阅读说明：本技术 一类细胞器靶向的聚集诱导发光材料及其制备方法 (Organelle targeted aggregation-induced emission material and preparation method thereof ) 是由 党东锋 胥艳子 王直 申起飞 赵博 孟令杰 于 2019-09-27 设计创作，主要内容包括：一类细胞器靶向的聚集诱导发光材料及其制备方法,步骤为：1)以三苯胺类硼酸酯与芳基溴类化合物为原料,在甲苯溶液中充分完全溶解后,加入碳酸钾溶液及乙醇溶剂,并以四三苯基膦钯为反应催化剂,氮气反应,经加萃取、洗涤、去除溶剂和柱层析纯化后获得目标材料；当步骤一中的芳基溴类化合物为2,5-二溴吡啶和2,5-二溴吡嗪时,步骤一产物和碘甲烷为原料,在甲苯中溶解,加热反应,去除甲苯溶剂之后,加入六氟磷酸钠及乙腈使之充分溶解,室温下搅拌12-24小时之后,经水洗、减压去除溶剂及重结晶后,也可获得目标荧光产物；本发明制备和纯化成本较低；具有优异的荧光发射性能,能够实现在细胞内多个细胞器的特异性靶向成像性能研究。(A kind of organelle targeted aggregation-induced emission material and its preparation method, the steps are: 1) triphenylamine borate and aryl bromine compounds are used as raw materials, potassium carbonate solution and ethanol solvent are added after the triphenylamine borate and the aryl bromine compounds are fully and completely dissolved in toluene solution, palladium tetratriphenylphosphine is used as a reaction catalyst, nitrogen gas is used for reaction, and a target material is obtained after extraction, washing, solvent removal and column chromatography purification; when the aryl bromine compound in the first step is 2, 5-dibromopyridine and 2, 5-dibromopyrazine, the product in the first step and iodomethane are used as raw materials, the raw materials are dissolved in toluene, the heating reaction is carried out, after the toluene solvent is removed, sodium hexafluorophosphate and acetonitrile are added to be fully dissolved, and after the raw materials are stirred for 12 to 24 hours at room temperature, the solvent is removed through water washing and decompression, and recrystallization is carried out, the target fluorescent product can also be obtained; the preparation and purification cost is low; the fluorescent probe has excellent fluorescence emission performance and can realize the specific target imaging performance research of a plurality of organelles in cells.)

一类细胞器靶向的聚集诱导发光材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及有机荧光材料及其生物成像技术领域，特别涉及一类细胞器靶向的聚集诱导发光材料及其制备方法。

背景技术

相较于无机荧光材料，有机荧光材料通常具有优良的发光性能和生物相容性能，在细胞成像等生物医用领域显示了良好的应用前景。与此同时，有机荧光材料良好的结构可调性能，也能够为进一步满足其在生物成像领域的深入应用提供可能。然而，值得注意的是，对于传统的有机荧光材料而言，虽然其在溶液等单分子状态下能够显示出较好的发光效率及亮度，但是在固态等聚集状态下，其发光亮度通常会发生严重的淬灭现象，即聚集导致荧光淬灭，这严重限制了其在生物成像等领域内的深入应用。幸运的是，2001年唐本忠院士团队提出了“聚集诱导发光”的概念，并提出了分子转子运动受限的理论机制，为获得聚集状态下的高效发光提出了新的思路和方法。因此，通过构筑具有聚集诱导发光特性的有机荧光材料无疑为获得高效聚集态发光及其高性能荧光成像奠定了夯实基础。

另一方面，研究证明，脂滴、线粒体、细胞膜和细胞核等细胞器在细胞新陈代谢和细胞凋亡等过程中都发挥着重要作用，因此通过开发细胞器靶向的有机发光材料，实现其在细胞器内的定向追踪和可视化监测，无疑能够为理解上述细胞内关键过程及行为提供方法和途径。因此，综上所述，如何通过分子设计，实现具有聚集诱导发光特性的有机荧光材料，并且实现其在细胞内的特异性靶向成像，是目前有机荧光材料制备及其细胞成像领域内的研究热点之一。

发明内容

为了解决传统有机荧光材料聚集态发光性能差的问题，并且实现其在细胞内的特异性靶向成像，本发明的目的在于提供一类细胞器靶向的聚集诱导发光材料及其制备方法；相较于溶液状态，构筑的聚集诱导发光材料在形成聚集体之后显示了更为优异的荧光发射性能；同时该类材料也具有较好的生物相容性能，能够较好地应用于脂滴和线粒体等细胞器的特异性靶向成像，为进一步动态观察细胞状态、理解细胞内细胞器间相互作用等提供了可靠方法和途径。

为了达到上述目的，本发明的技术方案为：

一类细胞器靶向的聚集诱导发光材料，具有如下结构式：

其中

为---H、--OCH₃或

为

基于上述一类细胞器靶向的聚集诱导发光材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：以三苯胺类硼酸酯与芳基溴类化合物为原料，在甲苯溶液中充分完全溶解后，加入碳酸钾溶液及乙醇溶剂，并以四三苯基膦钯为反应催化剂，80℃-100℃氮气保护条件下反应15-30小时后，经加水淬灭、有机溶液萃取、洗涤、去除溶剂和柱层析纯化后获得目标有机聚集诱导发光材料。

所述的三苯胺类硼酸酯包括4-硼酸酯三苯胺、4-硼酸酯-4',4'-二甲氧基三苯胺或4-硼酸酯-4',4'-二叔丁基三苯胺。

所述的芳基溴类化合物包括2,5-二溴吡啶、2,5-二溴吡嗪、4,7-二溴-2,1,3-苯并噻二唑或4,7-二溴-[1,2,5]噻二唑并[3,4-c]吡啶。

所述的三苯胺类硼酸酯与芳基溴类化合物之间的摩尔比为(2.1-2.8)：1；碳酸钾与芳基溴类化合物的摩尔比为(5-15)：1，四三苯基膦钯与芳基溴类化合物的摩尔比为(2-6)：100，甲苯与乙醇的体积比为(10-40)：1。

当步骤一中的芳基溴类化合物为2,5-二溴吡啶或2,5-二溴吡嗪时，将步骤一所得产物通过以下步骤能够获得不同细胞器靶向的聚集诱导发光材料，具体为：

将步骤一产物和碘甲烷为原料，加入甲苯使之充分溶解，80℃-90℃加热反应12-24小时，去除甲苯溶剂之后，加入六氟磷酸钠，并在乙腈中使之充分溶解，室温下搅拌12-24小时之后，经水洗、减压去除溶剂及重结晶后，获得靶向不同的目标有机聚集诱导发光材料。

所述的步骤一所得产物与碘甲烷之间的摩尔比为1：(1.5-5.0)；步骤一所得产物与六氟磷酸钠之间的摩尔比为1：(5.0-15.0)。

本发明所涉及的目标化合物合成及纯化工艺简单，制备成本较低。所得目标化合物可溶解于二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃和二甲基亚砜等常用有机溶剂，并且具有一定的紫外吸收性能及荧光发射性能。构筑的目标化合物同时具有优异的聚集诱导发光特性，显示了其良好的固态发光性能。与此同时，利用目标化合物进行细胞标记和染色时发现，其在脂滴、线粒体等细胞器内可以实现良好的特异性成像性能。

附图说明

图1为本发明中的目标化合物(I)在四氢呋喃溶液中的紫外吸收光谱图和荧光发射光谱图。

图2为本发明中的目标化合物(I)在四氢呋喃和水不同比例混合溶液中的荧光发射光谱图。

图3为本发明中的目标化合物(I)在固态下的荧光发射光谱图。

图4为本发明中的目标化合物(I，A)和Nile Red(B)在HeLa细胞中的荧光共聚焦成像示意图。

图5为本发明中的目标化合物(I)在HeLa细胞中的双光子荧光共聚焦成像示意图。

图6为本发明中的目标化合物(Ⅱ)在四氢呋喃溶液中的激发和发射二维光谱图。

图7为本发明中的目标化合物(Ⅱ)在四氢呋喃和水不同比例混合溶液中的荧光发射光谱图。

图8为本发明中的目标化合物(Ⅲ)在四氢呋喃溶液中的紫外吸收光谱图和荧光发射光谱图。

图9为本发明中的目标化合物(Ⅲ)在四氢呋喃和水不同比例混合溶液中的荧光发射光谱图。

图10为本发明中的目标化合物(Ⅲ)在固态下的荧光发射光谱图。

图11为本发明中的目标化合物(Ⅲ，A)和MitoTracker Red(B)在HeLa细胞中的荧光共聚焦成像示意图。

图12为本发明中的目标化合物(Ⅲ)在HeLa细胞中的双光子荧光共聚焦成像示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做详细的叙述。

实施例一

本实施例的细胞器靶向的聚集诱导发光材料，具有如下(I)的结构式：

本实施例的聚集诱导发光材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：以4-硼酸酯三苯胺和2,5-二溴吡啶为原料，在甲苯溶液中充分溶解后，加入碳酸钾溶液及乙醇溶剂，并以四三苯基膦钯为反应催化剂，90℃氮气保护条件下反应20小时后，经加水淬灭、有机溶液萃取、洗涤、去除溶剂和柱层析纯化后获得目标化合物(I)。

所述的4-硼酸酯三苯胺和2,5-二溴吡啶之间的摩尔比为2.5：1，碳酸钾与2,5-二溴吡啶的摩尔比为6：1，四三苯基膦钯与2,5-二溴吡啶的摩尔比为3：100，甲苯与乙醇的体积比为20：1。

反应式为：

具体操作为：在250mL单口瓶中加入2,5-二溴吡啶(2.0g，8.5mmol)和4-硼酸酯三苯胺(7.8g，21.1mmol)，并加入甲苯70mL使之充分溶解。溶解后，继续加入无水乙醇3.5mL及浓度为2mol/L的无水碳酸钾溶液(25mL)。之后，在氮气保护条件下加入四三苯基膦钯(295mg)。加热回流反应20小时后，向反应容器中加入去离子水50mL淬灭反应，并选用二氯甲烷萃取反应混合液三次(3×100mL)，合并的有机溶液经水洗(3×80mL)，减压去除溶剂后获得粗产物。选用石油醚和二氯甲烷混合溶剂作为展开剂，经柱层析分离提纯后获得白色产物3.6g，产率为76％。

产物的核磁波谱图为：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.90(s,1H),7.94-7.90(m,3H),7.74(d,J＝8.3Hz,1H),7.53(d,J＝8.7Hz,2H),7.33-7.28(m,8H),7.20-7.17(m,12H),7.10-7.06(m,4H).

图1为本发明中的目标化合物(I)在四氢呋喃溶液中的紫外吸收光谱图和荧光发射光谱图。研究结果说明目标化合物(I)在溶液状态中具有良好的紫外吸收性能(300nm-400nm)和荧光发射性能(400nm-500nm)；图2和图3分别为本发明中的目标化合物(I)在四氢呋喃和水不同比例混合溶液中和固态粉末状态下的荧光发射光谱图。研究显示随着混合溶液中水含量的增加，混合体系中逐渐形成目标化合物(I)的纳米聚集体，其荧光强度也逐渐提升，显示了一定的聚集诱导发光性能及优良的固态发光性能；图4为本发明中的目标化合物(I)在HeLa细胞中的荧光共聚焦成像示意图。通过与商用的脂滴标记染料Nile Red共染发现，目标化合物(I)可以实现良好的细胞内脂滴特异性成像；图5为本发明中的目标化合物(I)在HeLa细胞中的双光子荧光共聚焦成像示意图。结果显示，目标化合物(I)也可以通过双光子激发实现其在细胞内脂滴的特异性荧光成像研究。

实施例二

本实施例的细胞器靶向的聚集诱导发光材料，具有如下(Ⅱ)的结构式：

本实施例的聚集诱导发光材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：以4-硼酸酯-4',4'-二甲氧基三苯胺和4,7-二溴-2,1,3-苯并噻二唑为原料，在甲苯溶液中充分溶解后，加入碳酸钾溶液及乙醇溶剂，并以四三苯基膦钯为反应催化剂，85℃氮气保护条件下反应24小时后，经加水淬灭、有机溶液萃取、洗涤、去除溶剂和柱层析纯化后，获得目标化合物(Ⅱ)。

所述的4-硼酸酯-4',4'-二甲氧基三苯胺和4,7-二溴-2,1,3-苯并噻二唑之间的摩尔比为2.5：1，碳酸钾与4,7-二溴-2,1,3-苯并噻二唑的摩尔比6：1，四三苯基膦钯与4,7-二溴-2,1,3-苯并噻二唑的摩尔比为3：100，甲苯与乙醇的体积比为20：1。

反应式为：

具体操作为：在100mL单口瓶中依次加入4,7-二溴-2,1,3-苯并噻二唑(1.0g，3.4mmol)和4-硼酸酯-4',4'-二甲氧基三苯胺(3.6g，8.5mmol)，并加入甲苯50mL使之充分溶解。之后，继续加入无水乙醇2.5mL及浓度为2mol/L的无水碳酸钾溶液(10mL)。之后，在氮气保护条件下加入四三苯基膦钯(118mg)。85℃加热反应24小时后，向反应体系中加入去离子水(10mL)淬灭反应，并选用三氯甲烷萃取反应混合液(3×100mL)，合并的有机层经水洗(3×80mL)和减压去除溶剂后获得粗产物。选用石油醚和二氯甲烷混合溶剂作为展开剂，经柱层析分离提纯后获得红色产物1.6g，产率为65％。

产物的核磁波谱图为：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.83(d,J＝8.8Hz,4H),7.72(s,2H),7.17(d,J＝9.0Hz,8H),7.08(d,J＝8.8Hz,4H),6.89(d,J＝9.0Hz,8H),3.84(s,12H).

图6为本发明中的目标化合物(Ⅱ)在四氢呋喃溶液中的激发和发射二维光谱图。研究发现在激发波长为250nm-450nm范围内时，目标化合物(Ⅱ)均可以产生明显的红色荧光，其最大发射波长大约在670nm处左右。图7为本发明中的目标化合物(Ⅱ)在四氢呋喃和水不同比例混合溶液中的荧光发射光谱图。研究发现，随着混合体系中水含量的增多，目标化合物(Ⅱ)的荧光发射强度有了明显提升。尤其是，相较于溶液状态，目标化合物(Ⅱ)在水含量为90％的聚集状态下显示了更好的荧光发射性能，证明了其优异的聚集诱导发光性能。

实施例三

本实施例的细胞器靶向的聚集诱导发光材料，具有如下(Ⅲ)的结构式：

本实施例的聚集诱导发光材料的制备方法，包括以下步骤：

以实施例一产物和碘甲烷为原料，加入甲苯使之充分溶解，88℃加热反应18小时。去除甲苯溶剂之后，加入六氟磷酸钠，在乙腈中使之充分溶解。室温下搅拌18小时之后，经水洗、减压去除溶剂及重结晶后，获得目标荧光产物(Ⅲ)。

所述的实施例一产物与碘甲烷之间的摩尔比为1：2.5；实施例一产物与六氟磷酸钠之间的摩尔比为1：10。

反应式为：

具体操作为：在50mL单口瓶中加入实施例一产物(0.6g，1.0mmol)和碘甲烷(0.38g，2.5mmol)，加入甲苯20mL使之充分溶解，88℃加热反应18小时。之后，去除甲苯溶剂，并向反应容器内加入六氟磷酸钠(1.6g，10.0mmol)，并加入200mL乙腈充分溶解。室温下搅拌18小时之后，反应体系经水洗(3×50mL)及减压去除溶剂后获得粗产物。粗产物经过乙腈重结晶，获得橙色目标产物3.6g，产率为76％。

产物的核磁波谱图为：¹H NMR(600MHz,d6-DMSO):δ＝9.39(s,1H),8.80(d,J＝8.4Hz,1H),8.07(d,J＝8.4Hz,1H),7.82(d,J＝8.4Hz,2H),7.57(d,J＝8.4Hz,2H),7.44-7.38(m,8H),7.23-7.02(m,16H)ppm。

图8为本发明中的目标化合物(Ⅲ)在四氢呋喃溶液中的紫外吸收光谱图和荧光发射光谱图。研究结果说明目标化合物(Ⅲ)在溶液状态中具有良好的紫外吸收性能和荧光发射性能，其吸收光谱范围在250nm-500nm之间，而发射光谱在450nm-750nm之间；图9和图10分别为本发明中的目标化合物(Ⅲ)在四氢呋喃和水不同比例混合溶液中及其固态粉末状态下的荧光发射光谱图。研究结果显示随着混合体系中水含量的增加，其荧光强度也逐渐提升，显示了优异的聚集诱导发光性能。值得注意的是，目标化合物(Ⅲ)在水含量为90％及固态等聚集状态下显示了极为优异的荧光发射性能。图11为本发明中的目标化合物(Ⅲ)在HeLa细胞中的荧光共聚焦成像示意图。通过与商用的线粒体标记染料MitoTracker Red共染发现，目标化合物(Ⅲ)可以实现良好的细胞内线粒体特异性成像；图12为本发明中的目标化合物(Ⅲ)在HeLa细胞中的双光子荧光共聚焦成像示意图。结果显示，目标化合物(Ⅲ)也可以通过双光子激发实现其在细胞内线粒体的特异性荧光成像研究。

实施例四

具有结构如(Ⅲ)的细胞器靶向型聚集诱导发光材料，也可以通过以下步骤制备：

以实施例一产物和碘甲烷为原料，加入甲苯使之充分溶解，80℃加热反应12小时。去除甲苯溶剂之后，加入六氟磷酸钠及乙腈使之充分溶解。室温下搅拌12小时之后，经水洗、减压去除溶剂及重结晶后，获得目标荧光产物(Ⅲ)。

所述的实施例一产物与碘甲烷之间的摩尔比为1：1.5；实施例一产物与六氟磷酸钠之间的摩尔比为1：5。

本实施例制备结构如(Ⅲ)的细胞器靶向型聚集诱导发光材料方法简单，纯化成本较小，产率为50.1％。

实施例五

具有结构如(Ⅲ)的细胞器靶向型聚集诱导发光材料，也可以通过以下步骤制备：

以实施例一产物和碘甲烷为原料，加入甲苯使之充分溶解，90℃加热反应24小时。去除甲苯溶剂之后，加入六氟磷酸钠及乙腈使之充分溶解。室温下搅拌24小时之后，经水洗、减压去除溶剂及重结晶后，获得目标荧光产物(Ⅲ)。

所述的实施例一产物与碘甲烷之间的摩尔比为1：5；实施例一产物与六氟磷酸钠之间的摩尔比为1：15。

本实施例制备结构如(Ⅲ)的细胞器靶向型聚集诱导发光材料方法简单，但存在较多过量的碘甲烷，去除纯化成本较高，产率为63.5％。