阅读说明：本技术 一种糖基化麦谷蛋白的制备方法 (Preparation method of glycosylated glutenin ) 是由 王硕 王娅娅 王俊平 张燕 于 2019-09-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种糖基化麦谷蛋白的制备方法。该方法包括将小麦粉碎过筛、除淀粉、冻干、除脂、除清蛋白与球蛋白、除盐、除醇溶蛋白、冷冻干燥、研磨、均质、丙酮醛与麦谷蛋白糖化反应、超滤及真空冷冻干燥等步骤。本发明的糖基化麦谷蛋白方法简单,其麦谷蛋白的溶解度、乳化性及乳化稳定性显著提高。丙酮醛是麦谷蛋白与还原糖发生美拉德反应的中间产物,它与麦谷蛋白的相互作用降低了麦谷蛋白的疏水性,从而提高了其溶解性、乳化性和乳化稳定性。(The invention discloses a preparation method of glycosylated glutenin. The method comprises the steps of crushing and sieving wheat, removing starch, freeze-drying, degreasing, removing albumin and globulin, removing salt, removing alcohol soluble protein, freeze-drying, grinding, homogenizing, saccharifying reaction of methylglyoxal and glutenin, ultrafiltering, vacuum freeze-drying and the like. The glycosylation method of the glutenin is simple, and the solubility, the emulsibility and the emulsion stability of the glutenin are obviously improved. Methylglyoxal is an intermediate product of maillard reaction between glutenin and reducing sugar, and its interaction with glutenin reduces the hydrophobicity of glutenin, thereby improving its solubility, emulsifiability and emulsion stability.)

一种糖基化麦谷蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种糖基化麦谷蛋白的制备方法。

背景技术

麦谷蛋白是小麦中主要的蛋白质，麦谷蛋白来源丰富，营养价值高，应用范围广，具有较高的经济价值。麦谷蛋白具有独特的功能特性，主要应用于面粉、饲料、食品等领域。由于其独特的氨基酸组成方，使得溶解度、乳化性、起泡性等一些功能特性不佳。往往在直接使用中不能满足食品工业的需要，从而限制了它在食品加工中的应用范围及深度。因此，必须通过采用一些改良技术来弥补麦谷蛋白的这一缺陷，来改善其功能特性，拓宽其应用的领域。疏水性是溶解度和乳化性等功能特性的一个决定性因素。糖基化改性可以改变蛋白质疏水性，使蛋白质分子空间结构发生变化，最终增大蛋白质的溶解性，使蛋白质获得良好的功能特性，从而拓宽它的应用范围。

目前，改善蛋白功能特性的方法主要有化学法、物理法和酶法。其中化学改性由于具有对设备要求不高、成本较低、反应时间短且效果最为明显等优点，已成为蛋白改性的重要手段。针对小麦中的蛋白质经常用到的化学改性方法包括脱酰胺改性、磷酸化、酰化法、烷基化等。例如郑志等人通过脱酞胺改性小麦面筋蛋白来提高面筋蛋白的乳化性。目前通过化学改性来提高小麦中蛋白质功能性质的研究越来越多，这些方法包括脱酰胺改性、磷酸化，但很少有人研究糖基化改性小麦中蛋白质的功能性质。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种糖基化麦谷蛋白的制备方法，能够得到一种糖基化麦谷蛋白，该麦谷蛋白溶解度＞40％，乳化性＞11.1m²/mg，乳化稳定性＞51.6％。

本发明通过如下技术方案实现：

一种糖基化麦谷蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(1)粉碎过筛：将小麦粉碎后过筛，得到小麦面粉；过筛是过80-100目筛；

(2)除淀粉：用马丁法洗去小麦面粉中的淀粉，真空冷冻干燥得到面筋蛋白；

(3)除脂：加入正己烷除脂，通风橱过夜以除去正己烷，得到脱脂面筋蛋白；

(4)除清蛋白与球蛋白：将脱脂面筋蛋白与NaCl溶液混合均匀，室温下搅拌、离心、去上清，重复三次，得沉淀1；

(5)除盐：将沉淀1与水溶液混合均匀，室温下搅拌、离心、去上清，重复三次，得沉淀2；

(6)除醇溶蛋白：将沉淀2与乙醇溶液混合均匀，室温下搅拌、离心、去上清，重复三次，真空冷冻干燥后得麦谷蛋白，研磨成粉末备用；所得麦谷蛋白蛋白质量百分比含量为94％，溶解度为32％，乳化性为8.96m²/mg，乳化稳定性为28.88％；

(7)均质：准确称取一定量步骤6得到的麦谷蛋白粉末与超纯水溶液混合，得混悬液1，高速匀浆机分散，形成稳定悬浮液，并加入丙酮醛水溶液，得混悬液2；所述混悬液1的质量浓度为1-2mg/mL，所述匀浆机分散时间为10-20s，所述麦谷蛋白与丙酮醛的料液比为1:6-1:8(w/v)；

(8)改性：将混悬液2分装于哈希管中，加热得混悬液3；

(9)超滤离心：取混悬液3，冷却至室温后，超滤离心，得混悬液4；

(10)真空冷冻干燥：对混悬液4真空冷冻干燥后得糖基化麦谷蛋白，得到的麦谷蛋白溶解度＞40％，乳化性＞11.1m²/mg，乳化稳定性＞51.6％。

进一步地，步骤(2)所述洗淀粉的次数为20-40次。

进一步地，步骤(3)所述面筋蛋白与正己烷的料液比为1:10-1:20(w/v)，脱脂时间为18-32h。

进一步地，步骤(4)所述Nacl溶液为0.4-0.6mol/L，所述料液比为1:10-1:20(w/v)，搅拌时间为1-3h，离心转速为9000-10000g，离心时间为20-30min。

进一步地，步骤(5)所述沉淀1与水的料液比为1:10-1:20(w/v)，搅拌时间为1-3h，离心转速为9000-10000g，离心时间为20-30min。

进一步地，步骤(6)所述乙醇溶液体积分数为70-90％，所述沉淀2与乙醇溶液的料液比为1:15-1:20(w/v)，搅拌时间为1-3h，离心转速为9000-10000g，离心时间为20-30min。

进一步地，步骤(8)所述改性为糖基化改性，加热温度为100-180℃，加热时间为8-18min。

进一步地，步骤(9)所述超滤离心转速为3000-5000rpm/min，离心时间为5-15min，截留分子量为5000-8000Da。

进一步地，步骤(6)得到的麦谷蛋白蛋白含量为94％(质量百分比)，溶解度为32％，乳化性为8.96m²/mg，乳化稳定性为28.88％；步骤(10)得到的麦谷蛋白溶解度＞40％，乳化性＞11.1m²/mg，乳化稳定性＞51.6％。由于具有较高的乳化性和乳化稳定性，本发明采用糖基化处理改善面筋蛋白溶解性能,使麦谷蛋白溶解度由约32％提高至约40％,从而获得良好的功能特性，拓宽了麦谷蛋白的应用范围，有利于食品包装材料的制备，从而对延长食品保质期做出重大的贡献等。

本发明提供一种由上述的提取与糖基化改性方法制得的糖基化麦谷蛋白。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明提供糖基化麦谷蛋白是通过丙酮醛与麦谷蛋白的糖基化反应制备得到的，该糖基化麦谷蛋白与天然麦谷蛋白相比具有良好的溶解度，其溶解度提高了8％。

(2)本发明提供的糖基化麦谷蛋白与天然麦谷蛋白相比具有良好的乳化性和乳化稳定性，其乳化性提高了2.14m²/mg。

(3)本发明提供的糖基化方法与其他的化学改性方法相比具有操作简单，条件容易控制，成本较低等优点。

附图说明

图1为实施例1-5所得糖基化麦谷蛋白的褐变值(a)和糖基化过程中产生的中间产物Amadori产物的含量(b)。

图2为实施例1-5所得热处理麦谷蛋白和糖基化麦谷蛋白的溶解度。

图3为实施例1-5所得热处理麦谷蛋白和糖基化麦谷蛋白的乳化性(a)和乳化稳定性(b)。

具体实施方式

以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。

实施例1

用超微粉碎机将小麦制成干粉，过80目筛，得到粗小麦粉。用马丁法洗20次去除小麦面粉中的淀粉，冻干得到面筋蛋白。按1:10(w/v)的料液比加入正己烷，搅拌均匀成混悬液，置于通风橱中18h，以除去脂肪。得到的去脂面筋蛋白，按照1:10(w/v)的料液比加入0.6mol/L NaCl溶液，室温下搅拌1h，然后将悬浮液在10000g下离心20min，收集沉淀物，重复三次，得沉淀1。在沉淀1中按1:10(w/v)的料液比加入蒸馏水，在室温下搅拌1h以除去NaCl，然后将悬浮液在10000g下离心20min，收集沉淀物，重复三次，得沉淀2。在该沉淀物中按1:20(w/v)的料液比加入90％的乙醇，并以10000g离心20min以除去醇溶蛋白，收集沉淀物，重复三次，冻干并研磨成粉末以获得天然麦谷蛋白。准确称取一定量的天然麦谷蛋白，加入超纯水中，形成质量浓度为2mg/mL的混悬液1。高速匀浆机分散20s，按照1:6(w/v)的料液比加入40％的丙酮醛水溶液，得混悬液2。将混悬液2分装于12mL的哈希管中，每管5mL，在100℃下反应15min，得混悬液3。取混悬液3，冷却至室温后，3000rpm/min超滤离心15min，截留分子量为3000Da，得混悬液4。对混悬液4冷冻干燥后得糖基化麦谷蛋白。

实施例2

用超微粉碎机将小麦制成干粉，过100目筛，得到粗小麦粉。用马丁法洗20次去除小麦面粉中的淀粉，冻干得到面筋蛋白。按1:10(w/v)的料液比加入正己烷，搅拌均匀成混悬液，置于通风橱中18h，以除去脂肪。得到的去脂面筋蛋白，按照1:10(w/v)的料液比加入0.6mol/L NaCl溶液，室温下搅拌2h，然后将悬浮液在10000g下离心20min，收集沉淀物，重复三次，得沉淀1。在沉淀1中按1:10(w/v)的料液比加入蒸馏水，在室温下搅拌2h以除去NaCl，然后将悬浮液在10000g下离心20min，收集沉淀物，重复三次，得沉淀2。在该沉淀物中按1:15(w/v)的料液比加入80％的乙醇，并以10000g离心20min以除去醇溶蛋白，收集沉淀物，重复三次，冻干并研磨成粉末以获得天然麦谷蛋白。准确称取一定量的天然麦谷蛋白，加入超纯水中，形成质量浓度为2mg/mL的混悬液1。高速匀浆机分散20s，按照1:7(w/v)的料液比加入40％的丙酮醛水溶液，得混悬液2。将混悬液2分装于12mL的哈希管中，每管5mL，在120℃下反应15min，得混悬液3。取混悬液3，冷却至室温后，3000rpm/min超滤离心15min，截留分子量为3000Da，得混悬液4。对混悬液4冷冻干燥后得糖基化麦谷蛋白。

实施例3

用超微粉碎机将小麦制成干粉，过90目筛，得到粗小麦粉。用马丁法洗20次去除小麦面粉中的淀粉，冻干得到面筋蛋白。按1:15(w/v)的料液比加入正己烷，搅拌均匀成混悬液，置于通风橱中32h，以除去脂肪。得到的去脂面筋蛋白，按照1:15(w/v)的料液比加入0.6mol/L NaCl溶液，室温下搅拌2h，然后将悬浮液在9500g下离心25min，收集沉淀物，重复三次，得沉淀1。在沉淀1中按1:15(w/v)的料液比加入蒸馏水，在室温下搅拌2h以除去NaCl，然后将悬浮液在9500g下离心25min，收集沉淀物，重复三次，得沉淀2。在该沉淀物中按1:20(w/v)的料液比加入80％的乙醇，并以9500g离心25min以除去醇溶蛋白，收集沉淀物，重复三次，冻干并研磨成粉末以获得天然麦谷蛋白。准确称取一定量的天然麦谷蛋白，加入超纯水中，形成质量浓度为2mg/mL的混悬液1。高速匀浆机分散15s，按照1：8(w/v)的料液比加入40％的丙酮醛水溶液，得混悬液2。将混悬液2分装于12mL的哈希管中，每管5mL，在140℃下反应15min，得混悬液3。取混悬液3，冷却至室温后，4000rpm/min超滤离心10min，截留分子量为2000Da，得混悬液4。对混悬液4冷冻干燥后得糖基化麦谷蛋白。

实施例4

用超微粉碎机将小麦制成干粉，过80目筛，得到粗小麦粉。用马丁法洗20次去除小麦面粉中的淀粉，冻干得到面筋蛋白。按麦谷蛋白与正己烷的比例为1:15(w/v)加入正己烷，搅拌均匀成混悬液，置于通风橱中24h，以除去脂肪。得到的去脂面筋蛋白，按照1:15(w/v)的料液比加入0.4mol/L NaCl溶液，室温下搅拌3h，然后将悬浮液在9000g下离心30min，收集沉淀物，重复三次，得沉淀1。在沉淀1中按1:15(w/v)的料液比加入蒸馏水，在室温下搅拌3h以除去NaCl，然后将悬浮液在9000g下离心25min，收集沉淀物，重复三次，得沉淀2。在该沉淀物中按1:20(w/v)的料液比加入80％的乙醇，并以9000g离心30min以除去醇溶蛋白，收集沉淀物，重复三次，冻干并研磨成粉末以获得天然麦谷蛋白。准确称取一定量的天然麦谷蛋白，加入超纯水中，形成质量浓度为1mg/mL的混悬液1。高速匀浆机分散15s，按麦谷蛋白与丙酮醛的比例为1：8(w/v)加入40％的丙酮醛水溶液，得混悬液2。将混悬液2分装于12mL的哈希管中，每管5mL，在160℃下反应15min，得混悬液3。取混悬液3，冷却至室温后，4000rpm/min超滤离心10min，截留分子量为2000Da，得混悬液4。对混悬液4冷冻干燥后得糖基化麦谷蛋白。

实施例5

用超微粉碎机将小麦制成干粉，过100目筛，得到粗小麦粉。用马丁法洗30次去除小麦面粉中的淀粉，冻干得到面筋蛋白。按1:20(w/v)的料液比加入正己烷，搅拌均匀成混悬液，置于通风橱中24h，以除去脂肪。得到的去脂面筋蛋白，按照1:20(w/v)的料液比加入0.4mol/L NaCl溶液，室温下搅拌3h，然后将悬浮液在9000g下离心30min，收集沉淀物，重复三次，得沉淀1。在沉淀1中按1:20(w/v)的料液比加入蒸馏水，在室温下搅拌3h以除去NaCl，然后将悬浮液在9000g下离心30min，收集沉淀物，重复三次，得沉淀2。在该沉淀物中按1:150(w/v)的料液比加入70％的乙醇，并以9000g离心30min以除去醇溶蛋白，收集沉淀物，重复三次，冻干并研磨成粉末以获得天然麦谷蛋白。准确称取一定量的天然麦谷蛋白，加入超纯水中，形成质量浓度为1mg/mL的混悬液1。高速匀浆机分散10s，按照麦谷蛋白与丙酮醛的比例为1：8(w/v)加入40％的丙酮醛水溶液，得混悬液2。将混悬液2分装于12mL的哈希管中，每管5mL，在180℃下反应15min，得混悬液3。取混悬液3，冷却至室温后，5000rpm/min超滤离心5min，截留分子量为1000Da，得混悬液4。对混悬液4冷冻干燥后得糖基化麦谷蛋白。

实施效果测试：

测试：检测实施例1-5制得的糖基化麦谷蛋白的溶解性、乳化性和乳化稳定性。

1.检测方法

(1)褐变值的测定：如先前报道的那样测定褐变值并进行一些修改：使用0.1％(w/v)SDS将蛋白质样品稀释至0.2％(w/v)作为空白。检测420nm处的吸光度以评估褐变值。

(2)Amadori产物的测定：将糖化反应后的麦谷蛋白样品用磷酸盐缓冲液(10mM，pH7.0)稀释成1.0mg/ml，取100μL于离心管中，按照1:10(麦谷蛋白：硝基四唑氮蓝，v/v)的比例加入含0.25mM硝基四唑氮蓝(NBT)的碳酸盐缓冲液(100mM，pH10.8)，混匀后在37℃水浴反应45min，反应完全后运用紫外分光光度计测定其在525nm下的吸光度值(A525)，同时测定空白值(以磷酸盐缓冲液代替样品测定)。每组样品测定3组，取平均值为最终结果。Amadori产物含量(nM/mL)运用消光系数12640M^-1cm^-1计算。

(3)溶解度的测定：取1g蛋白质样品，将其分散于5ml超纯水中，用磁力搅拌器在室温下1小时，然后在7000g下离心20min。使用BCA试剂盒测定上清液的蛋白质含量(N×5.7)。溶解度为上清液溶液中蛋白质的含量与悬浮液中蛋白质含量之比。

(4)乳化性与乳化稳定性的测定：使用Pearce和Kinsella(1978)描述的改进的比浊法评价糖基化蛋白质的乳化活性(EAI)和乳液稳定性(ESI)。称量2g蛋白质样品，将其分散于100mL pH7.0的磷酸盐缓冲溶液中，取15mL的分散液，与5mL的大豆油混合，使用匀浆机10000rpm下均质1min，均质后立即从溶液底部吸取5μL乳液，然后将50微升乳液直接移到含有5mL SDS溶液(0.1％)的试管中，使用分光光度计以500nm的波长读取吸光度，记为A0。然后在均质后10min再次从溶液底部吸取5μL乳液，将50微升乳液直接移到含有5mL SDS溶液的试管中，以500nm的波长读取吸光度，记为A10。使用以下公式计算EAI和ESI值：

其中DF是稀释因子(100)，C是蛋白质浓度(g/mL)，ψ是光程(1cm)，θ是油体积分数(0.25)，A0和A10是吸光度值。每次测定均重复三次。

2.实验结果分析

(1)糖基化麦谷蛋白的褐变值和Amadori产物含量分析

丙酮醛与麦谷蛋白之间的反应为非酶褐变反应，反应过程中蛋白质悬浮液的褐变程度反映了丙酮醛与麦谷蛋白的反应程度。由图1a可知，麦谷蛋白的糖基化程度与温度有关，加热温度越高，糖基化程度越高。麦谷蛋白本身和麦谷蛋白单独加热时没有产生Amadori化合物。当丙酮醛与麦谷蛋白混合加热(100-180℃)时均测得了Amadori化合物，说明麦谷蛋白与丙酮醛发生了糖基化反应进而产生Amadori产物。同时，随着加热温度从100℃升高到180℃，生成的Amadori产物的含量也随之增加，样品中Amadori产物的浓度从2.20±0.10nM/mL增加到3.43±0.04nM/mL，说明加热温度越高，麦谷蛋白与丙酮醛反应程度越大。

(1)糖基化麦谷蛋白溶解度结果分析

天然麦谷蛋白的溶解度很低，而经过糖基化之后麦谷蛋白的溶解度显著提高(如图2所示)，溶解度的提高与糖化程度有关。糖基化程度越高，麦谷蛋白的溶解度越高。而单独加热的麦谷蛋白溶解度反而降低。

(3)糖基化麦谷蛋白乳化性及乳化稳定性结果分析

丙酮醛糖基化可以改善麦谷蛋白的乳化性与乳化稳定性。如图3所示，糖化麦谷蛋白的乳化性与加热温度有关，当加热温度问180℃时，糖化麦谷蛋白的乳化性和乳化稳定性最高。糖化麦谷蛋白的乳化能力和乳液稳定性的增加可能是由于分子大小的增加和溶解度的增加。可溶性谷蛋白含量随着温度的升高而增加，并且更多的蛋白质被吸附到乳液液滴的表面。这些相互作用导致乳液滴的较少絮凝，从而增强蛋白质乳化。

(2)糖基化麦谷蛋白表面疏水性的结果分析

糖基化麦谷蛋白表面疏水性随着糖基化温度的升高而降低，这意味着溶解度的增高与疏水性的变化有关。表面疏水性是溶解度的决定因素。

本发明实施例可见，整个制备工艺流程简单、各环节均可达食品级要求，制备成本低。

以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。