Mpt64蛋白的检测试剂盒及检测方法
阅读说明：本技术 Mpt64蛋白的检测试剂盒及检测方法 (Detection kit and detection method for MPT64 protein ) 是由 尹小毛 于 2020-05-19 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种MPT64蛋白的检测试剂盒及检测方法,检测试剂盒包括第一抗体、第二抗体、模板DNA、脂质体原料和扩增引物对；其中,所述第一抗体和所述第二抗体能够与MPT64蛋白特异性结合,所述扩增引物对能够特异性扩增所述模板DNA。本发明的检测方法用第一抗体直接包被PCR反应管,用其代替免疫脂质体PCR方法中的酶标板形式,并以改进的免疫脂质体技术为基础建立MPT64蛋白快速超敏检测方法,提高了免疫脂质体PCR的简易性,而且能够进一步提高蛋白质检测的灵敏度。(The invention relates to a detection kit and a detection method of MPT64 protein, wherein the detection kit comprises a first antibody, a second antibody, template DNA, liposome raw materials and an amplification primer pair; wherein the first antibody and the second antibody are capable of specifically binding to MPT64 protein and the amplification primer pair is capable of specifically amplifying the template DNA. The detection method of the invention uses the first antibody to directly coat the PCR reaction tube, replaces an enzyme label plate form in the immunoliposome PCR method, and establishes the rapid hypersensitivity detection method of the MPT64 protein based on the improved immunoliposome technology, thereby improving the simplicity of immunoliposome PCR and further improving the sensitivity of protein detection.)
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种MPT64蛋白的检测试剂盒及检测方法。
背景技术
尽管结核病在全球范围内得到了有效控制，但我们离消灭结核病的目标还有很长一段距离。近年来，全球人口流动的加剧、艾滋病合并结核病感染病例的上升、耐多药及泛耐药结核病的增多给结核病防治带来了巨大挑战。与此同时，结核病诊断治疗领域特别是早期诊断方面进展甚微，现有的各种结核病快速诊断技术均不能同时满足简便、准确和廉价的要求。面对严峻的结核病防治形势，发展和应用新的快速诊断方法已成为结核病临床研究的核心内容。当前结核杆菌(TB)的实验室诊断主要依赖于传统的涂片、培养法，但这些方法操作繁琐、检测周期长，已远不能满足临床TB快速诊断的需求。近年来发展起来的一些快速诊断方法，如实时荧光PCR、细胞免疫检测方法等，虽然解决了诊断时效的问题，但是在诊断准确性方面却不如人意。
MPT64蛋白是结核分枝杆菌在培养早、中期分泌释放于菌体外并游离于培养基中的一组蛋白，由RD2区基因Rv1980c编码，相对分子质量为24000，约占结核分枝杆菌培养基上清滤过液中蛋白总量的8％。因此，MPT64蛋白可以作为结核分枝杆菌快速诊断的靶蛋白。
免疫脂质体PCR技术是近几年才建立并逐步发展的一种新的蛋白质超敏检测方法，其在医学领域特别是疾病诊断方面应用前景十分可喜。其检测靶蛋白的基本原理是：首先用抗靶蛋白抗体包被酶标板孔，接着加入待测标本，孵育一定时间后加入生物素化的抗靶蛋白抗体，然后分别加入亲和素和生物素化脂质体，反应一段时间后洗板去除游离的生物素化脂质体，用破膜剂破坏脂质体而使其包裹的DNA片段释放入溶液中，吸取少量溶液进行Taqman实时荧光PCR，扩增Ct值的大小即可反映出待测标本中靶蛋白的浓度。美中不足的是，现有的免疫脂质体PCR技术不能实现单管检测，而且整个操作过程比较复杂繁琐。
发明内容
基于此，有必要提供一种可以实现单管检测、操作快捷简便的MPT64蛋白的检测试剂盒。
一种MPT64蛋白的检测试剂盒，包括第一抗体、第二抗体、模板DNA、脂质体原料和扩增引物对；其中，所述第一抗体和所述第二抗体能够与MPT64蛋白特异性结合，所述扩增引物对能够特异性扩增所述模板DNA。
在其中一个实施例中，所述模板DNA的序列如SEQ ID NO：1所示。
在其中一个实施例中，所述扩增引物对的序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
在其中一个实施例中，还包括PCR缓冲液、荧光探针和DNA聚合酶。
在其中一个实施例中，所述脂质体原料包括胆固醇、卵磷脂和磷脂酰乙醇胺。
在其中一个实施例中，还包括乙醚、氯仿、戊二醛和BSA。
在其中一个实施例中，所述第一抗体为鼠源抗体，所述第二抗体为兔源抗体。
本发明还提供了一种非疾病的诊断和治疗目的的MPT64蛋白的检测方法，包括以下步骤：
用能够与MPT64蛋白特异性结合的第一抗体包被PCR反应管，得到包被反应管；
用能够与MPT64蛋白特异性结合的第二抗体标记包裹有模板DNA的脂质体，得到免疫脂质体；
在所述包被反应管中加入待测样本孵育，然后加入所述免疫脂质体孵育；
使用清洗缓冲液洗涤所述包被反应管，然后加入PCR反应液对所述模板DNA进行扩增；
检测扩增产物的含量，根据所述扩增产物的含量计算所述待测样本中MPT64蛋白的含量。
在其中一个实施例中，所述脂质体由胆固醇、卵磷脂和磷脂酰乙醇胺制备得到。
在其中一个实施例中，所述胆固醇、卵磷脂和磷脂酰乙醇胺的摩尔比为(9～11):(5～7):(1～3)。
本发明MPT64蛋白的检测试剂盒的原理如下：
使用第一抗体包被PCR反应管，使用第二抗体标记包裹模板DNA的脂质体制备免疫脂质体。在包被的PCR反应管中加入待测样本，孵育一段时间后加入免疫脂质体，则待测样本中的MPT64蛋白会先后与第一抗体和第二抗体形成第一抗体-MPT64蛋白-第二抗体免疫脂质体复合物。接着移除PCR反应管中的液体并加入缓冲液洗涤，加入PCR反应液对脂质体释放出的模板DNA进行扩增。在固定时间内扩增产物量与模板DNA量成正比，而模板DNA的量则与待测样本中的MPT64蛋白含量成正比，这样通过检测扩增产物的含量就可以计算出待测样本中MPT64蛋白的含量。
与现有的检测试剂盒和检测方法相比，本发明的有益效果如下：
(1)操作简便：试验过程无需在酶标板上进行多次洗板，直接在PCR反应管中加入缓冲液洗涤即可，可实现单管检测。
(2)高特异性：采用双抗体夹心方式来特异检测MPT64蛋白，反应较少受到血清中高丰度蛋白的影响。
(3)高灵敏性：能检测出的最低值可达fg/mL，可低至ELISA方法的1/2000。
附图说明
图1为实施例2制备的免疫脂质体的透射电镜图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明一实施例的MPT64蛋白的检测试剂盒，包括第一抗体、第二抗体、模板DNA、脂质体原料和扩增引物对。其中，第一抗体和第二抗体能够与MPT64蛋白特异性结合，扩增引物对能够特异性扩增模板DNA。
本发明MPT64蛋白的检测试剂盒的原理如下：
使用第一抗体包被PCR反应管，使用第二抗体标记包裹模板DNA的脂质体制备免疫脂质体。在包被的PCR反应管中加入待测样本，孵育一段时间后加入免疫脂质体，则待测样本中的MPT64蛋白会先后与第一抗体和第二抗体形成第一抗体-MPT64蛋白-第二抗体免疫脂质体复合物。接着移除PCR反应管中的液体并加入缓冲液洗涤，加入PCR反应液对脂质体释放出的模板DNA进行扩增。在固定时间内扩增产物量与模板DNA量成正比，而模板DNA的量则与待测样本中的MPT64蛋白含量成正比，这样通过检测扩增产物的含量就可以计算出待测样本中MPT64蛋白的含量。
与现有的检测试剂盒和检测方法相比，本发明的有益效果如下：
(1)操作简便：试验过程无需在酶标板上进行多次洗板，直接在PCR反应管中加入缓冲液洗涤即可，可实现单管检测。
(2)高特异性：采用双抗体夹心方式来特异检测MPT64蛋白，反应较少受到血清中高丰度蛋白的影响。
(3)高灵敏性：能检测出的最低值可达fg/mL，可低至ELISA方法的1/2000。
术语“抗体”是指一类能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体(Monoclone antibody)。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体。
术语“脂质体”是指由脂质双分子层组成的环形封闭囊泡，无毒、无免疫原性。按脂质体的结构和粒径分类包括单室脂质体、多室脂质体、多相脂质体等。单室脂质体即内含物仅仅被一层类脂双分子层膜包裹，根据直径大小，单室脂质体又可以分为小单室脂质体和大单室脂质体。多室脂质体又称多层脂质体，是内含物被几层脂质双分子层所隔开形成的不均匀聚集体。多相脂质体指的是以单室或者多室脂质体为主，包含少量油包水或水包油型乳剂的多相分散体系。
模板DNA为人工设计的DNA片段，模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子。在一个具体示例中，模板DNA的序列如SEQ ID NO：1所示。可以理解，以上为优选示例，模板DNA不限于此，可根据需要设计。
SEQ ID NO：1：5’-TCGAGGCGTAGAATTCCCTTACCGATGCGCGCTG TCTACTCTGACAATTGCATATGTGGTCTATGTCGTCGTTCGCTAGTAGTTCC TGGGCTGCAC-3’
在一个具体示例中，扩增引物对的序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。可以理解，以上为优选示例，扩增效果较好，但扩增引物对不限于此，可根据需要设计。
SEQ ID NO：2(上游引物)：5’-TCGAGGCGTAGAATTCCCT-3’
SEQ ID NO：3(下游引物)：5’-GTGCAGCCCAGGAACTACT-3’
在一个具体示例中，检测试剂盒还包括PCR缓冲液、荧光探针和DNA聚合酶。可选地，荧光探针的序列如SEQ ID NO：4所示。
SEQ ID NO：4(Taqman探针)：
5’-FAM-TGTCTACTCTGACAATTGCAT-BQ1-3’
可选地，PCR缓冲液中含有10mmol/L～30mmol/L的Tris-HCl、0.5mmol/L～5mmol/L的MgCl2、50mmol/L～80mmol/L的(NH4)2SO4以及40mmol/L～60mmol/L的KCl等，DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
在一个具体示例中，脂质体原料包括胆固醇、卵磷脂和磷脂酰乙醇胺。可选地，包裹有模板DNA的脂质体可通过如下方法制备得到：将胆固醇、卵磷脂和磷脂酰乙醇胺溶于乙醚、氯仿混合溶剂中，在旋转蒸发器上减压蒸发形成薄膜。再加入乙醚、氯仿混合物和DNA片段(人工序列)的Tris-HCl缓冲液，超声处理直至混合溶液水化。然后将混合溶液在45℃水浴中旋转蒸发至粘性凝胶状，减压蒸发凝胶转相至液态，再补充一定量的Tris-HCl缓冲液，超声处理后得到包裹有模板DNA片段的脂质体。
在一个具体示例中，检测试剂盒还包括乙醚、氯仿、戊二醛和BSA，以便于包裹模板DNA片段的脂质体的制备以及第二抗体的标记。可选地，第二抗体标记包裹有模板DNA片段的脂质体的方法如下：将戊二醛溶液与包裹有模板DNA片段的脂质体溶液混合，在30℃条件下轻微振荡2h，然后在4℃条件下通过PBS溶液透析12h去除多余的戊二醛。在透析后的溶液中加入第二抗体，4℃条件下放置12h，再加入等体积BSA溶液放置12h后即形成免疫脂质体。将免疫脂质体溶液于4℃条件下20000r/min离心30min，弃去上清液后用PBS缓冲液重复洗涤1次。最后用3mL PBS缓冲液重悬免疫脂质体，并置4℃保存备用。
在一个具体示例中，第一抗体为鼠源抗体，第二抗体为兔源抗体。可以理解，抗体类型不限于此，可根据需要选择。
本发明一实施例的MPT64蛋白的检测方法，包括以下步骤S1～S5：
S1、用能够与MPT64蛋白特异性结合的第一抗体包被PCR反应管，得到包被反应管。
S2、用能够与MPT64蛋白特异性结合的第二抗体标记包裹有模板DNA的脂质体，得到免疫脂质体。
S3、在包被反应管中加入待测样本孵育，然后加入免疫脂质体孵育。
S4、使用清洗缓冲液洗涤包被反应管，然后加入PCR反应液对模板DNA进行扩增。
S5、检测扩增产物的含量，根据扩增产物的含量计算待测样本中MPT64蛋白的含量。
本发明的检测方法用第一抗体直接包被PCR反应管，用其代替免疫脂质体PCR方法中的酶标板形式，并以改进的免疫脂质体技术为基础建立MPT64蛋白快速超敏检测方法，提高了免疫脂质体PCR的简易性，而且能够进一步提高蛋白质检测的灵敏度。该检测方法可用于细菌培养液、血液、脑脊液、胸腔积液等标本中微量MPT64蛋白的准确检测。可以理解，该检测方法也可用于非疾病的诊断和治疗目的，例如检测食物或环境中是否存在MPT64蛋白，从而判断食物或环境是否被结核分枝杆菌所污染等。
与现有检测方法相比，本发明的有益效果如下：
(1)操作简便：试验过程无需在酶标板上进行多次洗板，直接在PCR反应管中加入缓冲液洗涤即可，可实现单管检测。
(2)高特异性：采用双抗体夹心方式来特异检测MPT64蛋白，反应较少受到血清中高丰度蛋白的影响。
(3)高灵敏性：能检测出的最低值可达fg/mL，可低至ELISA方法的1/2000。
在一个具体示例中，脂质体由胆固醇、卵磷脂和磷脂酰乙醇胺制备得到。具体地，将胆固醇、卵磷脂和磷脂酰乙醇胺溶于乙醚、氯仿混合溶剂中，在旋转蒸发器上减压蒸发形成薄膜。再加入乙醚、氯仿混合物和DNA片段(人工序列)的Tris-HCl缓冲液，超声处理直至混合溶液水化。然后将混合溶液在45℃水浴中旋转蒸发至粘性凝胶状，减压蒸发凝胶转相至液态，再补充一定量的Tris-HCl缓冲液，超声处理后得到包裹有模板DNA片段的脂质体。在一个具体示例中，胆固醇、卵磷脂和磷脂酰乙醇胺的摩尔比为(9～11):(5～7):(1～3)。
在一个具体示例中，扩增的反应条件为：95℃，30s；95℃，30s，60℃，30s共40个循环。
在一个具体示例中，包被PCR反应管的方法包括以下步骤：将第一抗体加入到PCR反应管中，放置12h，再加入BSA溶液放置12h，移除管内液体后室温干燥即可。
在一个具体示例中，第二抗体标记脂质体的方法包括以下步骤：将戊二醛溶液与包裹有模板DNA的脂质体溶液混合，在30℃条件下轻微振荡2h，然后在4℃条件下通过PBS溶液透析12h去除多余的戊二醛。在透析后的溶液中加入第二抗体，4℃条件下放置12h，再加入等体积BSA溶液放置12h后即形成免疫脂质体。将免疫脂质体溶液于4℃条件下20000r/min离心30min，弃去上清液后用PBS缓冲液重复洗涤1次。最后用3mL PBS缓冲液重悬免疫脂质体，并置4℃保存备用。
在一个具体示例中，检测方法包括以下步骤：
(1)PCR反应管包被抗体-MPT64蛋白复合物的形成：取待测标本(血清、脑脊液等)于已包被PCR反应管中，室温放置30min后即可形成包被抗体-MPT64蛋白复合物；
(2)包被抗体-MPT64蛋白-免疫脂质体复合物的形成：向步骤(1)液体中加入免疫脂质体复合物，轻轻混匀后室温放置30min，形成包被抗体-MPT64蛋白-免疫脂质体复合物；
(3)移除多余免疫脂质体：移除步骤(2)PCR反应管中多余液体，加入缓冲液后放置5min。重复该步骤；
(4)加热破膜：向PCR反应管中加入PCR反应液，置100℃加热10min，脂质体破坏后释放出包裹的模板DNA；
(5)PCR检测：将PCR反应管放入荧光定量PCR仪中进行检测，通过分析模板DNA的含量来确定样本中MPT64蛋白的含量。
以下为具体实施例。
实施例1：包被PCR反应管
将100μL鼠抗MPT64抗体(此处为抗MPT64抗体1，用碳酸盐缓冲溶液稀释)加入到PCR反应管中，4℃条件下放置12h，再加入150μL BSA溶液放置12h，移除管内液体后室温干燥后4℃保存备用。
实施例2：免疫脂质体的制备
1、将胆固醇、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺按摩尔比10：6：2溶于乙醚、氯仿混合溶剂中，在旋转蒸发器上减压蒸发形成薄膜。再加入乙醚、氯仿混合物和DNA片段(模板DNA)的Tris-HCl缓冲液，超声处理直至混合溶液水化。然后将混合溶液在45℃水浴中旋转蒸发至粘性凝胶状，减压蒸发凝胶转相至液态，再补充一定量的Tris-HCl缓冲液，超声处理后得到包裹有DNA片段的脂质体。
2、将2mL戊二醛溶液与2mL包裹有DNA片段的脂质体溶液混合，在30℃条件下轻微振荡2h，然后在4℃条件下通过PBS溶液透析12h去除多余的戊二醛。在透析后的溶液中加入1mL兔抗MPT64抗体(此处为抗MPT64抗体2)，4℃条件下放置12h，再加入等体积BSA溶液放置12h后即形成免疫脂质体。
3、将免疫脂质体溶液于4℃条件下20000r/min离心30min，弃去上清液后用PBS缓冲液重复洗涤1次。最后用3mL PBS缓冲液重悬免疫脂质体，并置4℃保存备用。制备好的免疫脂质体可通过透射电镜进行观察，如图1所示。
实施例3：PCR体系的构建
1、PCR检测扩增的模板DNA为人工设计的DNA片段，引物组包括上下游引物和Taqman探针，具体序列如下：
靶基因：
5’-TCGAGGCGTAGAATTCCCTTACCGATGCGCGCTGTCTACTCTGACAA TTGCATATGTGGTCTATGTCGTCGTTCGCTAGTAGTTCCTGGGCTGCAC-3’；
上游引物：5’-TCGAGGCGTAGAATTCCCT-3’；
下游引物：5’-GTGCAGCCCAGGAACTACT-3’；
Taqman探针：5’-FAM-TGTCTACTCTGACAATTGCAT-BQ1-3’。
2、采用Taqman探针法荧光定量PCR检测方式，扩增条件为：95℃，30s；95℃，30s，60℃，30s共40个循环。
3、PCR检测结果通过分析荧光定量PCR仪的实时荧光检测数据来进行判断，并通过制作标准曲线来确定待测蛋白的含量。
实施例4：人血清标本中MPT64蛋白的检测
1、第一抗体-MPT64蛋白复合物的形成：取50μL待测血清样本于包被第一抗体的PCR反应管中，室温放置30min后即可形成第一抗体-MPT64蛋白复合物。
2、第一抗体-MPT64蛋白-免疫脂质体复合物的形成：加入50μL抗MPT64蛋白的免疫脂质体复合物，轻轻混匀后室温放置30min。
3、洗涤：用加样枪吸走管内液体，再加入100μL PBS缓冲液洗涤一次；重复该步骤。
4、加热破膜：加入20μL PCR反应液，反应体系见下表1所示；置100℃加热10min，脂质体破坏后释放出包裹的模板DNA(人工序列)。
5、PCR检测：反应条件为95℃30s；95℃30s，60℃30s共40个循环。PCR检测结果通过分析荧光定量PCR仪的实时荧光检测数据来进行判断，并通过制作标准曲线来确定标本中MPT64蛋白的含量。
表1 PCR反应体系
组分名称
加入量(μL)
组分名称
加入量(μL)
缓冲液
10
Bst DNA聚合酶
0.8
上游引物
4
荧光染料
0.4
下游引物
0.5
Taqman探针
2
加水补齐至
20
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 南方医科大学第五附属医院
<120> MPT64蛋白的检测试剂盒及检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgaggcgta gaattccctt accgatgcgc gctgtctact ctgacaattg catatgtggt 60
ctatgtcgtc gttcgctagt agttcctggg ctgcac 96
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcgaggcgta gaattccct 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgcagccca ggaactact 19
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgtctactct gacaattgca t 21
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：高灵敏度、无需扩增的核酸检测方法及其应用