具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提出一种PEDV的3C样蛋白酶抑制剂，旨在提供一种能治疗PED的3C样蛋白酶抑制剂。所述3C样蛋白酶抑制剂包括诃子酸及其同分异构体、槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷、曲克芦丁、柠檬酸酯B、芹菜素-7-O-(2G-鼠李糖)龙胆糖苷、brutieridin、Heraclenol3'-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside、Procyanidin B23,3'-di-O-gallate、柠檬酸酯A、苯甲酸苯甲醇葡萄糖酚苷和Heraclenol3'-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside中的至少一种。

PEDV编码的复制酶多聚蛋白(Replicase polyprotein 1a,ppla)和(Replicasepolyprotein 1ab,pplab)必须经过病毒蛋白酶的切割才能形成产生成熟的非结构蛋白，即在NSP3编码的木瓜样蛋白酶和NSP5编码的3C样蛋白酶的切割作用下产生NSP1～NSP16十六种非结构蛋白。其中木瓜样蛋白酶负责切割NSP1～NSP4之间的蛋白，而3C样蛋白酶负责切割NSP5～NSP16的之间的蛋白。此外，3C样蛋白酶也可以通过切割NEMO抑制宿主细胞产生干扰素，与PEDV的免疫逃逸密切相关。由于成熟的非结构蛋白在病毒转录、复制以及抗宿主细胞防御机制过程发挥至关重要的关键作用，所以3C样蛋白酶对于PEDV感染过程至关重要。

具体地，上述3C样蛋白酶抑制剂为从ZINC15数据库中的天然分子库中筛选得到的。其中，诃子酸(Chebulinic acid)即诃子林鞣酸，在天然分子库中的ID(为了便于描述，下文中的ID均指的是ZINC15数据库中的ID)为：ZINC000299817893；诃子酸同分异构体包括ID为ZINC000390835486、ZINC000257667213、ZINC000390835480的小分子；槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷即ID为ZINC000253390566的小分子；曲克芦丁(troxerutin)即ID为ZINC000299817570的小分子；柠檬酸酯B(Parishin B)即ID为ZINC000085643640的小分子；芹菜素-7-O-(2G-鼠李糖)龙胆糖苷即ID为ZINC000299817632的小分子；brutieridin即ID为ZINC000253389678的小分子；Heraclenol 3'-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside即ID为ZINC000107428706和ZINC000107428702的小分子；ProcyanidinB23,3'-di-O-gallate即ID为ZINC000150528319的小分子；柠檬酸酯A(parishin A)即ID为ZINC000257616571的小分子；苯甲酸苯甲醇葡萄糖酚苷即ID为ZINC000253389687的小分子。

较优地，所述3C样蛋白酶抑制剂为诃子酸及其同分异构体，更优地，所述3C样蛋白酶抑制剂为诃子酸，经实验验证得出：诃子酸对3C样蛋白酶的抑制效果较好。进一步地，诃子酸能够有效抑制PEDV对宿主细胞的感染。

本发明提供的PEDV 3C样蛋白酶抑制剂通过抑制PEDV3C样蛋白酶的活性，能够抑制PEDV感染宿主细胞，且抑制效果较好。进一步地，本发明提供的上述3C样蛋白酶抑制剂能够用来制备抗PEDV的药物，为上述分子开发了新的应用途径。

进一步地，本发明还提出一种如上所述的猪流行性腹泻病毒的3C样蛋白酶抑制剂的筛选方法，旨在提供一种高通量的筛选方法。所述筛选方法包括以下步骤：

步骤S10、以猪流行性腹泻病毒的3C样蛋白酶为靶点，以小分子数据库为筛选对象，将所述小分子数据库中的所有分子与所述3C样蛋白酶的活性区域进行分子对接，筛选得到亲和力排名前50～150的天然分子。

也即，采取虚拟筛选技术筛选得到小分子数据库中与3C样蛋白酶活性区域亲和力排名前50～150的天然分子。虚拟筛选又称计算机筛选，即使用分子对接软件分析目标靶点与药物分子之间亲和力大小，以减少实际筛选化合物的数目，同时提高先导化合物的发现效率。

其中，进行虚拟筛选的前提是获得靶点蛋白的晶体结构和活性位点，以及小分子化合物晶体结构的数据库。目前有许多免费的小分子数据库，本发明不限制所述小分子数据库的具体来源，为常规的能用作药物筛选的小分子数据库即可。在本实施例中，所述小分子数据库为ZINC15数据库，ZINC15数据库可以免费提供1300万可购买的小分子结构数据。

为了使所述小分子数据库更具有针对性，以节省工作量，进一步地，所述小分子数据库为所述ZINC15数据库中的天然分子库。所述天然分子库包含8万多个天然分子结构，由于所述天然分子库中的分子都为植物提取物，大多对机体无害，所以一经筛选且验证有效后可以快速应用于临床。

具体地，步骤S10包括：

步骤S11、将所述小分子数据库中的所有分子与所述3C样蛋白酶的活性区域使用Autodock Vina进行对接，初步筛选得到亲和力排名前9000～14000的初筛分子。

具体实施时，步骤S11包括以下步骤：

受体分子的准备：使用Autodock1.5.6软件对3C样蛋白酶(www.rcsb.org，蛋白编号为6U7K)晶体结构进行去水加氢处理并将分子存储为PDBQT文件。使用Discover Studio3.5打开受体分子，选择蛋白活性位点氨基酸，确定分子对接区域，其中，确定分子对接区域包括确定中心位点坐标和对接区域大小；

配体分子的准备：于ZINC15下载天然分子库中的分子结构(约8万个分子)，使用Raccon软件将所有分子分别转化为PDBQT文件。而后根据上述准备bat文件，使用AutodockVina运行bat文件进行分子对接，根据分子对接的结果进行排序，初步筛选得到亲和力排名前9000～14000的初筛分子。

可以理解的是，具体初步筛选出亲和力排名前多少的初筛分子可根据实际情况而定，并非只能筛选亲和力前9000～14000的分子。若想尽可能避免初筛淘汰了亲和力可能较好的分子，可以选择将初步筛选得到的初筛分子数量增加，如：筛选得到亲和力排名前20000的初筛分子；若想要节省工作量，可以适当将初步筛选的初筛分子数量减少，如：筛选得到亲和力排名前5000的初筛分子。

采用Autodock Vina进行的分子对接为刚性对接方法。刚性对接方法在计算过程中，参与对接的分子构像不发生变化，仅改变分子的空间位置与姿态，刚性对接方法的简化程度最高，计算量相对较小。

步骤S12、再使用Discovery studio将所有所述初筛分子与所述3C样蛋白酶进行柔性对接，精筛得到亲和力排名前50～150的天然分子。

由于步骤S11的初筛为刚性对接方法，准确度较低，因此，根据初筛结果，再使用Discovery studio将所有所述初筛分子与所述3C样蛋白酶进行柔性对接，精筛得到亲和力排名前50～150的天然分子。

步骤S20、将筛选得到的所述天然分子在细胞外和/或细胞内进行生物活性筛选，得到3C样蛋白酶抑制剂；

由于采用虚拟筛选最终得到的亲和力排名50～150的天然分子，其中具有3C样蛋白酶抑制剂活性的可能只有20～30％，因此，还需要对筛选得到的所述天然分子进行生物活性筛选，以得到具有活性的3C样蛋白酶抑制剂。

可以将所述天然分子直接在细胞外进行生物活性筛选，操作简单，节约成本，也可将所述天然分子再细胞内进行生物活性筛选，结果更加准确、有说服力。当然，也可以在细胞外和细胞内均进行生物活性筛选。

本发明不限制所述天然分子在细胞外和/或细胞内进行生物活性筛选的具体方法，在一实施例中，步骤S20包括：

S21、用荧光共振能量转移系统检测3C样蛋白酶抑制剂在细胞外的活性；和/或，

S22、用双荧光酶报告系统检测3C样蛋白酶抑制剂在细胞内的活性。

其中，荧光共振能量转移系统(fluorescence resonance energy transfer,FRET)和双荧光素酶报告系统配合384微孔板以及酶标仪也可以进行3C样蛋白酶抑制剂的高通量筛选。

需要说明的是，由于上述虚拟筛选的100种天然分子的不易获得，本发明实施例仅以诃子酸为例，来验证FRET体系和双荧光素酶报告系统对筛选得到的天然分子的生物活性检测的可行性。可以理解的是，还可以通过加入不同浓度的天然分子，以得到对PEDV 3C样蛋白酶的切割活性抑制效果最好的天然分子及其浓度，然后综合其成本、剂量、安全性等因素，选出最适作为抗PEDV的天然分子及其浓度。

在一具体实施例中，步骤S21包括：

步骤S210、根据3C样蛋白酶切割PEDV的复制酶多聚蛋白ppla和pplb的位点，合成修饰多肽Dabcyl-YNSTLQ↓AGLRKM-E-Edans，所述修饰多肽可被3C样蛋白酶切割，以使E-Edans的荧光信号被释放出来；

所述修饰多肽在完整情况下，其C端修饰基团Edans的荧光由于FRET效应会被N端的Dabcyl集团猝灭，而在3C样蛋白酶存在的情况下，所述修饰多肽被切割，FRET体系被破坏，E-Edans的荧光信号便被释放出来。

步骤S211、向所述修饰多肽加入所述3C样蛋白酶、所述3C样蛋白酶抑制剂和缓冲液，在340nm激发光条件下，检测480nm处的发射光强度，以检测所述3C样蛋白酶抑制剂的活性。

在另一具体实施例中，步骤S22包括以下步骤：

S220、将3C样蛋白酶切割多肽与萤火虫荧光素酶融合表达，并插入内含肽DnaE，得到环化报告质粒；

由于引入了内含肽DnaE，该报告质粒转染细胞后所表达的荧光素酶蛋白在自然状态下以环状蛋白的形式表达存在，环状蛋白之间存在很大的空间位阻，彼此难以靠近而避免了其自激活。只有细胞内表达3C样蛋白酶时，切割序列才能被识别切割，切割后空间位阻减小，萤火虫荧光素酶活性恢复，从而可以检测3C样蛋白酶的切割活性。

S221、将所述环化报告质粒、海肾荧光素酶质粒、以及表达所述3C样蛋白酶的质粒共转染293T细胞，转染后5～7h更换含有所述3C样蛋白酶抑制剂的维持液，转染后20～28h用双荧光素酶检测试剂盒检测3C样蛋白酶的切割活性。

在本发明提供的PEDV的3C样蛋白酶抑制剂的筛选方法中，以PEDV 3C样蛋白酶为靶点，以ZINC15数据库中的天然分子库为筛选对象，通过autodock vina和Discoverystudio(虚拟筛选技术)进行分子对接，获得亲和力排名前50～150的天然分子，然后通过FRET体系和/或荧光素酶报告系统进行生物活性检测，以得到具有生物活性的3C样蛋白酶抑制剂，该3C样蛋白酶抑制剂可以抑制3C样蛋白酶的活性，从而抑制PEDV的复制；此外，虚拟筛选技术较普通的筛选技术具有高通量、高效率以及低成本的优势，FRET体系以及荧光素酶报告系统也可以进行3C样蛋白酶抑制剂的高通量筛选。

此外，本发明还提出一种抗PEDV药物，所述药物的活性成分包括3C样蛋白酶抑制剂，所述3C样蛋白酶抑制剂包括诃子酸及其同分异构体、槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷、曲克芦丁、柠檬酸酯B、芹菜素-7-O-(2G-鼠李糖)龙胆糖苷、brutieridin、Heraclenol3'-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside、Procyanidin B23,3'-di-O-gallate、柠檬酸酯A和苯甲酸苯甲醇葡萄糖酚苷中的至少一种，较优地，所述3C样蛋白酶抑制剂为为诃子酸。

所述3C样蛋白酶抑制剂通过抑制3C样蛋白酶的活性，能够抑制PEDV的复制，从而抑制猪流行性腹泻病毒对宿主细胞的感染，以起到治疗猪流行性腹泻的作用。在具体实施时，可以将3C样蛋白酶抑制剂作为主要组分之一，加入药用常见辅料和载体制成抗猪流行性腹泻的药物。同时，上述药物可根据实际的需要选择合适的剂型，如片剂、注射剂、栓剂、气雾剂、缓释制剂、微囊、控释制剂、脂质体、纳米制剂等。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1 PEDV 3C样蛋白酶抑制剂的筛选

1、虚拟筛选

(1)受体分子的准备：使用Autodock1.5.6软件对3C样蛋白酶(www.rcsb.org，蛋白编号为6U7K)晶体结构进行去水加氢处理并将分子存储为PDBQT文件。使用DiscoverStudio 3.5打开受体分子，选择蛋白活性位点氨基酸，确定分子对接区域，包括中心位点坐标和对接区域大小。配体分子的准备：于ZINC15下载天然分子库中的分子结构(约8万个分子)，使用Raccon软件将所有分子分别转化为PDBQT文件。而后根据上述准备bat文件，使用Autodock Vina运行bat文件进行分子对接，筛选结束后提取结果，对所有分子对接的结果进行排序，选择亲和力前10000名的分子，即为初筛分子。

(2)再使用Discovery studio将所有初筛分子与3C样蛋白酶进行柔性对接，精筛得到亲和力排名前100的天然分子，其结果如表1(表1中/指的是无法查到或确定其名称)所示。

表1虚拟筛选结果

由表1可以看出，上述天然分子(如诃子酸)能有效结合PEDV 3C样蛋白酶的活性区域。

2、生物活性筛选

2.1、虚拟筛选得到的天然分子在细胞外的生物活性检测

(1)荧光共振能量转移系统(FRET)的构建

材料与方法：

根据PEDV 3C样蛋白酶切割PEDV复制酶多聚蛋白ppla和pplab的位点，于金斯瑞生物公司合成修饰多肽Dabcyl-YNSTLQ↓AGLRKM-E-Edans，该修饰多肽在完整情况下其C端修饰基团Edans的荧光由于FRET效应会被N端的Dabcyl集团猝灭。在3C样蛋白酶存在的情况下，多肽被切割，FRET体系被破坏，E-Edans的荧光信号便被释放出来。

为优化3C样蛋白酶活性检测体系，酶切反应体系为10μM的修饰多肽和1～10μg不同浓度的3C样蛋白酶(纯化后的PEDV 3C样蛋白酶)，反应体系总体积为200μL，缓冲液为20mM Tris/HCl溶液(pH 7.5)。使用多功能酶标仪于37℃，340nm激发光条件下，连续检测480nm发射光强度，确定最适的蛋白加入量。

实验结果：图1为PEDV 3C样蛋白酶的表达与纯化结果图，其中，(a)蛋白marker；(b)包涵体；(c)上清；(d)带GST标签的3C样蛋白酶；(e)去除GST标签的3C样蛋白酶，由图1可以看出，原核表达系统表达纯化了PEDV 3C样蛋白酶。图2为纯化后的PEDV 3C样蛋白酶在FRET体系中的切割活性检测图，由图2可以看出，纯化后的PEDV 3C样蛋白酶可以有效切割FRET底物，其切割活性呈剂量依赖性。综上，表明本发明构建的FRET体系可以在细胞外对PEDV 3C样蛋白酶的活性进行有效检测。

(2)虚拟筛选得到的天然分子对3C样蛋白酶活性的抑制效果检测材料和方法：

按照2.1中步骤(1)所优化的检测方法，在FRET反应体系中加入不同浓度的chebulinic acid(诃子酸，购买自成都普瑞法科技有限公司，纯度>95％)。使用多功能酶标仪于37℃，340nm激发光条件下，连续检测480nm发射光强度。根据荧光强度检测结果，计算chebulinic acid在各浓度条件下对PEDV 3C样蛋白酶切割活性的抑制作用。由图3可以看出，chebulinic acid(诃子酸)可以在细胞外抑制PEDV 3C样蛋白酶的活性且呈现明显的剂量依赖性。

2.2、虚拟筛选得到的天然分子在细胞内的生物活性检测

(1)双荧光素酶报告系统的构建

材料与方法：

将PEDV 3C样蛋白酶切割底物多肽(多肽序列：YNSTLQAGLRKM，Cleave peptides)与萤火虫荧光素酶(Firely inciferase)融合表达，构建了一种报告质粒(由于引入了内含肽DnaE，该报告质粒转染细胞后所表达的荧光素酶蛋白在自然状态下以环状蛋白的形式表达存在，环状蛋白之间存在很大的空间位阻，彼此难以靠近而避免了其自激活。只有细胞内表达3C样蛋白酶时，切割序列才能被识别切割，切割后空间位阻减小，萤火虫荧光素酶活性恢复，从而可以检测3C样蛋白酶的切割活性)，其报告质粒如图4所示。

将构建的报告质粒，海肾荧光素酶质粒(pRL-TK)以及表达3C样蛋白酶的质粒(pCAGGS-NSP5)共转染293T细胞，转染后24h用western blot检测发现，同时使用Promega双荧光素酶检测试剂盒检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性。

实验结果：

图5为PEDV 3C样蛋白酶切割环化萤火虫荧光素酶的Western blot验证结果图，由图5可以看出，转染表达3C样蛋白酶的质粒(pCAGGS-NSP5)后，环化的萤火虫荧光素酶可以被有效切割。图6为双荧光素酶检测试剂盒检测PEDV 3C样蛋白酶的切割活性结果图，由图6可以看出，转染pCAGGS-NSP5后的萤火虫荧光素酶活性显著高于对照组。综上，表明双荧光素酶报告系统可以在细胞内对PEDV 3C样蛋白酶的活性进行有效检测。

(2)虚拟筛选得到的天然分子对3C样蛋白酶活性的抑制效果检测

将pCAGGS-NSP5、2.2步骤(1)构建的报告质粒358DnaE-PEDV、以及pRL-TK共转染到293T细胞中，转染后6h跟换含有不同浓度chebulinic acid(诃子酸，购买自成都普瑞法科技有限公司，纯度>95％)的培养液，转染后24h后使用promega双荧光素酶试剂盒检测3C样蛋白酶的切割活性，其结果如图7所示，由图7可以看出，Chebulinic acid可以有效抑制PEDV 3C样蛋白酶的切割活性。

实施例2 PEDV 3C样蛋白酶抑制剂的抗PEDV效果验证

测试方法：使用PEDV YN144毒株感染Vero细胞(MOI＝0.001)，感染同时添加不同浓度的诃子酸(chebulinic acid)。感染后24h收集样品，使用TCID50测定、western blot以及间接免疫荧光试验评估chebulinic acid(诃子酸，购买自成都普瑞法科技有限公司，纯度>95％)对PEDV复制的影响，结果如图8至10所示。

由图7至9可以看出，Chebulinic acid在体外可以有效抑制PEDV的感染。

综上所述，本发明提供的PEDV 3C样蛋白酶抑制剂的筛选方法中，通过虚拟筛选，能够从大量小分子中高效的筛出PEDV 3C样蛋白酶抑制剂；通过提供的FRET体系和荧光素酶报告系统，能够在细胞外和细胞内对PEDV 3C样蛋白酶的活性进行有效检测。此外，筛选得到的PEDV 3C样蛋白酶抑制剂(如诃子酸)在体外可以有效抑制PEDV的感染，将其作为抗PEDV的药物，治疗效果较好。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。