band tetanus neurotoxin.Chen S,等人J Biol Chem,2008Jul 25.PMID 18511417]。

具有“VAMP3活性”的多肽结构域是指一种多肽结构域，其(i)保留了VAMP3的功能活性，也就是说，它存在于囊泡中，并且能够形成SNARE复合物，并且(ii)能够被破伤风神经毒素(TeNT)、B型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/B)、D型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/D)、F型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/F)和G型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/G)中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或至少全部裂解。

本领域技术人员使用本领域已知的常规实验很容易知道如何鉴定具有VAMP3活性的多肽结构域。[J Biol Chem.1999May 28；274(22):15440-6.Mixed and non-cognateSNARE complexes.Characterization of assembly and biophysicalproperties.Fasshauer D,Antonin W,Margittai M,Pabst S,Jahn R.]中总结了适用于鉴定功能性VAMP3的实验。

本领域技术人员使用本领域已知的常规实验还很容易知道如何鉴定能够被破伤风神经毒素(TeNT)、B型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/B)、D型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/D)、F型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/F)和G型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/G)中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或至少全部裂解的多肽结构域。[Specificity of botulinum protease for human VAMP family proteins.Yamamoto H,等人Microbiol Immunol,2012Apr.PMID22289120]中总结了适用于鉴定能够如上所述被裂解的多肽结构域的实验。此外，表1中提供了VAMP3的适当裂解位点序列的充分指导。在多肽结构域中存在一个(或多个)这些保守的裂解位点序列也可以表明它能够被破伤风神经毒素(TeNT)、B型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/B)、D型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/D)、F型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/F)和/或G型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/G)(视情况而定)裂解。

在一个实施方案中，具有VAMP3活性的多肽结构域包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列，或其功能变体(或功能片段)。此类变体可以是SEQ ID NO：3的天然存在的功能变体(例如，等位基因功能变体)、合成的功能变体或合成改进的功能变体。术语“变体”还涵盖同源物。

在一个实施方案中，具有VAMP3活性的多肽结构域包含SEQ ID NO：3的氨基酸21至100，或其功能变体(或功能片段)。此类变体可以是SEQ ID NO：3的天然存在的功能变体(例如，等位基因功能变体)、合成的功能变体或合成改进的功能变体。术语“变体”还涵盖同源物。

SEQ ID NO：3的氨基酸21至100代表用于BoNT相互作用和裂解的核心VAMP3氨基酸序列(氨基酸21至100在本文中也称为SEQ ID NO：9，并且显示于图10(仅标下划线的氨基酸)和图17中)。VAMP3氨基酸序列、BoNT相互作用和裂解位点是本领域熟知的(参见例如Yamamoto H,Ida T,Tsutsuki H,Mori M,Matsumoto T,Kohda T,Mukamoto M,Goshima N,Kozaki S,Ihara H.Microbiol Immunol.2012Apr；56(4):245-53)。因此，本领域技术人员也可以很容易地确定具有VAMP3活性的其他合适的多肽结构域。

功能变体通常仅包含SEQ ID NO：3的一个或多个氨基酸的保守取代，或蛋白的非关键区域中的非关键氨基酸的取代、缺失或***。因此，SEQ ID NO：3的功能变体可以是SEQID NO：3的保守氨基酸序列变体，其中该变体具有VAMP3活性。

非功能变体是不具有VAMP3活性的SEQ ID NO：3的氨基酸序列变体。非功能变体通常含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的非保守取代、缺失或***或过早截短(prematuretruncation)或关键氨基酸或关键区域的取代、***或缺失。用于鉴定功能性和非功能性变体(例如功能性和非功能性等位基因变体)的方法是本领域普通技术人员所熟知的。

[Proc Natl Acad Sci U S A.1998Dec 22；95(26):15781-6.Conservedstructural features of the synaptic fusion complex:SNARE proteinsreclassified as Q-and R-SNAREs.Fasshauer D,Sutton RB,Brunger AT,Jahn R]中提供了VAMP3中关键和非关键氨基酸的概述。因此，本领域技术人员将能够很容易地鉴定可以被取代的氨基酸以提供SEQ ID NO：3的功能变体(或功能片段)，例如保守氨基酸序列变体。本领域普通技术人员还可以使用标准序列比对程序很容易地鉴定SEQ ID NO：3的同源物。

具有VAMP3活性的多肽可以包括与SEQ ID NO：3的氨基酸序列或其部分或片段具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。合适地，同一性百分比可以计算为与参考序列(例如SEQ ID NO：3)的整个长度或其部分或片段的同一性的百分比。

SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列是天然存在的人VAMP3的氨基酸序列。关于人VAMP3的更多细节可见[Nature Reviews Molecular Cell Biology 2,98-106(February2001)SNARE-mediated membrane fusion’Y.A.Chen&R.H.Scheller]。

“非必需”或“非关键”氨基酸残基是可以相对于野生型序列(例如，SEQ ID NO：1至4的序列)改变，而不消除，或更优选地，基本上不改变生物学活性的残基，而“必需”氨基酸残基导致这种改变。例如，预测本发明多肽中的保守氨基酸残基特别不适于改变，除了跨膜结构域中的氨基酸残基通常可以被具有近似等价疏水性的其他残基代替，而不会显著改变活性。

“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的情况。本领域已经确定了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、具有β支链侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，蛋白质中的非必需氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基代替。或者，在另一个实施方案中，可以在全部或部分编码序列上随机引入突变，例如通过饱和诱变法，并且可以筛选所得突变体的生物学活性以鉴定保留活性的突变体。在诱变SEQ ID NO：1至4之后，可以重组表达编码的蛋白质，并且可以确定蛋白质的生物学活性。

如本文所用，蛋白质或具有“生物活性”的蛋白质部分的“生物活性部分”包括参与分子与非分子之间相互作用的蛋白质片段。蛋白质的生物活性部分包括肽，所述肽包含与该蛋白质的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：1至4所示的氨基酸序列)足够同源或由其衍生的氨基酸序列，其包括比全长蛋白质更少的氨基酸，并且表现出所编码的蛋白质的至少一种活性。通常，生物活性部分包含具有蛋白质的至少一种活性的结构域或基序，例如，生物活性部分可以视情况保留以下活性之一；荧光素酶、VAMP1、VAMP2或VAMP3活性。

蛋白质的生物活性部分可以是多肽，该多肽例如是SEQ ID NO：1至4长度中的50、100、150、200、250、300、350、400、450、500或更多个氨基酸。蛋白质的生物活性部分可以用作用于开发调节被介导活性(例如本文所述的生物活性)的剂的靶标。

如下进行序列之间的序列同源性或同一性(两个术语在本文中可互换使用)的计算。

为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，为了最佳比较目的，对序列进行比对(例如，为了比较目的，可以在第一个和第二个氨基酸序列或核苷酸序列中的一个或两个中引入空位，以进行最佳比对，并且可以忽略非同源序列)。在一个优选的实施方案中，为了比较目的而比对的参考序列的长度为参考序列长度的至少30％，优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，甚至更优选至少70％、75％、80％、82％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一个序列中的一个位置被与第二个序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，该分子在该位置是相同的(如本文所用，氨基酸或核酸同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数量的函数，其中考虑了空位(需要引入这些空位来进行两个序列的最佳比对)的数量和每个空位的长度。

序列的比较和两个序列之间同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。在一个优选的实施方案中，使用Needleman等人((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)的算法(已经并入到GCG软件包中的GAP程序中)(可从http://www.gcg.com获得)，使用BLOSUM 62矩阵或PAM250矩阵，并以16、14、12、10、8、6或4的空位权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重(length weight)来测定两个氨基酸序列之间的百分比同一性。在另一个优选的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(可从http://www.gcg.com获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵，并以40、50、60、70或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个核苷酸序列之间的百分比同一性。特别优选的一组参数(如果操作者不确定应使用哪些参数来确定一个分子是否在本发明的序列同一性或同源性限制内，则应使用该组参数)是BLOSUM 62评分矩阵，空位罚分12，空位延伸罚分4，移码空位罚分5。

或者，可以使用Meyers等人((1989)CABIOS 4:11-17)的算法(其已经并入到ALIGN程序(2.0版)中)，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分12和空位罚分4，来确定两个氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分比。

本文所述的核酸和蛋白质序列可以用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索，以例如鉴定其他家族成员或相关序列。可以使用Altschul等人((1990)J.Mol.Biol.215:403-410))的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行这种搜索。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程序，得分＝100，字长＝12进行，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序，得分＝50，字长＝3进行，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得空位比对以便进行比较，可以如Altschul等人(1997,Nucl.AcidsRes.25:3389-3402)中所述利用空位BLAST。当使用BLAST和空白BLAST程序时，可以使用各个程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见<http://www.ncbi.nlm.nih.gov>。

本文所述的多肽可具有与SEQ ID NO：1至4的氨基酸序列足够相同或基本上相同的氨基酸序列。本文使用的术语“足够相同”或“基本上相同”是指第一氨基酸或核苷酸序列包含与第二氨基酸或核苷酸序列足够的或最少数目的相同或等同(例如具有相似的侧链)氨基酸残基或核苷酸，使得第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有共同的结构域或共同的功能活性。例如，含有具有至少约60％或65％同一性，可能75％同一性，更可能85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的共同结构域的氨基酸序列或核苷酸序列在本文中被定义为足够相同或基本上相同。

核酸分子

还提供了编码本文所述多肽的核酸分子。

编码多肽的核酸分子可以通过已建立的标准方法合成制备，例如Beucage S.L.等人(1981)Tetrahedron Letters 22,p 1859-1869描述的亚磷酰胺方法，或Matthes等人(1984)EMBO J.3,p 801-805描述的方法。在亚磷酰胺方法中，寡核苷酸例如在自动DNA合成仪中合成、纯化、退火、连接并克隆到合适的载体中。

核苷酸序列可以是混合的基因组来源和合成来源、混合的合成来源和cDNA来源或混合的基因组来源和cDNA来源的，按照标准技术将合成来源、基因组来源或cDNA来源(按适当的)的片段连接而制备。每个连接的片段对应于整个核苷酸序列的各个部分。DNA序列也可以使用特异性引物通过聚合酶链式反应(PCR)制备，例如US 4,683,202或Saiki R等人(Science(1988)239,pp 487-491)中所述。

根据标准技术，核苷酸序列可以是基因组来源和外源来源的混合物。例如，核苷酸序列可以使用诸如CRISPR/Cas9的基因编辑技术生成，其中将编码具有萤光素酶活性的结构域的核酸序列引入编码具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的结构域的天然核酸序列的上游。

如本文所用，术语“核酸分子”或“核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，及其变体、同源物、片段和衍生物(例如其部分)。核苷酸序列可以是基因组来源或合成来源或重组来源，其可以是双链或单链的的，无论代表正义链还是反义链。与本发明有关的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA(例如mRNA)和例如通过使用核苷酸类似物而产生的DNA或RNA的类似物。

核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA，更优选是编码序列的cDNA。在一个优选的实施方案中，编码具有如本文所定义的特定特性的多肽的核苷酸序列本身不覆盖处于其天然环境中的天然核苷酸序列，在其天然环境中，天然核苷酸序列与同样处于其天然环境中的天然核苷酸序列的天然相关的序列连接。为便于参考，我们将这个优选的实施方案称为“非天然核苷酸序列”或“非天然存在的序列”。就这一点而言，术语“天然核苷酸序列”或“天然存在的序列”是指处于其天然环境中的完整核苷酸序列，并且在与与其天然相关的整个启动子可操作地连接时，启动子也处于其天然环境中。因此，本发明的多肽可以由处于其天然生物体中的核苷酸序列表达，但是其中该核苷酸序列不受该生物体内与之天然相关的启动子的控制。

优选地，所述多肽不是天然多肽。就这一点而言，术语“天然多肽”或“天然存在的多肽”是指处于其天然环境中的完整多肽，并且已经通过其天然核苷酸序列被表达。通常，使用重组DNA技术(即，重组DNA)制备编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列。然而，在本发明的另一个实施方案中，可以使用本领域众所周知的化学方法全部或部分合成核苷酸序列(参见Caruthers MH等人(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23和HornT等人(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。

如本文所用，术语“重组”是指生物分子，例如基因或蛋白质，其(1)已经移离了其天然存在的(天然)环境，(2)不与其处于天然形式时的全部或部分核酸分子或蛋白质相关，(3)与多核苷酸或多肽可操作地连接，其在自然界中不与这种多核苷酸或多肽连接，或(4)在自然界中不存在。

举例来说，包含具有荧光素酶活性的N-末端多肽结构域和具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的C-末端多肽结构域的多肽被认为是重组生物分子(如本文提供的多肽的所有具体实施方案一样)。同样，编码本文提供的多肽的核酸分子也是“重组的”。

杂交

本发明还包括与本发明的序列互补的序列或能够与本发明的序列或与其互补的序列杂交的序列的用途。

本文所用的术语“杂交”应包括“核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程”，以及在聚合酶链反应(PCR)技术中进行的扩增过程。

杂交条件是基于核苷酸结合复合物的解链温度(Tm)，如Berger和Immel(1987,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology,Vol.152,AcademicPress,San Diego CA)中所教导的，并赋予了确定的“严格度(stringency)”，如下所述。

最大严格度通常发生在大约Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)；高严格度发生在低于Tm约5℃至10℃；中等严格度发生在低于Tm约10℃至20℃；低严格度发生在低于Tm约20℃至25℃。如本领域技术人员将理解的，最大严格度杂交可用于鉴定或检测相同的核苷酸序列，而中等(或低)严格度杂交可用于鉴定或检测相似或相关的多核苷酸序列。

优选地，本发明包括能够在中等严格条件(例如，50℃和O.2xSSC)或高严格条件(例如，65℃和O.1xSSC{lxSSC-0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠pH7.0})下与本文定义的核苷酸序列(或其互补序列)杂交的序列的用途。

表达载体

如本文所用，术语“载体”或“构建体”是指能够转运与其可操作地连接的另一种核酸的核酸分子。术语“载体”和“构建体”在本文中可互换使用。载体能够自主复制，或者其可以整合到宿主DNA中。载体可以包括用于***重组DNA的限制酶位点，并且可以包括一种或多种选择标记。载体可以是质粒、噬菌体或粘粒(cosmid)形式的核酸分子。优选地，载体适于在细胞中表达(即，载体是“表达载体”)。优选地，表达载体适于在神经元细胞或神经元细胞系中表达。最优选地，载体适于在神经母细胞瘤细胞系(例如SiMa神经母细胞瘤细胞、LAN5神经母细胞瘤细胞或NG108成神经细胞瘤细胞)、永生化神经元、原代神经元或遗传修饰的生物体中表达。

优选地，(表达)载体能够在宿主细胞中繁殖并稳定地传递给后代。

如本文所用，“可操作地连接”是指下述控制元件中的单个或组合与编码序列以功能关系彼此在一起，例如以连接的关系，以便指导编码序列的表达。

如本文所用，“调控序列”是指能够控制基因表达的DNA或RNA元件。表达控制序列的实例包括启动子、增强子、沉默子、Shine Dalgarno序列、TATA盒、内部核糖体进入位点(IRES)、转录因子附着位点、转录终止子、聚腺苷酸化位点、RNA转运信号或对紫外线介导的基因反应重要的序列。优选地，载体包括一个或多个调控序列，其与待表达的核酸序列可操作地连接。调控序列包括指导组成型表达的序列，以及组织特异性调控序列和/或诱导序列。

如本文所用，“启动子”是指DNA或RNA中与RNA聚合酶结合以开始转录的核苷酸序列。启动子可以是诱导性表达的或组成性表达的。或者，启动子处于阻遏物或刺激蛋白的控制之下。优选地，启动子选自SV40、CMV、Actin、EF1 alpha、UB、RCV、PGK、CAG、MMLV-LTR或CMV-LTR杂合启动子。

如本文所用，“转录终止子”是指一种DNA元件，其终止负责将DNA转录成RNA的RNA聚合酶的功能。优选的转录终止子的特征是一连串T残基，其后是富含GC的二重对称区域。

如本文所用，“翻译控制元件”是指控制mRNA翻译的DNA或RNA元件。优选的翻译控制元件是核糖体结合位点。优选地，翻译控制元件来自与启动子同源的系统，例如启动子及其相关的核酶结合位点。优选的核糖体结合位点是T7或T3核糖体结合位点。

本文所用的“限制酶识别位点”是指DNA上被限制酶识别的基序。

如本文所用，“选择标记”是指当在宿主细胞中表达时在细胞上赋予表型的蛋白质，该表型允许选择表达所述选择标记基因的细胞。通常，这可能是赋予对抗生素(例如，氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、潮霉素、新霉素或甲氨蝶呤)的抗性的蛋白质。抗生素的其他实例是青霉素；盐酸氨苄西林、氨苄西林钠、阿莫西林钠、羧苄青霉素钠、青霉素G、头孢菌素、头孢噻肟钠、盐酸头孢氨苄、万古霉素、环丝氨酸。其他实例包括抑菌抑制剂，例如：氯霉素、红霉素、林可霉素、四环素、硫酸大观霉素、盐酸克林霉素、盐酸氯四环素。

表达载体的设计取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等因素。可以将本发明的表达载体引入宿主细胞中，从而产生由本文所述的核酸编码的蛋白质或多肽(包括融合蛋白或多肽)(例如，包含具有萤光素酶活性的N-末端多肽结构域和具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的C-末端结构域的多肽)。

优选地，载体包含宿主细胞表达本文所述多肽所必需的那些遗传元件。在宿主细胞中转录和翻译所需的元件包括启动子、目的蛋白的编码区和转录终止子。

本发明的表达载体可以是标准表达载体，例如pCDNA3、pIRES-NEO或逆转录病毒载体，例如pQCXIP、pQCXIN、pQCXIG、pLXIN、pBMN、pBABE-hygro和pBABE-puro。

术语“表达载体”、“表达构建体”、“构建体”和“载体”在本文中可互换使用。

优选地，表达载体是高拷贝数表达载体；或者，表达载体是低拷贝数表达载体。

表达载体的制备

本领域技术人员将知道可用于制备表达载体的分子技术。

可以通过使用相互启动的(mutually priming)寡核苷酸和本文所述的核酸序列合成核酸分子来制备用于掺入到如上所述的本发明的表达载体中的核酸分子。

已经开发了许多分子技术来通过互补粘性末端将DNA与载体可操作地连接。在一个实施方案中，可以向待***到载体DNA中的核酸分子中添加互补均聚物片段。然后，载体和核酸分子通过互补均聚物尾部之间的氢键结合，形成重组DNA分子。

在一个替代实施方案中，使用含有一个或多个限制位点的合成接头将核酸分子与表达载体可操作地连接。在一个实施方案中，通过限制性核酸内切酶消化产生核酸分子。优选地，用噬菌体T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理核酸分子，这些酶可利用其3'-5'-外切核酸活性去除突出部分——3'-单链末端，并利用其聚合活性填充凹入的3'-末端，从而生成平末端DNA片段。然后在能够催化平末端DNA分子的连接的酶(例如噬菌体T4 DNA连接酶)的存在下，将平末端片段与大摩尔过量的接头分子一起孵育。因此，反应产物是在其末端带有聚合物接头序列的核酸分子。然后将这些核酸分子用适当的限制酶裂解，并连接至已被酶裂解的表达载体，该酶产生与核酸分子的末端相容的末端。

或者，可以使用包含连接非依赖性克隆(LIC)位点的载体。然后可以将所需的PCR扩增核酸分子克隆到LIC载体中，而无需进行限制性酶切或连接(Aslanidis and de Jong,Nucl.Acid.Res.18,6069-6074,(1990),Haun,等人,Biotechniques 13,515-518(1992))。

为了分离和/或修饰用于***到所选质粒中的目标核酸分子，优选使用PCR。可以设计用于序列的PCR制备的合适引物，以分离所需的核酸分子编码区，添加限制性核酸内切酶或LIC位点，将编码区置于所需的阅读框中。

在一个优选的实施方案中，通过使用如Saiki等人((1988)Science 239,487-491)中所公开的聚合酶链式反应，使用适当的寡核苷酸引物，来制备用于掺入到本发明的表达载体中的核酸分子。编码区被扩增，而引物本身被掺入扩增的序列产物中。在一个优选的实施方案中，扩增引物包含限制性核酸内切酶识别位点，其允许将扩增的序列产物克隆到合适的载体中。

优选地，通过PCR获得核酸分子，并使用限制性核酸内切酶消化和连接(该技术是本领域众所周知的)将其引入表达载体中。更优选地，将核酸分子引入表达载体中，所述表达载体例如pCDNA3、pIRES-NEO或逆转录病毒载体如pQCXIP、pQCXIN、pQCXIG、pLXIN、pBMN、pBABE-hygro或pBABE-puro。

本发明的表达载体可以包含前述核酸分子的单拷贝，或前述核酸分子的多拷贝。

本文所述的核酸分子和/或表达载体可以存在于任何合适的宿主细胞内(从而产生遗传修饰的细胞)。

宿主细胞

关于本发明的术语“宿主细胞”包括包含根据本发明所述的核苷酸序列或编码具有如本文所定义的特定特性的多肽的核苷酸序列的任何细胞。优选地，将核苷酸序列掺入到细胞的基因组中。

术语“宿主细胞”、“基因修饰的细胞”和“重组宿主细胞”可互换使用。这些术语不涵盖处于其天然环境中的天然核苷酸编码序列(在天然环境中，天然核苷酸编码序列在其天然启动子(也处于其天然环境中)的控制下)，而是指遗传改变的(例如，转化或转染的)细胞。该术语是指特定的受试细胞，也指这种细胞的后代或潜在后代。因为由于突变或环境影响，在后代中可能发生某些修饰，所以这种后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用术语的范围内。

遗传修饰的细胞可以是真核细胞或原核细胞。优选地，基因修饰的细胞是梭菌敏感性细胞(例如，梭菌神经毒素可以结合并跨细胞膜转运的细胞(例如克隆/细胞系)。这样的细胞的实例是众所周知的，并且技术人员将能够例如通过测试破伤风神经毒素和/或肉毒杆菌神经毒素(例如，B型BoNT、D型BoNT、F型BoNT和/或G型BoNT)是否可以结合并跨细胞膜转运来确定此类细胞。用于测试这一点的常规实验是众所周知的，包括以下实施例部分中描述的一些实验。合适的细胞包括神经母细胞瘤细胞系的细胞(例如，SiMa神经母细胞瘤细胞、LAN5神经母细胞瘤细胞、NG108神经母细胞瘤细胞)、永生神经元、原代神经元或遗传修饰的生物。

可以使用任何合适的手段(例如基因编辑技术)来改变宿主细胞基因组以生成本发明的核酸序列，所述基因编辑技术将编码具有萤光素酶活性的蛋白结构域的核酸序列引入编码具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的蛋白质结构域的天然(内源)核酸序列的上游。可替代地或另外地，可以使用本领域已知的标准技术用本发明的表达载体转化、感染或转染宿主细胞。

宿主细胞转化

可以用本发明的表达载体(其包含如前所述的核酸分子)转化、感染或转染的宿主细胞来产生(即表达)本文提供的多肽。

可以通过常规的转化、转染或转导技术，将本发明的表达载体引入细胞中。“转化”、“转染”和“转导”是指用于将外源核酸引入细胞中的技术。使用的具体方法通常取决于载体和细胞的类型。所述技术包括但不限于磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染、化学穿孔或电穿孔。

本领域中已知的用于转化、转染或转导细胞的技术公开于例如Sambrook等人(1989)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y；Ausubel等人(1987)Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley and Sons,Inc.,NY；Cohen等人(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69,2110；Luchansky等人(1988)Mol.Microbiol.2,637-646。

成功转化、转染或转导的细胞(或遗传修饰的细胞)，即含有本发明的表达载体或核酸分子的那些细胞，可以通过本领域熟知的技术进行鉴定。例如，可以培养用本发明的表达载体转染的细胞以产生具有萤光素酶活性和VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的蛋白质。可以通过本领域众所周知的技术检查细胞中表达载体DNA的存在。或者，可以使用与其杂交的抗体来检测多肽或其部分和片段的存在。

在一个优选的实施方案中，本发明包括转化的细胞的培养物。优选地，培养物是克隆均质的。

细胞可包含先前描述的表达载体的单个拷贝，或者，表达载体的多个拷贝。

用途和方法

本发明人惊奇地发现了可用于检测神经毒素活性(特别是破伤风、B型肉毒杆菌、D型肉毒杆菌、F型肉毒杆菌和/或G型肉毒杆菌神经毒素活性)的新型报告分子。报告分子被特定神经毒素裂解后，产生两个裂解片段；第一片段，其包含具有荧光素酶活性的N-末端多肽结构域和具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的C-末端多肽结构域的一部分；和第二片段，其包含具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的C-末端多肽的剩余部分。有利地，第一片段足够稳定从而能够检测神经毒素活性(即，检测报告分子的裂解)。

因此，本发明的多肽、核酸分子、表达载体或遗传修饰的细胞可用于检测神经毒素活性，其中所述神经毒素活性选自由以下组成的组：破伤风神经毒素活性、B型肉毒杆菌神经毒素活性、D型肉毒杆菌神经毒素活性、F型肉毒杆菌神经毒素活性和G型肉毒杆菌神经毒素活性。

如本文所用，“神经毒素活性”是指天然存在的破伤风、B型肉毒杆菌、D型肉毒杆菌、F型肉毒杆菌和G型肉毒杆菌神经毒素中的任何一种裂解其底物(在这种情况下，是具有VAMP1、VAMP或VAMP3活性的多肽结构域)的能力。天然存在的神经毒素及其各自的神经毒素活性在本领域中是公知的，并且在其他地方更详细地描述(参见表1以及例如BotulinumNeurotoxins.Editors:Rummel,Andreas,Binz,Thomas(Eds.)Springer,Current Topicsin Microbiology and Immunology,2013)。

例如，“破伤风神经毒素活性”是指在裂解位点GASQ⁷⁸FESS处裂解VAMP1(或具有VAMP1活性的多肽结构域)、在裂解位点GASQ⁷⁶FETS处裂解VAMP2(或具有VAMP2活性的多肽结构域)和/或在裂解位点GASQ⁵⁹FETS处裂解VAMP3(或具有VAMP3活性的多肽结构域)。

例如，“B型肉毒杆菌神经毒素活性”是指在裂解位点GASQ⁷⁸FESS处裂解VAMP1(或具有VAMP1活性的多肽结构域)、在裂解位点GASQ⁷⁶FETS处裂解VAMP2(或具有VAMP2活性的多肽结构域)和/或在裂解位点GASQ⁵⁹FETS处裂解VAMP3(或具有VAMP3活性的多肽结构域)。

例如，“D型肉毒杆菌神经毒素活性”是指在裂解位点RDQK⁶¹LSEL处裂解VAMP1(或具有VAMP1活性的多肽结构域)、在裂解位点RDQK⁵⁹LSEL处裂解VAMP2(或具有VAMP2活性的多肽结构域)和/或在裂解位点RDQK⁴²LSEL处裂解VAMP3(或具有VAMP3活性的多肽结构域)。

例如，“F型肉毒杆菌神经毒素活性”是指在裂解位点ERDQ⁶⁰KLSE处裂解VAMP1(或具有VAMP1活性的多肽结构域)、在裂解位点ERDQ⁵⁸KLSE处裂解VAMP2(或具有VAMP2活性的多肽结构域)和/或在裂解位点ERDQ⁴¹KLSE处裂解VAMP3(或具有VAMP3活性的多肽结构域)。

例如，“G型肉毒杆菌神经毒素活性”是指在裂解位点ESSA⁸³AKLK处裂解VAMP1(或具有VAMP1活性的多肽结构域)、在裂解位点ETSA⁸¹AKLK处裂解VAMP2(或具有VAMP2活性的多肽结构域)和/或在裂解位点ETSA⁶⁴AKLK处裂解VAMP3(或具有VAMP3活性的多肽结构域)。

破伤风、B型肉毒杆菌、D型肉毒杆菌、F型肉毒杆菌和/或G型肉毒杆菌神经毒素的修饰形式(例如人工修饰的、重组体、嵌合体、类毒素等)可能会保留“神经毒素活性”(即它们以表1中示出的方式裂解VAMP1、VAMP2和/或VAMP3的能力)。因此，本发明可用于检测这种修饰的神经毒素是否保留“神经毒素活性”。本发明包括这些用途和方法。

肉毒杆菌神经毒素的多样性总结于例如[Research in Microbiology,Volume166,Issue 4,May 2015,Pages 303–317,Genomes,neurotoxins and biology ofClostridium botulinum Group I and Group II,Andrew T.Carter,Michael W.Peck]中。

因此，本发明可用于检测这些神经毒素的天然存在形式的神经毒素活性(和/或存在)，以及其嵌合体或人工修饰形式的神经毒素活性。有利地，本发明因此提供了用于检测这些神经毒素修饰形式的神经毒素活性增加或降低的手段。

可以使用适于检测神经毒素活性的任何手段。可以使用数种标准技术来检测本文所述的多肽的裂解。示例性技术包括但不限于免疫印迹(也称为蛋白质印迹)、夹心ELISA测定或活细胞成像。本领域中的这些方法或常规以及各自如何进行的细节是众所周知的(参见例如[Specificity of botulinum protease for human VAMP familyproteins.Yamamoto H,等人Microbiol Immunol,2012Apr.PMID 22289120；Substraterecognition of VAMP-2by botulinum neurotoxin B and tetanus neurotoxin.Chen S,等人J Biol Chem,2008Jul 25.PMID 18511417])。

在没有遗传修饰的细胞的情况下，神经毒素活性的检测可以在体外进行。例如，可以使本发明的多肽与神经毒素(或如下所述的测试样品)接触，并且可以确定裂解产物的存在(例如通过ELISA或蛋白质印迹)。这种检测方法的开发完全在本领域技术人员的常规能力范围内。

可选地，可以使用遗传修饰的细胞进行神经毒素活性的检测，如本文其他地方所述。有利地，遗传修饰的细胞提供了用于测试神经毒素作用的所有三个阶段的手段，所述三个阶段即：与细胞表面结合、将神经毒素肽酶递送到细胞胞质溶胶中以及神经毒素诱导的其底物(在这种情况下，是本发明的多肽)的裂解。可以确定裂解产物的存在(例如通过细胞裂解物的ELISA或蛋白质印迹)。也可以使用活细胞成像来检测神经毒素活性，因为神经毒素裂解多肽产生的“第一片段”(即包含具有荧光素酶活性的N-末端多肽结构域和具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的C-末端结构域的一部分的片段)将不再与囊泡结合，而是将存在于细胞胞质溶胶中。这种检测方法的开发完全在本领域技术人员的常规能力范围内。

还可以使用裂解后的多肽的荧光素酶活性来检测神经毒素诱导的裂解。本领域公知的涉及荧光素酶检测的标准技术和这些方法的开发完全在本领域技术人员的常规能力范围内。荧光素酶检测方法的综述可见于[Application of enzymebioluminescence formedical diagnostics.Frank LA,Krasitskaya VV.Adv Biochem Eng Biotechnol.2014；144:175-97；Current advanced bioluminescence technology in drugdiscovery.Hoshino H.Expert Opin Drug Discov.2009Apr；4(4):373-89]。

还可以使用对多肽的裂解末端特异的抗体来检测神经毒素诱导的裂解。使用对多肽的裂解末端特异的抗体的一个优点是它们可用于确定哪种特定的神经毒素(例如破伤风/B型BoNT、D型BoNT、F型BoNT或G型BoNT——见表1)负责多肽的裂解(并由此确定例如如下所述的测试样品中存在哪种神经毒素)。

举例来说，可以生成对BoNT/B裂解的VAMP2或BoNT/D裂解的VAMP2特异性的抗体(分别针对肽ALQAGASQ和肽KVLERDQK产生抗体——参见图5和相应的图例)。

本发明可用于检测测试样品中的神经毒素活性。

如本文所用，“测试样品”可以是有待测试神经毒素活性的存在的任何样品(具有已知的、未知的或部分已知的组成)，其中所述神经毒素活性选自由以下组成的组：破伤风神经毒素活性、B型肉毒杆菌神经毒素活性、D型肉毒杆菌神经毒素活性、F型肉毒杆菌神经毒素活性和G型肉毒杆菌神经毒素活性，或其任意组合。

“测试样品”可以包含药物产品(例如用于施用于受试者的疫苗，例如类毒素，其中类毒素是来自病原微生物(例如破伤风或肉毒杆菌)的化学修饰的毒素)，其不再是有毒的，但是仍具有抗原性，可用作疫苗。在这种情况下，本发明可用于检测(不想要的)残留神经毒素活性。

如本文所用，“受试者”是指人或动物(例如待接种疫苗的人或动物)。通常动物是脊椎动物，例如灵长类动物、啮齿动物、家养动物或野生动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如恒河猴(Rhesus)。啮齿动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、白鼬、兔子和仓鼠。家养动物和野生动物包括牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科动物如家猫、犬科动物如狗、狐狸、狼、禽类动物如鸡、鸸鹋(emu)、鸵鸟和鱼如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼。在本文所述方面的某些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人。受试者可以是雄性或雌性。受试者可以是完全发育的受试者(例如，成人)或正在经历发育过程的受试者(例如，儿童、婴儿或胎儿)。

优选地，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。

合适的测试样品还可以包括食物样品、临床样品或环境样品(其中食物样品、临床样品或环境样品可能已被梭菌污染和/或可能含有神经毒素)，或其任意组合。在这种情况下，本发明可用于检测污染的存在。

合适的测试样品还包括破伤风神经毒素、B型肉毒杆菌神经毒素、D型肉毒杆菌神经毒素、F型肉毒杆菌神经毒素和/或G型肉毒杆菌神经毒素(例如，来自已知批次的神经毒素的测试样品，任选地，所述已知批次的神经毒素被制造用于治疗性或非治疗性用途)，或其任意组合。在这种情况下，本发明可用于检测或确定神经毒素的效力。为避免疑义，测试样品中的神经毒素可以是天然存在的神经毒素，或者可以是其修饰的(例如人工修饰的，包括嵌合体)形式。

在优选的方法中，使用本发明的遗传修饰的细胞检测(或测定)神经毒素活性，(a)在以下条件下培养细胞，所述条件允许表达包含具有荧光素酶活性的N-末端多肽结构域和具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的C-末端多肽的多肽。在该实施例中，可以使遗传修饰的细胞与神经毒素(或测试样品)接触，并且可以确定裂解产物的存在(例如通过ELISA、蛋白质印迹或活细胞成像)。这些方法的开发也完全在本领域技术人员的常规能力范围内。

因此，提供了一种检测测试样品中神经毒素活性的方法，所述方法包括：

(a)在以下条件下培养根据本发明所述的遗传修饰的细胞，所述条件允许表达包含具有荧光素酶活性的N-末端多肽结构域和具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的C-末端多肽的多肽；

(b)在以下条件下在测试样品的存在下培养(a)的细胞，所述条件允许包含具有荧光素酶活性的N-末端多肽结构域和具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的C-末端多肽的多肽的神经毒素诱导的裂解；和

(c)确定所述多肽的神经毒素诱导的裂解水平，其中所述多肽的神经毒素诱导的裂解的检测指示神经毒素活性；

其中所述神经毒素活性选自由以下组成的组：破伤风神经毒素活性、B型肉毒杆菌神经毒素活性、D型肉毒杆菌神经毒素活性、F型肉毒杆菌神经毒素活性和G型肉毒杆菌神经毒素活性，或其任意组合。

步骤(a)中的培养条件应允许表达包含具有荧光素酶活性的N-末端多肽结构域和具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的C-末端多肽的多肽。优化培养条件以允许多肽表达完全在本领域技术人员的常规能力范围内。此外，鉴定所选培养条件是否允许多肽表达也是常规的，并且可以使用标准技术例如ELISA或蛋白质印迹来检测多肽表达的量。

取决于宿主细胞，以技术人员熟悉的方式使细胞生长或培养细胞。要使用的培养基(culture medium)(本文中也称为“生长培养基(growth medium)”、“培养基(medium)”或“培养基(media)”)必须合适地满足所讨论的细胞的要求。优选地，培养基足以支持宿主细胞的生长。适用于各种细胞的培养基的描述可见于教科书“Culture of Animal Cells:AManual of Basic Technique and Specialized Applications,Sixth Edition,R.IanFreshney,2010John Wiley&Sons,Inc.”。仅举例来说，SiMa神经母细胞瘤细胞优选在以下条件下培养：使SiMa细胞(来自DSMZ细胞收集)在补充有10％胎牛血清的RPMI培养基中生长。为了分化，用10μg/ml层粘连蛋白预涂覆平板。将SiMa细胞以每孔1×10⁴个细胞的密度接种于96孔板中或以每孔2×10⁴个细胞的密度接种于48孔板中，并在分化培养基(RPMI，B27或GS21补充剂，1mM HEPES和含10μM AT-视黄酸的1％NEAA)中孵育72小时。

遗传修饰的细胞可以在液体培养基中生长，所述液体培养基包含以下中的一种或多种：碳源(通常为糖的形式)、氮源(通常以有机氮源的形式，例如酵母提取物)或盐(如硫酸铵、无机盐、微量元素如铁、锰和镁的盐)，以及维生素(如果适用)，在0℃至100℃，优选在25℃至40℃的温度范围内，在二氧化碳中。

优选的碳源是糖，例如单糖、二糖或多糖。碳源的实例是葡萄糖、二氧化碳、碳酸氢钠、碳酸氢盐、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。优选地，碳源是二氧化碳。或者，碳源是碳酸氢盐。添加多种碳源的混合物也可能是有利的。

氮源通常是有机或无机氮化合物或包含这些化合物的材料。氮源的实例包括液态或气态的氨或铵盐如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵、硝酸盐、尿素、氨基酸或复合氮源如玉米浸泡液、大豆粕、大豆蛋白、酵母提取物、肉提取物等。氮源可以单独使用或混合使用。

可存在于培养基中的无机盐化合物包括钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯盐、磷盐和硫酸盐。

无机含硫化合物(例如硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物)或者有机硫化合物(例如硫醇(“mercaptan”和“thiol”))都可以用作生产含硫精细化学品特别是甲硫氨酸的硫的来源。

磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠的盐可用作磷的来源。

可以向培养基中添加螯合剂，以将金属离子保持在溶液中。特别合适的螯合剂包括二羟基酚，例如邻苯二酚或原儿茶酸酯，和有机酸，例如柠檬酸。

根据本发明使用的培养基还可以包含其他生长因子，例如维生素或生长促进剂，其包括例如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸(panthothenate)和吡多醇。生长因子和盐通常来自复合培养基成分，例如酵母提取物、糖浆、玉米浆等。此外，可以向培养基中添加合适的前体。培养基化合物的确切组成在很大程度上取决于具体的实验，并针对每种具体情况分别确定。有关培养基优化的信息可见于教科书"Applied Microbiol.Physiology,A Practical Approach"(编辑P.M.Rhodes,P.F.Stanbury,IRL Press(1997)pp.53-73,ISBN 0 19 963577 3)。生长培养基也可以从商业供应商获得，例如Standard 1(Merck)或BHI(脑心浸液，DIFCO)等。

液体培养基的pH可以保持恒定(即在培养期间调节)或不保持恒定。

已知培养方法的概述可见于Chmiel的教科书(Bioprozeβtechnik 1.Einführungin die Bioverfahrenstechnik[Bioprocess technology 1.Introduction toBioprocess technology](Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991))或Storhas的教科书(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen[Bioreactors and peripheralequipment](Vieweg Verlag,Brunswick/Wiesbaden,1994))。

通过加热(在1.5巴和121℃下20分钟)或通过过滤灭菌对所有培养基组分进行灭菌。可以将组分一起灭菌，或者如果需要，可以单独灭菌。根据需要，所有培养基组分可以在培养开始时存在，或者连续或分批加入。

培养温度将根据具体实验和宿主细胞而变化。培养温度通常在15℃至45℃之间，优选在25℃至40℃之间，更优选在25至37℃之间，并且在实验期间可以保持恒定或可以改变。仅举例来说，对于SiMa神经母细胞瘤细胞，温度优选为25至40℃，更优选为37℃。

培养基的pH应在5至8.5的范围内，优选约7.0。在培养期间可以通过添加碱性化合物(如氢氧化钠、氢氧化钾、氨和氨水)或酸性化合物(如磷酸或硫酸)来控制培养的pH。可以通过使用消泡剂(如脂肪酸聚乙二醇酯)来控制发泡。为了保持载体的稳定性，可以向培养基中加入具有选择作用的合适物质，例如抗生素。通过向培养物中引入氧气或含氧气体混合物(例如环境空气)来维持有氧条件。培养温度通常为20℃至45℃，优选为25℃至40℃。持续培养直至发生多肽表达。这一目标通常在6到96小时内实现。

步骤(b)中的培养条件是在测试样品的存在下，并且所述培养条件允许包含具有荧光素酶活性的N-末端多肽结构域和具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的C-末端多肽的多肽的神经毒素诱导的裂解。换句话说，培养条件是这样的：如果测试样品中存在功能性神经毒素，则至少会发生一些多肽的神经毒素诱导的裂解。优化培养条件以允许多肽的神经毒素诱导的裂解完全在本领域技术人员的常规能力范围内。此外，鉴定所选培养条件是否允许多肽的神经毒素诱导的裂解也是常规的，并且可以使用标准技术如ELISA或蛋白质印迹检(如其他地方所讨论的)检测多肽的神经毒素诱导的裂解的量。

在一个实施方案中，培养步骤(a)和(b)同时进行。换句话说，可以在细胞培养开始时将测试样品添加到遗传修饰的细胞中，或者可以在多肽表达已经开始后添加。优化在测试样品存在下培养遗传修饰的细胞的时间点完全在本领域普通技术人员的常规能力范围内。

任选地，在培养基中提供测试样品。

如其他地方所述，测试样品可以包括药物产品、食物样品、临床样品或环境样品或其任意组合。或者，测试样品可以包含破伤风类毒素，或肉毒杆菌类毒素，或其组合。

测试样品可以包含破伤风神经毒素、B型肉毒杆菌神经毒素、D型肉毒杆菌神经毒素、F型肉毒杆菌神经毒素、G型肉毒杆菌神经毒素或其任意组合。为避免疑义，测试样品中的神经毒素可以是天然存在的神经毒素，或者可以是其修饰(例如人工修饰，包括嵌合体)形式。

本文提供的方法包括步骤(c)，即确定多肽的神经毒素诱导的裂解的水平，其中多肽的神经毒素诱导的裂解的检测指示神经毒素活性；并且其中所述神经毒素活性选自由以下组成的组：破伤风神经毒素活性、B型肉毒杆菌神经毒素活性、D型肉毒杆菌神经毒素活性、F型肉毒杆菌神经毒素活性和G型肉毒杆菌神经毒素活性，或其任意组合。

可以使用本文其他地方讨论的任何合适的标准技术(例如ELISA、蛋白质印迹、活细胞成像等)确定(或检测)神经毒素诱导的多肽的裂解水平。

如本文所用，神经毒素诱导的裂解的“检测”涵盖了可检测的(例如可见的、可定量的等)任何水平或量的神经毒素诱导的裂解。举例来说，这包括在测试点(其中测试点可以是例如将测试样品添加到细胞后6小时或更长时间)至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％的底物(本发明的多肽)的裂解。在将测试样品添加到细胞之后的合适的时间点(例如，如上文所使用的“测试点”)的其他实例包括至少24小时、48小时或72小时。

“神经毒素诱导的裂解”是指本发明的多肽的裂解，其中所述裂解是由于神经毒素的活性引起的(也就是说，这不包括由于其他机制例如非特异性多肽降解或被其他非神经毒素酶裂解而引起的多肽的裂解)。可以使用本领域的标准技术如ELISA或裂解产物的大小(例如在蛋白质印迹上)鉴定神经毒素诱导的裂解，以确认神经毒素诱导的裂解已经发生。多肽的神经毒素诱导的裂解的检测指示神经毒素活性(例如，裂解的水平或数量与测试样品中神经毒素活性的水平或数量成比例)。在本发明的上下文中，术语“神经毒素诱导的裂解”和“神经毒素活性”可以互换使用。

在本发明的某些实施方案中，使用阴性对照(如上所述)可能是有利的。例如，可以确定神经毒素诱导的多肽的裂解水平，然后将其与阴性对照样品中的多肽裂解水平或与多肽裂解的预定参考水平进行比较，其中与对照样品相比或与预定参考水平相比，在存在测试样品的情况下裂解水平增加表明存在神经毒素诱导的裂解。阴性对照包括在不存在测试样品的情况下或在已知缺乏神经毒素活性的样品(例如热灭活的测试样品)的存在下，在相同条件下培养相同细胞。

另外地，或者替代性地，使用阳性对照可能是有利的(例如以确保当测试类毒素的残留神经毒素活性时不产生假阴性)。阳性对照的实例可以是在已知包含功能性神经毒素的测试样品的存在下，在相同条件下培养相同细胞。

在某些实施方案中，使用对目标神经毒素裂解产物具有特异性的抗体可能是有利的。这类抗体的实例在本文其他地方描述(还参见图5和相应的图例)。

其他适当的阳性对照和阴性对照的开发和使用完全在本领域技术人员的常规能力范围内。

试剂盒

本文还提供了用于检测神经毒素活性的试剂盒，其中所述试剂盒包含

(a)编码多肽的核酸分子，所述多肽包含具有荧光素酶活性的N-末端多肽结构域和具有VAMP1、VAMP2或VAMP3活性的C-末端多肽结构域；和

(b)用于检测神经毒素活性的阳性对照，其中所述阳性对照能够裂解由(a)的核酸分子编码的多肽。

神经毒素活性可选自由以下组成的组：破伤风神经毒素活性、B型肉毒杆菌神经毒素活性、D型肉毒杆菌神经毒素活性、F型肉毒杆菌神经毒素活性和G型肉毒杆菌神经毒素活性，或其任意组合。

(a)的核酸分子(和所编码的多肽)已在本文其他地方详细描述。

合适地，核酸分子可以是表达载体的一部分和/或可以在遗传修饰的细胞(例如遗传修饰的SiMa神经母细胞瘤细胞)内(例如，形成其一部分；存在于其中)。本文还详细描述了包含此类核酸分子的表达载体和遗传修饰的细胞。

本文提供的试剂盒还包含用于检测神经毒素活性的阳性对照，其中所述阳性对照能够裂解由(a)的核酸分子编码的多肽。

在一个实施方案中，阳性对照可包含适当量的破伤风神经毒素、B型肉毒杆菌神经毒素、D型肉毒杆菌神经毒素、F型肉毒杆菌神经毒素和G型肉毒杆菌神经毒素中的至少一种。如本文其他地方所述，神经毒素可以是天然存在的或其修饰形式，其中修饰形式保留神经毒素活性。

任选地，试剂盒还包含用于检测荧光素酶活性的试剂。合适的试剂在本领域中是众所周知的，包括但不限于萤光素、furimazine、腔肠素(coelenterazine)、ATP和其他已知的萤光素酶底物[Beyond D-luciferin:expanding the scope of bioluminescence imaging in vivo.Adams ST Jr,Miller SC.Curr Opin Chem Biol.2014Aug；21:112-20]。

试剂盒可包括以下任何一种或全部：测定试剂、缓冲液和一种或多种裂解的多肽片段的选择性结合伴侣，所有这些都可以容纳在适合运输的容器中。选择性结合伴侣可以包括与裂解的多肽片段之一选择性结合的抗体。此类抗体的实例在本文其他地方描述(还参见图5和相应的图例)。

在一些实施方案中，试剂盒在连续的固体表面上包括选择性结合伴侣。示例性的试剂盒包括装有检测结合伴侣的容器和用于检测神经毒素活性的阳性对照。

此外，试剂盒可包括指导材料，所述指导材料包含使用试剂盒中提供的材料的指导(即方案)。尽管指导材料通常包括书面或印刷材料，但可以在能够存储此类指导并将其传达给最终用户的任何介质中提供指导材料。合适的介质包括但不限于电子存储介质(例如磁盘、磁带(tape)、盒式磁带(cartridge)、芯片)和光学介质(例如CD ROM)。介质可以包括提供指导材料的互联网站点的地址。此类指导可以与本文所述的任何方法或用途一致。

除非本文另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。例如，Singleton和Sainsbury,Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology,第2版,John Wiley and Sons,NY(1 94)；和Hale和Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology,Harper Perennial,NY(1991)为本领域技术人员提供了本发明中使用的许多术语的通用词典。尽管与本文所述的那些方法或材料相似或等同的任何方法和材料都可用于本发明的实践中，但是本文描述了优选的方法和材料。因此，下面将整体上参考说明书来更全面地描述下面定义的术语。此外，如本文所用，除非上下文另有明确说明，否则单数术语“一”、“一个”和“所述”包括复数指代。除非另有说明，否则核酸以5'至3'方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。应理解，本发明不限于所描述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以根据本领域技术人员使用的环境而变化。

以下非限制性实施例证明了本发明的各方面。

实施例

通过遗传工程改造VAMP2分子，发明人已经证明可以防止神经毒素裂解的VAMP2的降解。为了证明这种方法的可行性，本发明人使用病毒转导将绿色荧光蛋白GFP-VAMP2嵌合蛋白引入到SiMa神经母细胞瘤细胞中(图1A和B)。

发明人观察到GFP-VAMP2如预期的那样定位在囊泡中(图1C，顶部)。接下来，发明人将mCherry标记的破伤风轻链(VAMP2-裂解结构域)转染到SiMa细胞中(图1C，右下)。转染后两天，发明人检测到GFP-VAMP2裂解的产物重新分布到表达破伤风的细胞的细胞溶胶中(图1C，左下)。重要的是，免疫印迹揭示了稳定的GFP-VAMP2裂解产物，这使我们能够在体外量化破伤风作用(图1D)。这些结果表明，可以设计一种细胞系，其准确地再现TNx作用的所有步骤：结合、易位和VAMP2裂解。工程细胞系的另一个好处是其可用于检测肉毒杆菌类毒素的潜在实用性，所述肉毒杆菌类毒素用于免疫牲畜(6)或用于生产基于B、D、F和G型肉毒杆菌神经毒素的肉毒杆菌药物。值得注意的是，先前在用破伤风轻链转染的L6-GLUT4myc成肌细胞中观察到了裂解的GFP-VAMP2或VAMP3产物的出现(12)。

当发明人将GFP-VAMP2转染到永生化小鼠神经元中时，用全D型肉毒杆菌神经毒素处理后，他们观察到了GFP-VAMP2产物的释放(图2)：

Western印迹不适用于高通量筛选或质量控制(QC)验证。释放的GFP-VAMP2可以通过ELISA夹心免疫测定法进行定量，如Botox检测裂解的SNAP25所描述的那样，Allergan获得了该方法的专利(11)。确实，基于与抗原上不同位点结合的两种抗体的夹心ELISA分析是可靠、灵敏且易于验证的。对于夹心ELISA，可以使用增强的化学发光检测平台，该平台需要另外的报告子结合步骤(11)。

但是，发明人假设，如果他们用报告酶代替GFP分子，它们将能够通过去除最终的抗体检测步骤而显著加速VAMP裂解的检测。发明人设计了识别破伤风产生的VAMP2片段和肉毒杆菌产生的VAMP2片段的抗体，其将允许特异性地捕获携带GFP、萤光素酶或过氧化物酶的VAMP2报告子，从而实现破伤风与肉毒杆菌的精确检测。通常，神经毒素的应用导致VAMP2的裂解和报告VAMP2产物释放到细胞胞质溶胶中。这可以通过使用总的或裂解的VAMP2的抗体的Western免疫印迹来证实。由于具有固有易变性的Western印迹难以验证，因此必须为QC环境开发用于基于细胞的测定的简单酶法读出。必需的VAMP2报告子的一个优点是可以建立一种经济有效的高通量分析方法来检测裂解产物。

为了捕获被破伤风和B型肉毒杆菌神经毒素裂解的VAMP分子，发明人可以使用特制的VAMP2抗体，其特异性地识别破伤风裂解的VAMP2的末端(QAGASQ₇₆)，这对于开发VAMP捕获测定法是有用的。与酶融合的裂解的VAMP2的捕获将允许在单个步骤中定量裂解产物的量，这极大地简化了神经毒素的检测，但是这尚未在细胞环境中得到证实。荧光素酶是通过荧光素的氧化催化光发射的生物发光酶。另一方面，过氧化物酶提供了多种检测选择，从发色底物到荧光以及发光。萤光素酶和过氧化物酶在生物分子成像和生化测定系统中都变得非常流行，促进了优化形式的开发。发明人制备了VAMP2与NanoLuc(优化的荧光素酶，Promega)和APEX2(优化的过氧化物酶)的融合体，并将质粒包装入逆转录病毒载体中。发明人观察到了这些新的VAMP2-报告子在SiMa神经母细胞瘤细胞中的稳定表达(图3)。有趣的是，发明人发现破伤风或肉毒杆菌神经毒素不能裂解APEX2-VAMP2融合分子，而Nluc-VAMP2表现出了预期的裂解(图4)。

发明人使用总的和裂解的VAMP2的抗体通过免疫印迹定量了携带NanoLuc-VAMP2的SiMa神经母细胞瘤细胞对BoNT/B和BoNT/D的敏感性。图5证明肉毒杆菌神经毒素的检测取决于类型。具体地，发明人可以在300皮摩尔下检测到BoNT/B对VAMP的裂解，而SiMa细胞对BoNT/D的敏感性在纳摩尔范围内。

接下来，发明人制备了用识别BoNT/B裂解的末端(QAGASQ₇₆)的VAMP2抗体包被的96孔板。发明人将经Triton X-100处理的SiMa细胞提取物应用于这些板上以捕获NanoLuc-VAMP2。使用NanoGlo试剂(Promega)对捕获的报告酶进行定量。图6显示了基于NanoLuc的检测方法与源自图5的蛋白质免疫印迹的定量结果的直接比较。

此外，尽管SiMa神经母细胞瘤细胞对该梭菌神经毒素的敏感性较弱，但发明人仍能够检测到破伤风毒素对NanoLuc-VAMP2的裂解(图7)。

这项工作表明：(i)可以捕获细胞来源的肉毒杆菌裂解的VAMP分子和破伤风裂解的VAMP分子，并且(ii)与酶融合不仅可以稳定VAMP分子，而且还允许靶向VAMP的肉毒杆菌和破伤风神经毒素的高通量筛选的高敏感度读出。

现在可以在梭菌敏感性细胞克隆中转导NanoLuc-VAMP2构建体，以检测神经毒素活性。NanoLuc-VAMP2构建体有可能在全球范围内加强破伤风产品的检测。破伤风疫苗已在WHO的全球基本药物清单中，因此我们基于细胞的检测的潜在市场规模可能很大。2012年，WHO启动了其全球疫苗行动计划，旨在到2020年将破伤风纳入全球免疫范围。主要的疫苗生产商，例如葛兰素史克、赛诺菲巴斯德和Mass Biologics，正致力于为发展中国家提供更便宜、更大数量的普通疫苗库存。因此，以基于细胞的测定法代替繁琐的动物模型是英国政府议事日程的当务之急。破伤风类毒素和肉毒杆菌疫苗被用于畜牧业，这代表了我们基于细胞的测定法的另一个潜在市场。我们的VAMP2-NanoLuc也可用于基于肉毒杆菌的治疗剂的药物生产。

通过本发明实用性的另一个实例，图14证明了表达Nanoluc-VAMP2的细胞可用于区分BoNT/B的新合成形式的效力。

材料和方法

病毒转导

商购获得病毒pQCXIP质粒(Clontech)，将VAMP2融合序列克隆到NotI和EcorI限制性位点。将HEK-293细胞在含有10％FBS的DMEM(Life Technologies)中培养。为了包装病毒，将HEK-293细胞接种在10cm培养皿中并生长至70-90％汇合。达到汇合后，用PBS洗涤细胞，将培养基替换为6ml SiMa细胞生长培养基(RPMI+10％FBS)。然后将细胞在37℃下孵育2小时，然后用病毒质粒转染。将5.25μg VAMP2融合pQCXIP质粒、2.6μg VSV-G质粒(病毒包膜)和2.6μg逆转录病毒Gag-Pol质粒(组特异性抗原和聚合酶)在400μl Optimem(LifeTechnologies)中稀释并涡旋。将聚乙烯亚胺(Polysciences)在400μl Optimem中稀释至0.13mg/ml，将其与DNA合并，然后在室温下孵育20分钟。将混合物逐滴加入细胞中，然后在37℃下放置过夜。再向细胞中加入9ml SiMa生长培养基，然后在32℃、5％CO₂下孵育24小时。收集来自HEK-293细胞的上清液并与6μg/ml聚凝胺(Sigma)混合，然后通过0.45μm过滤注射器。将3ml过滤后的培养基加入到6孔板中生长至50％汇合的SiMa细胞中，然后在室温下孵育20分钟。将板在室温下以2500rpm离心90分钟，并将细胞在7℃下孵育24小时。将培养基替换为新鲜的SiMa生长培养基，并使细胞再生长24小时或直至达到汇合。将细胞扩增到25cm²烧瓶中并在1μg/ml嘌呤霉素(Sigma)中培养以选择阳性转导的细胞。

NanoLuc测定

使SiMa细胞(DSMZ)和HEK-293细胞(ATCC)在37℃、5％CO₂下生长。将SiMa细胞在补充有10％FBS(Life Technologies)的RPMI(Life Technologies)中培养。为了检测VAMP2的裂解，将SiMa NLuc-VAMP2细胞接种在48孔板中，并如前所述进行分化(Rust等人，2016)。然后用指定浓度的毒素处理细胞并孵育72小时。毒素孵育后，除去培养基，用PBS洗涤孔一次。然后通过加入40μl基于Triton X100的细胞提取溶液(含有0.5％Triton X-100和1xSigmaFast蛋白酶抑制剂的PBS)使细胞透化。刮下细胞并转移到冰上的管中，将细胞在管中孵育20分钟，每3-4分钟涡旋一次。将细胞提取物在14000rpm、4℃下离心15分钟，将上清液转移到新管中，在-20℃下储存，直至进行测定。将预涂有Protein A(Thermo-Fisher)的96孔板与约3μg/ml抗裂解后的VAMP2的抗体在4℃孵育过夜。用含有0.05％Tween的PBS(PBS-T)洗涤孔3次，然后用1％BSA封闭1小时。将孔再次用PBS-T洗涤三次，然后加入细胞提取物(15μl细胞提取物和35μl PBS-T)，并在20℃下孵育90分钟。在PBS-T中再洗涤3次后，将Nano-Glo底物(Promega)(2μl，在50μl PBS-T中)加入孔中，并将板在室温下避光孵育5分钟。使用Fluoroskan Ascent酶标仪(Labsystems)测量发光。

合成HA-APEX2-VAMP2和HA-NanoLuc-VAMP2，并使用NotI和EcorI将其克隆到逆转录病毒表达载体pQCXIP中。

参考文献

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