阅读说明：本技术 一种基于试纸条的Cas12a酶的微生物快速诊断技术 (Test strip-based microorganism rapid diagnosis technology for Cas12a enzyme ) 是由 万逸 刘红 葛晓林 于 2019-10-23 设计创作，主要内容包括：将Cas12a检测系统与胶体金快速诊断试纸条技术结合,首先通过PCR或恒温扩增技术实现目的片段的扩增,然后进行Cas12a检测反应,最后试纸条判读结果。此结合意义在于不需要特异性标记引物,避免扩增产物稀释和探针杂交等流程,试纸条可以实现多种微生物的检测,扩大了试纸条的适用性。将Cas12a检测系统的广泛性、稳定性、特异性、灵敏性与试纸条检测的直观、快速、方便性结合,为现场检测提供最佳检测法,利于及时诊断,在核酸分子诊断领域具有重要的应用潜力。(The Cas12a detection system is combined with the colloidal gold rapid diagnosis test strip technology, amplification of a target fragment is realized through a PCR (polymerase chain reaction) or constant-temperature amplification technology, then Cas12a detection reaction is carried out, and finally the test strip judges the result. The combination significance lies in that no specific labeled primer is needed, the procedures of dilution of amplification products, probe hybridization and the like are avoided, the test strip can realize the detection of various microorganisms, and the applicability of the test strip is enlarged. The universality, stability, specificity and sensitivity of the Cas12a detection system are combined with the intuition, rapidness and convenience of test strip detection, so that an optimal detection method is provided for field detection, timely diagnosis is facilitated, and the method has important application potential in the field of nucleic acid molecule diagnosis.)

一种基于试纸条的Cas12a酶的微生物快速诊断技术

技术领域

本发明设计一种简便、快速、特异的微生物诊断技术，属于微生物检测技术领域

背景技术

微生物检测技术研究与开发一直是检测领域的重点、热点方向之一。传统的微生物检测方法检验步骤繁琐，检验周期长，不能完全满足农产品及进出口检验检疫的检测要求，但是它仍然广泛的应用于微生物的检测，并作为官方检测标准长期应用于企业以及相关检测部门。但是，随着工业化的快速发展以及现代物流技术的进步，对微生物快速检测的需求越来越大。

近年来，随着分子生物学的飞速发展，快速、准确、特异检验微生物的新技术、新方法不断涌现，微生物检验技术由培养水平向分子水平迈进，并向仪器化、自动化、标准化方向发展，提高了微生物检验工作的高效性、准确性和可靠性。

成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR）及其关联蛋白（CRISPR-associated proteins，Cas）构成CRISPR-Cas系统，由CRISPR/Cas系统改造而成的CRISPR/Cas技术已成为一种强大的基因编辑工具，广泛应用于基因功能研究和基因修饰与治疗。除了作为基因编辑工具，Ⅱ类Cas蛋白具有的“附属切割”特性，已被开发成一种快速、低成本且高灵敏的核酸检测工具，在核酸分子诊断领域具有重要的应用潜力。

2015年，张锋等发现一种Ⅱ类V型 CRISPR效应蛋白Cas12a。Cas12a可在crRNA引导下与靶标双链DNA结合并完成切割，与Cas9系统相比简化了实验设计。当Cas12a特异性结合和切割目标dsDNA后，具有非特异性切割单链DNA的活性。将核酸扩增技术与Cas12a相结合，将非特异性切割底物进行标记，扩增产物激活Casl2a的附属切割活性，最后检测荧光。

Cas12a检测中靶标及底物均为DNA，其稳定性较强，因此该系统对实验操作环境要求低，可应用于现场的快速检测。Cas12a检测系统不需依赖贵重设备和医护人员经验，将给缺乏先进设备和训练有素人员的发展中国家带来很大便利，在单核苷酸多态性分析、癌症筛査、细菌和病毒感染检测以及耐药性筛査等方面有广泛的应用潜力。

胶体金快速诊断试纸条技术是20世纪90年代以来发展起来的一项新型体外诊断技术，是一种将已知抗原或抗体用胶体金进行标记再通过抗原抗体特异性结合反应使得胶体金集聚形成肉眼可见的形式，从而达到对待测物进行快速简便、迅速且准确的检测目标物的技术。该项技术是在单克隆抗体制备技术和胶体金标记技术的基础上建立的，其融合了免疫亲和技术、印记技术与层析技术等几项技术。近年来该方法发展迅速，由于该技术有方便快捷、特异敏感、稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用。

但是由于胶体金试纸条是基于以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，某种胶体金试纸条因其携带的特异性抗体，只能检测相应的某种抗原或某类抗原，检测对象比较单一、固定，一种试纸条只能检测1种或1类物质。在微生物检测上，由于某些微生物的特异性抗原或抗体存在代表性差、表达不稳定、难以制备等问题，使得不能通过使用胶体金免疫试纸条来达到检测目的，因此很大程度的限制了试纸条检测的适用性。

将Cas12a检测系统与胶体金快速诊断试纸条技术结合，以特异性引物扩增适当长度的目的片段，然后进行Cas12a检测反应，最后试纸条可视化判读结果。此结合意义在于不需要特异性标记引物，避免了扩增产物稀释和探针杂交等流程，没有抗原抗体严格对应的限制，1种试纸条可以实现多种微生物的检测，从而扩大了试纸条的适用性及使用范围，保持了免疫胶体金试纸条直观、快速、方便、成熟、廉价等优点，又具备Cas12a检测方法高灵敏度、高特异性的特点。两种技术的结合为现场检测提供最佳检测法，具有简便、快速、特异、敏感、稳定等特点，利于及时诊断。因此，该检测方法具有广阔应用前景。

发明内容

一种基于试纸条的Cas12a酶的微生物快速诊断技术，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

步骤一：以微生物核酸为模板，利用特异性引物扩增适当长度的目的片段；

步骤二：将步骤一中所得扩增产物加入Cas12a检测系统，在特异性crRNA介导下进行切割反应；

步骤三：将步骤二中所得切割产物直接用胶体金免疫试纸条进行检测。

根据基于试纸条的Cas12a酶的微生物快速诊断技术，其特征在于：所述步骤一具体如下：根据特定微生物的特异性基因，确定特异性保守区域，设计特异性引物，提取微生物核酸，利用设计的特异性引物进行目的片段的扩增。

根据基于试纸条的Cas12a酶的微生物快速诊断技术，其特征在于：所述步骤二具体如下：将步骤一扩增后目的片段加入Cas12a切割反应，切割10min-20min，Cas12a切割体系包括以下组分:Cas12a蛋白、特异crRNA、Target、Reporter。

根据基于试纸条的Cas12a酶的微生物快速诊断技术，其特征在于：所述步骤三具体如下：待步骤二结束后，直接将切割产物与试纸条进行孵育，2-5min即可判读结果。

特异性crRNA包括针对李斯特菌属，肺炎克雷伯氏菌，链球菌属，金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌，志贺氏菌属，沙门氏菌属的特异性crRNA序列SEQ ID NO:1～7。

SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列为：

5’- TAATTTCTACTGTTGTAGATTGTTCAAGACATTATGTCATGGA -3’；

SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列为：

5’- TAATTTCTACTGTTGTAGATTCAATAACACCGAGCAGGAAGTT -3’；

SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列为：

5’- TAATTTCTACTGTTGTAGATAGAATACGATTTCCCAGGTGATG -3’；

SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列为：

5’- TAATTTCTACTGTTGTAGATAAGTCTAAGTAGCTCAGCAAATG -3’；

SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列为：

5’- TAATTTCTACTGTTGTAGATGTGTCTTTGGTACTGGCGGCACG -3’；

SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列为：

5’- TAATTTCTACTGTTGTAGATCGGGAACCATGCTGTCACGGCAT -3’；

SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列为：

5’- TAATTTCTACTGTTGTAGATGTCTGGCATTATCGATCAGTACC -3’；

基于试纸条的Cas12a酶的微生物快速诊断技术，检测李斯特菌属的crRNA序列如SEQID NO:1所示。

基于试纸条的Cas12a酶的微生物快速诊断技术，检测肺炎克雷伯氏菌的crRNA序列如SEQ ID NO:2所示。

基于试纸条的Cas12a酶的微生物快速诊断技术，检测链球菌属的crRNA序列如SEQID NO:3所示。

基于试纸条的Cas12a酶的微生物快速诊断技术，检测金黄色葡萄球菌的crRNA序列如SEQ ID NO:4所示。

基于试纸条的Cas12a酶的微生物快速诊断技术，检测大肠埃希菌的crRNA序列如SEQ ID NO:5所示。

基于试纸条的Cas12a酶的微生物快速诊断技术，检测志贺氏菌属的crRNA序列如SEQ ID NO:6所示。

基于试纸条的Cas12a酶的微生物快速诊断技术，检测沙门氏菌属的crRNA序列如SEQ ID NO:7所示。

特定微生物的特异性基因包括：李斯特菌属iap，肺炎克雷伯氏菌khe，链球菌属tuf，金黄色葡萄球菌nuc，大肠埃希菌chuA，志贺氏菌属ipaH，沙门氏菌属invA。

特异性基因种类包括：微生物致病基因、抗性基因、管家基因可变区。

特异性引物包括针对李斯特菌属，肺炎克雷伯氏菌，链球菌属，金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌，志贺氏菌属，沙门氏菌属的引物对SEQ ID NO:8～21。

SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列为：

5’-GCTTTATCCGTTAAATACGGCGTTTCTGT-3’；

SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列为：

5’- GCAGCTTGAGCTGGTGCTTTAGTTG -3’；

SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列为：

5’- GCGAGGTTTACGTCTCAACCGGCTGGGGATC -3’；

SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列为：

5’- GGGATTGAGCGGGTAATAAATGCGGTTGT -3’；

SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列为

5’- TTGCTTGAATTGGTTGAAATGGAAATCCGTGAC -3’；

SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列为：

5’- TACGGAACATTTCAACACCAGTAACAACAGC -3’；

SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列为：

5’- ATTAAGTGCTGGCATATGTATGGCAATTGTTT -3’；

SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列为：

5’- ATTAATTTAACCGTATCACCATCAATCGCTTT -3’；

SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列为：

5’- GCGGCGTGCTGGTTCTTGTCGATGGTGTT -3’；

SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列为：

5’- TGGGCTGAATCAATTTGCCAGGTCCCTT -3’；

SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列为：

5’- TATCGGAAAGGCGGTCAAGGAACGCGGAAAAG -3’；

SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列为：

5’- CAGATTTACTTCTCCATGAGTGACGGACAACAG -3’；

SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列为：

5’- GATTTCCTGATCGCACTGAATATCGTACTGGC -3’；

SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列为：

5’- AATACTCATCTGTTTACCGGGCATACCATCC -3’；

基于试纸条的Cas12a酶的微生物快速诊断技术，检测李斯特菌属的上游引物如SEQ IDNO:8所示，下游引物如SEQ ID NO:9所示。

基于试纸条的Cas12a酶的微生物快速诊断技术，检测肺炎克雷伯氏菌的上游引物如SEQ ID NO:10所示，下游引物如SEQ ID NO:11所示。

基于试纸条的Cas12a酶的微生物快速诊断技术，检测链球菌属的上游引物如SEQID NO:12所示，下游引物如SEQ ID NO:13所示。

基于试纸条的Cas12a酶的微生物快速诊断技术，检测金黄色葡萄球菌的上游引物如SEQ ID NO:14所示，下游引物如SEQ ID NO:15所示。

基于试纸条的Cas12a酶的微生物快速诊断技术，检测大肠埃希菌的上游引物如SEQ ID NO:16所示，下游引物如SEQ ID NO:17所示。

基于试纸条的Cas12a酶的微生物快速诊断技术，检测志贺氏菌属的上游引物如SEQ ID NO:18所示，下游引物如SEQ ID NO:19所示。

基于试纸条的Cas12a酶的微生物快速诊断技术，检测沙门氏菌属的上游引物如SEQ ID NO:20所示，下游引物如SEQ ID NO:21所示。

提取微生物核酸方法包括：试剂盒提取和快速提取，其中快速提取方法包括煮沸法、酶解法、碱裂解法、磁珠法、微波法。

目的片段的扩增技术包括：聚合酶链式反应（PCR），核酸依赖性扩增检测技术（NASBA），环介导等温扩增技术（LAMP），依赖解旋酶DNA 恒温扩增技术（HDA），重组酶聚合酶扩增（RPA）。

Cas12a酶包括：酸氨基球菌 BV3L6 Cas12a（Acidaminococcus sp. BV3L6Cas12a，AsCas12a），链霉菌ND2006 Cas12a（Lachnospiraceae bacterium ND2006 Cas12a，LbCas12a），图拉弗朗西斯菌诺维达U112 Cas12a（Francisellatularensis subsp.novicida U112 Cas12a，FnCas12a），普氏杆菌Cas12a（PrevotelladisiensCas12a，PdCas12a），牛莫拉氏菌237Cas12a（Moraxella bovoculi 237 Cas12a，MbCas12a），猕猴卟啉单胞菌Cas12a（Porphyromonasmacaca Cas12a，PmCas12a）等。

Reporter序列SEQ ID NO:22其特征为化合物修饰的短核苷酸序列，核苷酸长度为6nt-20nt，其5’端标记异硫氰酸荧光素（FITC）或羧基荧光素（FAM），3’端标记生物素（Biotin）。

SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列为：5’- FAM/ACACACACACACACAC/Biotin -3’。

胶体金免疫试纸条所含的金标抗体包括：抗FAM抗体，抗FITC抗体。

根据基于试纸条的Cas12a酶的微生物快速诊断技术，其特征在于：该诊断技术为现场检测提供最佳检测法，可通过PCR或恒温扩增实现目的片段的扩增，将Cas12a检测系统的广泛性、稳定性、特异性与试纸条检测的简便快速性结合，使得该检测技术具有简便、快速、特异、敏感、稳定等特点，利于及时诊断。

附图说明:

图1本发明检测示意图；

图2本发明检测痢疾志贺氏菌crRNA特异性的实例结果图；

图3本发明检测7种微生物的实例结果图；

图4本发明检测痢疾志贺氏菌灵敏度的实例结果图；

图5 本发明检测快速处理后的痢疾志贺氏菌实例结果图。

具体实施方式

:

下面通过实施例对本发明做进一步说明。

一种基于试纸条的Cas12a酶的微生物快速诊断技术，所述方法包括如下步骤：

步骤一：以微生物核酸为模板，利用特异性引物扩增适当长度的目的片段；

步骤二：将步骤一中所得扩增产物加入Cas12a检测系统，进行切割反应；

步骤三：将步骤二中所得切割产物直接用胶体金免疫试纸条进行检测。

实施例1：痢疾志贺氏菌crRNA特异性检测，所述方法具体包括如下步骤：

所述步骤一具体如下：将单增李斯特菌，肺炎克雷伯氏菌，酿脓链球菌，金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌，痢疾志贺氏菌，伤寒沙门氏菌接种于增菌培养基，培养过夜，试剂盒提取DNA，以DNA为模板、各菌对应的特异性引物为引物进行PCR扩增。

所述步骤二具体如下：将步骤一扩增后的PCR产物加入Cas12a切割反应， Cas12a切割体系为:Cas12a蛋白，60nM、痢疾志贺菌crRNA 60nM、PCR产物 3.0μL、Reporter 1μM，37℃下孵育20min。

所述步骤三具体如下：步骤二切割反应结束后，20μL切割体系加入100.0μLHybriDetectAssay Buffer，将试纸条放入溶液，孵育2-5min，孵育结束立即进行结果判读，并进行拍照。

实施例2：本发明检测7种微生物，所述方法具体包括如下步骤：

所述步骤一具体如下：将单增李斯特菌，肺炎克雷伯氏菌，酿脓链球菌，金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌，痢疾志贺氏菌，伤寒沙门氏菌接种于增菌培养基，培养过夜，试剂盒提取基因组DNA，以DNA为模板、各菌对应的特异性引物为引物进行PCR扩增。

所述步骤二具体如下：将步骤一扩增后的PCR产物加入Cas12a切割反应， Cas12a切割体系为:Cas12a蛋白，60nM、7种菌对应的特异性crRNA 60nM、PCR产物 3.0μL、Reporter1μM，37℃下孵育20min。

所述步骤三具体如下：步骤二切割反应结束后，20μL切割体系加入100.0μLHybriDetectAssay Buffer，将试纸条放入溶液，孵育2-5min，孵育结束立即进行结果判读，并进行拍照。

实施例3：本发明检测痢疾志贺氏菌灵敏度，所述方法具体包括如下步骤：

所述步骤一具体如下：痢疾志贺氏菌接种于增菌培养基，培养过夜，试剂盒提取基因组DNA，将DNA进行梯度稀释后作为模板、以痢疾志贺菌特异性引物为引物进行PCR扩增。

所述步骤二具体如下：将步骤一扩增后的PCR产物加入Cas12a切割反应， Cas12a切割体系为:Cas12a蛋白，60nM、痢疾志贺菌特异性crRNA 60nM、PCR产物 3.0μL、Reporter1μM，37℃下孵育20min。

所述步骤三具体如下：步骤二切割反应结束后，20μL切割体系加入100.0μLHybriDetectAssay Buffer，将试纸条放入溶液，孵育2-5min，孵育结束立即进行结果判读，并进行拍照。

实施例4：本发明检测快速处理后的痢疾志贺氏菌，所述方法具体包括如下步骤：

所述步骤一具体如下：痢疾志贺氏菌接种于增菌培养基，培养过夜，50-100μL志贺菌样本中加入等量0.5M NaOH， 60℃保温10min，取上清，加等量0.5M Tris-HCl（pH8.0），取上清作为模板、以痢疾志贺菌特异性引物为引物进行PCR扩增。

所述步骤二具体如下：将步骤一扩增后的PCR产物加入Cas12a切割反应， Cas12a切割体系为:Cas12a蛋白，60nM、痢疾志贺菌特异性crRNA 60nM、PCR产物 3.0μL、Reporter1μM，37℃下孵育20min。

所述步骤三具体如下：步骤二切割反应结束后，20μL切割体系加入100.0μLHybriDetectAssay Buffer，将试纸条放入溶液，孵育2-5min，孵育结束立即进行结果判读，并进行拍照。