一种牛支原体核酸检测胶体金免疫试纸条及其应用
阅读说明：本技术 一种牛支原体核酸检测胶体金免疫试纸条及其应用 (Colloidal gold immune test strip for mycoplasma bovis nucleic acid detection and application thereof ) 是由 陈创夫 王震 石峰 王勇 赵阳 宋胜男 吴鹏 于 2021-09-14 设计创作，主要内容包括：本发明属于免疫学检测技术领域,尤其涉及一种牛支原体核酸检测胶体金免疫试纸条及其应用。本申请利用胶体金可以和抗体或生物素等标记的寡核苷酸相结合这一信号放大技术,提高检测灵敏度,构成可显色的检测探针,整合了PCR的特异性、敏感性和金标条快速、简单的特性,建立了M.bovis核酸检测的胶体金免疫试检测纸条,该方法的建立为临床微量牛支原体病原的检测研究提供了研究基础。(The invention belongs to the technical field of immunological detection, and particularly relates to a mycoplasma bovis nucleic acid detection colloidal gold immune test strip and application thereof. The method utilizes a signal amplification technology that colloidal gold can be combined with labeled oligonucleotides such as antibodies or biotin and the like, improves the detection sensitivity, forms a detection probe capable of developing color, integrates the specificity and sensitivity of PCR and the characteristics of rapidness and simplicity of a gold label strip, establishes a colloidal gold immune test detection paper strip for M.bovis nucleic acid detection, and provides a research basis for the detection research of clinical trace mycoplasma bovis pathogens.)
技术领域
本发明属于免疫学检测技术领域，尤其涉及一种牛支原体核酸检测胶体金免疫试纸条及其应用。
背景技术
牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)是目前世界上对养牛业影响巨大且极易被忽视的新兴重要病原体微生物，可以引起牛肺炎、乳腺炎、中耳炎、生殖障碍、关节炎等多种混合感染的慢性疾病。目前对于对牛支原体疾病的致病机制和毒力因子的研究尚且处于初级阶段，缺少特异性药物、疫苗及快速诊断方法，并且M.bovis病在中国流行，造成巨大经济损失，已经成为养牛业健康发展的重大障碍，研制高效、快速、特异的检测方法对于加强对牛支原体的免疫和诊断监测愈发重要。
随着现代生物学技术的日趋成熟，目前的检测方法已经由从最开始的病原菌株分离培养，到现阶段血清学技术和分子生物学方法为主的转变。牛感染M.bovis后机体产生免疫应答性抗体，且这种反应通常在感染后持续一段时间，所以血清学检测成为一种有效的M.bovis诊断方法。在血清学检测中ELISA的应用较为常见，膜表面可变蛋白是M.bovis感染过程中宿主体液应答识别的主要抗原，基于VspA、VspB和VspC抗原包被的重组蛋白的间接ELISA具有较高的特异性和灵敏性。随着生物学技术的迅猛发展，荧光定量PCR环介导等温扩增技术在M.bovis的检测中也有着越来越广泛的应用。研究人员基于M.bovis的uvrC和P81等基因开发了一种SYBR Green的实时荧光PCR检测试剂盒，与其他相关细菌和其他支原体无交叉反应性，具有良好特异性，并且具有较高的敏感性。此外，基于uvrC和P81基因的环介导等温扩增技术检测已经被成功用于临床样本的检测，该检测方法具有灵敏度高、特异性强、检测快速准确等特点。快速诊断有助于M.bovis相关疾病的有效防控。分离培养法是病原检测的金标准，但周期较长，容易污染。血清学检测可能存在不同支原体之间的共同抗原，会导致交叉反应，造成假阳性。PCR方法其对检测人员的操作水平有较髙的要求且受仪器设备的限制较大。
生物素-亲和素系统(Bio-strept avidin，BAS)是目前自然界中发现的最强大的亲和材料，其亲和力至少比抗原抗体结合力高一百万倍。生物素系统被广泛应用于各种检测技术，适用于检测细菌、病毒、细胞、蛋白质和核酸的检测，不仅可以有效地提高目标相应配体分子的生物活性，结合效率和靶分子可显著提高，与检测信号级联反应，有效的提高了检测灵敏度，缩短检测时间，实现快速、灵敏的检测和生物分子的分析，用于生物和医学研究的检测带来新的想法。生物素系统逐渐成为一种类似ELISA的新兴酶联检测方法。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种牛支原体核酸检测胶体金免疫试纸条及其应用。目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，一种牛支原体核酸检测胶体金免疫试纸条，从下到上、由左至右依次包括PVC板、NC膜、上样垫、金标垫、样品垫、吸水垫，相互紧密贴合组成试纸条，将链霉亲和素和羊抗鼠IgG分别在NC膜上划出T、C线，将金标鼠抗地高辛IgG涂布在胶体金垫上，样品垫和吸水垫分别贴于试纸条的两端，将试纸条固定于塑料外壳内。
进一步，使用划膜仪按照1μL/cm的用量在NC膜上划出T、C线。
进一步，所用的链霉亲和素浓度为2mg/mL。
进一步，所用的羊抗鼠IgG的稀释比例为1:100。
进一步，所述金标鼠抗地高辛IgG在制备时，胶体金溶液的pH为8.5。
本发明还提供了一种牛支原体核酸检测胶体金免疫试纸条在牛支原体核酸检测中的应用。
进一步地，以目标样品基因组DNA为模板进行PCR反应，产物滴加于试纸条上样垫上，5min后读取结果。
进一步地，PCR扩增所用上下游引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，上下游引物的5'端分别设计标记生物素探针和地高辛探针。
本发明立足于为兽医临床提供牛肺炎支原体基层现场快速准确的检测诊断技术，利用胶体金和抗体或生物素等标记的寡核苷酸相结合这一信号放大技术，建立了一种M.bovis核酸检测的胶体金免疫检测试纸条，为临床微量牛支原体病原的检测研究提供了研究基础。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明设计标记链霉亲和素探针和地高辛探针的M.bovis特异性引物，制备胶体金标记抗地高辛单克隆抗体包被金标垫，链霉亲和素和羊抗鼠IgG分别划线于T线和C线，组装成通用胶体金免疫检测试纸条，整合特异性、高灵敏性的PCR检测技术与快速、简单的金标试纸条技术，通过生物素-亲和素系统间接放大M.bovis的检测信号，建立了M.bovis核酸检测的胶体金免疫试检测纸条，该方法的建立为临床微量牛支原体病原的检测研究提供了研究基础。
本研究利用胶体金可以和抗体或生物素等标记的寡核苷酸相结合这一信号放大技术，提高检测灵敏度构成可显色的检测探针这一特性，整合了PCR的特异性、敏感性和金标条快速、简单的特性，使检测可以快速的在2h内可完成，特异性良好，除仅对M.bovisPG45、M.bovis新疆分离株产生阳性结果外，不与其他相近致病微生物交叉反应，敏感性良好，检测下限为89fg/μL的DNA，灵敏度为10-6，而普通琼脂糖凝胶电泳的灵敏度一般为10-5，重复性、稳定性良好，利用胶体金的可放大特性和链霉亲和素-地高辛系统极强的亲和力，使胶体金免疫层析技术与PCR产物中的生物素探针紧密结合，更灵敏且更快速，大大简化操作、节省时间、提高反应效率。
附图说明
图1是引物的特异性验证；M：DNA Marker；1：M.bovis PG45；2：M.bovis新疆分离株；3：绵羊肺炎支原体；4：大肠杆菌；5：多杀性巴氏杆菌；6：牛种布氏杆菌；7：牛病毒性腹泻病毒；8：牛型结核分枝杆菌；9：空白对照；
图2是试纸条的组装及原理；
图3是核酸试纸条的特异性验证；1：绵羊肺炎支原体；2：大肠杆菌；3：多杀性巴氏杆菌；4：牛种布氏杆菌；5：牛病毒性腹泻病毒；6：牛型结核分枝杆菌；7：M.bovis新疆分离株；8：M.bovis PG45。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
本发明中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。
本发明披露了一种牛支原体核酸检测胶体金免疫试纸条及其应用。本发明中涉及的牛型结核分枝杆菌阳性血清、多杀性巴氏杆菌阳性血清、大肠杆菌阳性血清、牛病毒性腹泻病毒阳性血清、牛种布氏杆菌阳性血清、M.bovis阳性血清均为动物科技学院陈创夫教授提供，绵羊肺炎支原体阳性血清为生命科学学院石峰教授提供；新西兰大白兔购于石河子大学实验动物中心。鼠抗地高辛IgG单克隆抗体、羊抗鼠IgG购自美国Sigma公司。下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
1、引物特异性验证
本申请中涉及到的引物序列如下，且上下游引物的5'端分别设计标记生物素探针和地高辛探针。
表1引物序列
PCR总反应体系见表2，反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s、53℃退火30s、72℃延伸45s，共30个循环；72℃终延伸10min。利用建立的PCR反应体系、反应条件分别对8株试验菌株模板进行扩增，取10μL PCR产物与1μL 10×Loading Buffer混合后，采用2％琼脂糖凝胶中板胶(0.9g+45mL蒸馏水)加入1μL EB胶自然干后，进行电泳分析，电压120V，时间30min，凝胶成像仪成像观察扩增结果，验证特异性引物后用于后续试验。
表2 PCR反应体系(25μL)
按照上述的反应体系和反应条件进行PCR扩增，空白对照以无菌超纯水作为模板，结果见图1，M.bovis PG45、M.bovis新疆分离株的DNA均扩增出大小为448bp的目标条带，而空百对照和其他致病菌株的DNA扩增产物并未检测出扩增条带，由此说明该引物特异性强，反应体系和反应条件良好。
2、金标记鼠抗地高辛IgG最佳条件的摸索
取10枚1.5mL干净的离心管，分两组置于托板上固定，1mL/管，将制备好的胶体金溶液置于其中，缓慢滴加0.1mol/L的碳酸钾(K2CO3)溶液，边滴加边快速混匀，将pH分别调节至7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，每个pH有相同两组；利用1×PBS(pH 7.4)缓冲液将鼠抗地高辛IgG浓度稀释至1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL滴加到胶体金溶液中，每个浓度有相同两组，迅速震荡5min，混匀后的溶液于4℃条件下静置1h；最后分别加入10％的NaCl溶液，100μL/孔，充分混匀后4℃静置1h，观察溶液的变化情况，同时利用酶标仪读取OD450nm值，选择OD450nm值最高所对应的pH值及标记抗体量作为胶体金标记抗体的最适条件。
确定好最佳pH和最佳标记量后，2000r/min离心20min，留上清，14000r/min，4℃离心1h，留上清，按照1:10的比例滴加2％的BSA溶液，混匀，4℃条件下再次静置30min；2000r/min，4℃离心15min，留上清到干净的离心管中，弃去未标记的胶体金沉淀物；上清10000r/min，4℃离心30min，弃上清，保留标记的胶体金颗粒沉淀，分装，4℃备用。
结果显示，当加入蛋白浓度小时，不足以稳定胶体金溶液时，颜色由红色变为蓝色出现聚沉现象，当加入蛋白的量达到或超过最低稳定量，红色保持不变的最低蛋白量就是最适蛋白量，测得OD450nm值。在pH为8.5时吸光值最大，表明与胶体金连接效果最理想，正如偏碱性的条件下，带负电的胶体金可以与带正电的蛋白质通过物理特性稳定结合，在胶体金溶液pH值一定的条件下，其吸光度随着蛋白量的增加而逐渐增高，加入4mg/mL鼠抗地高辛IgG时OD450nm值显着提高，持续增加吸光值逐渐变低，因此，当胶体金溶液的pH为8.5，加入4mg/mL的鼠抗地高辛IgG标记时最佳。
3、链霉亲和素、金标鼠抗地高辛IgG、羊抗鼠IgG最佳稀释倍数的摸索
T线(检测线)包被链霉亲和素，1×PBS(pH 7.4)缓冲液分别将其稀释至0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL，C线(质控线)包被羊抗鼠IgG，稀释100倍，操作划膜仪在NC膜上按照1μL/cm分别划出C、T线，室温干燥过夜。
胶体金标记的鼠抗地高辛IgG用1×PBS(pH 7.4)缓冲液分别稀释3、5、8倍，30μL/cm均匀涂布在金标垫上，室温干燥过夜，次日把各部分组合成试纸条，稀释10倍后至100μL的阴、阳性PCR产物、1×PBS(pH 7.4)100μL分别滴加在试纸条上，根据显色结果分析不同条件组合检测线的颜色强度、稳定性、显色时间等特性，选择最适的链霉亲和素和金标鼠抗地高辛IgG的稀释倍数。
上述确定条件的基础上，羊抗鼠IgG的分别用1×PBS(pH 7.4)缓冲液稀释40、80、100、200倍，根据显色结果分析不同条件组合检测线的颜色强度、稳定性、显色时间等特性，选择T线和C线颜色强度保持一致的条件，确定多克隆抗体的最佳稀释度。
结果显示，随着金标鼠抗地高辛IgG稀释倍数的增加，C线的显色强度越来越弱，加入的链霉亲和素越多，T线的显色强度越来越强，直至金标鼠抗地高辛IgG稀释到5倍、链霉亲和素浓度为2mg/mL时，依据C、T线的显色情况确定最佳，结果见下表3。
表3链霉亲和素浓度和金标记鼠抗地高辛IgG不同稀释倍数的显色结果
羊抗鼠IgG浓度较高时，质控线颜色强度明显高于检测线，当稀释倍数为100时，两条检测线均清晰可见，而且颜色强度保持一致，结果见表4，因此，羊抗鼠IgG 1:100稀释时最佳。
表4羊抗鼠IgG不同稀释倍数的显色结果
4、核酸试纸条的组装、检测及结果判定
核酸试纸条由五部分组成，从下到上、由左至右依次为PVC板、硝酸纤维素膜、上样垫、金标垫、样品垫、吸水垫的紧密贴合，划膜仪按照1μL/cm的链霉亲和素和羊抗鼠IgG分别在NC膜上划出T、C线，将金标鼠抗地高辛IgG均匀涂布在胶体金垫上，37℃过夜干燥后紧密贴在PVC板上，以避免出现气泡影响样品层析流动，试纸条的两端分别贴上样品垫和吸水垫，启动裁条机将其切割成60mm×3.7mm的试纸条，固定在塑料外壳内，室温下密封避光干燥保存备用，见原理图2。
将PCR产物稀释后滴加于核酸试纸条直上，5min左右观察有无红色条带产生，有几条红色条带产生。结果判定，质控带与检测带都出现清晰可见红色条带为阳性；只有质控带出现清晰可见红色条带为阴性；质控带出现一条颜色清晰可见的红色条带，而在检测带出现一条浅色带为质疑；质控带没有出现红色条带为无效。
5、特异性试验
牛型结核分枝杆菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、丝状支原体、牛病毒性腹泻病毒、牛种布氏杆菌、绵羊肺炎支原体、M.bovis PG45、M.bovis新疆分离株的基因组DNA为模板进行PCR反应，产物滴加于试纸条上样垫上，5min后读取结果，同时取进行琼脂糖凝胶电泳检测进行特异性试验。
结果显示：牛型结核分枝杆菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、牛病毒性腹泻病毒、牛种布氏杆菌、绵羊肺炎支原体、M.bovis PG45、M.bovis新疆分离株的DNA作为模板添加到构建好的PCR反应体系中，扩增产物滴加到核酸检测试纸条上，结果见图3，试纸条能够检测到试验菌株中全部的M.bovis菌株，并且与其他致病菌无交叉反应，因此，试纸条特异性良好。
6、敏感性试验
M.bovis的DNA用去离子水进行10倍梯度稀释，将系列稀释液作为扩增模板，按照反应体系进行试验，分别将PCR产物滴加到同一批次试纸条的样品垫上，观察结果，进行敏感性试验。
结果显示：微量核酸蛋白检测仪测得提取的M.bovis的DNA浓度为90ng/μL，稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍后作为模板进行PCR扩增，PCR产物10倍稀释后滴加到核酸试纸条上，5min后观察检测结果，结果见表5，该试纸条检测M.bovis的DNA的检测下限为89fg/μL DNA，灵敏度为10-6。
表5核酸试纸条的敏感性验证显色结果
注：+表示阳性结果；—表示阴性结果
7、重复性和稳定性试验
随机取三份不同的PCR产物，稀释0倍、10-2倍、10-4倍、10-6倍，用同一批次制备的胶体金试纸条进行重复性试验，观察显色情况，进行重复性试验。
随机从按照优化好的最佳条件制备的三组不同批次的试纸条中抽取36个胶体金试纸条，第一组是室温存放3个月的试纸条；第二组是室温存放6个月的试纸条，第三组是室温存放12个月的试纸条，三个平行验证，对稀释0倍、10-2倍、10-4倍、10-6倍的同一份PCR产物进行稳定验证试验，观察显色情况，进行稳定性试验。
结果显示：随机取三份不同的PCR产物，分别稀释0倍、10-2倍、10-4倍、10-6倍，分别滴加在同一批次制备好的不同胶体金试纸条上进行重复性试验，观察显色情况，结果见表6，检测结果不因不同批次的PCR反应产物而改变，因此，试纸条重复性良好。
表6核酸试纸条的重复性验证显色结果
随机取同一份PCR产物分别稀释释0倍、10-2倍、10-4倍、10-6倍，分别滴加在室温存放3个月、6个月、12个月的不同批次的试纸条上进行稳定试验，观察显色情况，结果见表5，不同存放时间的试纸条检测线颜色强度差异不大，检测结果保持一致，稳定性良好，该试纸条常温下至少可以存放12个月。
表7核酸试纸条的稳定性验证显色结果
8、核酸检测胶体金试纸条的应用
采集M.bovis阳性的病牛肺脏30份，阴性样本10份，分别提取DNA，进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳及核酸试纸条检测，将两种方法检测结果进行平行比较。
结果显示：采集患有牛支原体病病牛的肺脏组织样本30份，健康牛的肺脏组织样本10份，分别提取DNA并进行PCR扩增，扩增产物分别经琼脂糖凝胶电泳及核酸试纸条检测，将两种方法检测结果进行平行比较，结果见表8，两种方法具有良好的符合率，合计共40份
临床样本，与琼脂糖凝胶电泳检测法的符合率为100％。
表8两种检测方法的比较结果
本申请利用胶体金可以和抗体或生物素等标记的寡核苷酸相结合这一信号放大技术，提高检测灵敏度，构成可显色的检测探针这一特性，整合了PCR的特异性、敏感性和金标条快速、简单的特性，使检测可以快速的在2h内可完成，特异性良好，除仅对M.bovisPG45、M.bovis新疆分离株产生阳性结果外，不与其他相近致病微生物交叉反应，敏感性良好，检测下限为89fg/μL的DNA，灵敏度为10-6，而普通琼脂糖凝胶电泳的灵敏度一般为10-5，重复性、稳定性良好，利用胶体金的可放大特性和链霉亲和素-地高辛系统极强的亲和力，使胶体金免疫层析技术与PCR产物中的生物素探针紧密结合，更灵敏且更快速，大大简化操作、节省时间、提高反应效率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 石河子大学
<120> 一种牛支原体核酸检测胶体金免疫试纸条及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(P1-BI)
<400> 1
tgaaactttc tcagcattag cc 22
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(P2-DI)
<400> 2
cgttatgcaa gattaaatac ttacgac 27