具体实施方式

以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。

下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。

在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。

本申请的描述中，除非另有明确的限定，设置、安装、连接等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本申请中的具体含义。

本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

参考图1，示出了本申请的一个实施例的核酸检测方法中所产生的磁珠复合体的结构，该磁珠复合体包括磁珠100、核苷酸链130、待测核酸片段140、一抗150、二抗160。核苷酸链130与磁珠100相连接，并根据碱基互补配对原则与待测核酸片段相连接而形成杂交双链体，而一抗150则能够与杂交双链体通过抗原-抗体相互作用特异性结合，二抗160则与一抗150通过抗原-抗体相互作用特异性结合。

在上述实施例中，磁珠100是一种磁性粒子，在其中一些具体实施方式中，磁珠100包括内部的磁性颗粒和包裹在磁性颗粒外侧的聚合物壳层。

在其中一些具体实施方式中，核苷酸链130为RNA探针，能够与待测核酸片段140发生碱基互补配对从而形成杂交双链体，而在其中一些实施方式中，杂交双链体为DNA：RNA杂交双链。

在其中一些具体实施方式中，核苷酸链130上修饰有连接元件，能够通过该连接元件与磁珠100连接。例如，该连接元件可以是生物素120，而磁珠100上修饰有链霉亲和素110，通过链霉亲和素110和生物素120的连接将核苷酸链130固定到磁珠110上。

在上述实施例中，二抗160上具有检测标记170，通过二抗160与一抗150的特异性结合使得磁珠复合体上连接可供检测的检测标记170。在其中一些具体实施方式中，检测标记170可以是放射性同位素、酶、荧光物质、化学发光物质、生物发光物质、颜料分子等。在其中一些优选的实施方式中，检测标记170为酶。相比于其它免疫检测方法，酶联免疫检测特异性好、灵敏度高，且环境污染更低，酶具体可以是β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、脲酶、葡萄糖氧化酶等其中至少一种。

参考图2，示出了本申请的一个实施例中封装以及检测过程中所使用的微流控芯片的结构示意图。该微流控芯片具有流道层，在其中一些具体实施方式中，流道层包括液滴生成区210、混合反应区220和检测区230。液滴生成区210设有第一进液口211和第二进液口212，第一进液口211和第二进液口212分别通过相连的流道在A处交汇并与混合反应区220相连通。其中，第一进液口211用于向液滴生成区210内通入磁珠复合体的水溶液，而第二进液口212用于向液滴生成区210内通入油相。混合反应区220内设有反应流道221形成的反应室，在液滴生成区210内生成的液滴进入反应流道221，其中的反应原料相互发生反应。反应结束后，液滴以及包裹在液滴内的磁珠复合体被送入检测区230的检测室231中分散，并根据液滴内磁珠上是否带有检测标记对其进行检测从而判断待测核酸片段的含量。在其中一些具体的实施方式中，还包括第三进液口213，第三进液口213与第一进液口211相靠近，用于向液滴生成区210内通入其它参与反应的原料。在其中一些实施方式中，第三进液口213与第一进液口211在A处前已完成汇合，形成水相的混合液参与液滴的形成。例如，在检测标记为酶时，可以通过第三进液口213向微流控芯片内通入酶反应的底物，从而使底物能够与酶混合发生反应。检测结束后，废弃物由与检测室231相连接的废液口232向外排出，其中的磁珠可以经外界磁场进行分离、清洗从而完成回收。

参考图3，示出了本申请的图2中A位置的局部的放大图。结合图2，与第二进液口212相连通的流道在此处形成第一油相入口310和第二油相入口320，而与第一进液口211相连通的连通在此处形成水相入口330，第一油相入口310和第二油相入口320相对设置并与水相入口330相互连通形成交汇区域并形成出口340，从第二进液口212送入的油相由第一油相入口310和第二油相入口320注入到交汇区域，而磁珠复合体的水溶液由水相入口330注入，在交汇区域内，油相在压力和剪切力的作用下将流动的磁珠复合体的水溶液截断，并包裹这些截断的水溶液部分而形成油包水的液滴350，随后在压力作用下由出口340送入反应室220内。

在其中一些具体实施方式中，液滴的体积被控制在(1～10)×10^-15L。磁珠复合体在被限制到飞升左右大小的液滴内后，检测标记的信号或检测标记经反应产生的信号浓缩为可以直接进行检测的信号，能够进一步降低其检测限，提高检测的灵敏度和准确性。在微流控芯片中，控制液滴大小的方式可以是调节各个入口的液体的流速和水相和油相中组分以及配比的不同，或者也可以通过调节出口的尺寸来调节生成的液滴的大小。参考图4，从a～c分别是图3中的出口的直径在10μm、20μm和30μm时，产生液滴大小的照片。从图中可以看出，当出口340的尺寸越大，产生的液滴350的直径也就越大。因此，可以通过上述任意至少一种方式或其它本领域所熟知的方式来调节液滴的大小。

参考图5，示出了本申请实施例中微流控芯片采用酶链免疫方法进行检测的原理图。其中，a表示移入到检测室中均匀排列的液滴，由于液滴的体积较小，单一液滴中仅能包裹一个磁珠，因而这些液滴分为包裹了磁珠复合体的液滴和不含有磁珠复合体的液滴。在包含磁珠复合体的液滴中，磁珠复合体上的核苷酸链形成了杂交双链体，使得一抗和二抗结合到磁珠上，并载有对应的检测标记(a中部分液滴内的橄榄形标记)。而其它液滴中不具有能够被检测出的检测标记。b表示a中液滴的显色结果图。包裹有磁珠复合体的液滴中磁珠与底物混合后，出现显色反应，从而使得这部分液滴能够检测出对应的光信号；相比而言，其它液滴由于没有能够被检测出的检测标记，也就无法显色，而保持原状。c表示对b中对应的结果的定量计数。参考图5的c，由于液滴体积较小，一个液滴中仅包裹有一个磁珠，这样可以直接对检测室中发光的液滴进行统计计数，或者可以进一步与液滴的总数进行比较，从而得到样本中待测核酸片段的含量。

在其中一些具体实施方式中，由于采用酶链免疫的检测方法，微流控芯片各个部分对于反应温度的要求不会过于严苛，因而可以采用连续流的设计方式，将液滴的生成、混合与反应和液滴成像通过微流道连接起来，发挥微流控芯片试剂消耗小、检测效率高的优点，极大降低分析检测成本和人为干扰。在液滴的混合反应区，通过在流道中设计多个混合单元并搭配螺旋状的流道从而对生成的液滴进行充分混合，进一步可以通过仪器对调节该区域的温度，促进底物与酶结合，产生酶促荧光底物，使得整个液滴产生相应的荧光，并最终在检测区内对液滴进行成像。

本实施例提供一种核酸检测方法，该核酸检测方法包括以下步骤：S1：提供待测样本、磁珠、一抗和二抗；S2：将待测样本、磁珠、一抗和二抗混合反应，得到上述的磁珠复合体；S3：根据磁珠复合体的检测标记进行检测，得到检测结果。该核酸检测方法采用磁珠作为整个反应的反应基底和最小反应单元，能够在后续一抗、二抗的免疫反应中起到浓缩和放大的作用；而且，在将各种反应试剂混合参与反应后，磁珠还可以加快免疫反应的速度，减少反应时间。通过一抗对杂交双链体进行捕获，利用二抗对杂交双链体进行检测，增加了检测的特异性和灵敏度，而且无需另外对待测核酸片段进行扩增。

在其中一些具体实施方式中，磁珠在检测过程中以封装在液滴中的形式参与反应。通过封装形成液滴的方式使其在反应过程中以液滴中的磁珠作为最小反应单元，进一步加快免疫反应的速度，减少反应时间。在其中一些优选的实施方式中，封装形成液滴的方式为微流控芯片加工的方式。

在其中一些具体实施方式中，封装磁珠的液滴的体积为(1～10)×10^-15L。通过将磁珠复合体生成并限制在飞升左右大小的液滴内，能够将检测标记的信号或检测标记经反应产生的信号进一步浓缩，使得不易被检测到的信号更容易被检测到，以进一步降低其检测限。

在其中一些具体实施方式中，磁珠通过微流控芯片进行封装，以油相为流动相，以含有磁珠的水溶液为分散相，在压力和/或剪切力的作用下将磁珠封装磁珠形成油包水的液滴。其中，油相可以是液态的烃、酯等，具体如氟油、硅油、矿物油、植物油、石油醚等。在其中一些优选的实施方式中，油相还包括表面活性剂，表面活性剂的非限制性实例可以是司盘、曲拉通、EM 90、氟碳表面活性剂等。通过在油相中加入表面活性剂使得形成的液滴更加稳定，从而在后续的反应过程中液滴不会发生融合和物质交换，始终保持完整独立的液滴形态。因此，在检测时，无需设计对应液滴大小的微孔结构并通过磁力等方式将液滴沉入其中，而是可以直接进行检测。同时，由于无需微孔结构进行分割隔离，检测区的液滴的尺寸可以更加均匀且具有更大的密度，能够方便检测并提供更高的通量。

在其中一些具体实施方式中，二抗上的检测标记为酶。利用酶联免疫的方法使得磁珠复合体上的酶与提供的底物反应显色，产生可供检测的光信号。相比于其它免疫检测方法，特异性好，灵敏度高，且环境污染更低。用作检测标记的酶的非限制性实例包括β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、脲酶、葡萄糖氧化酶。另外，在其中一些优选的实施方式中，二抗可以采用多孔纳米材料负载多个检测标记的形式，并在其中标记用于特异性结合一抗的抗体。这种情况下，负载的多个检测标记可以进一步放大检测信号，提高检测灵敏度。

在其中一些具体实施方式中，检测中使用的磁珠的直径为0.5～2μm，液滴的直径为1～50μm。

下面以具体的实施例对本申请进行说明。

实施例1

本实施例提供一种核酸检测试剂盒，该核酸检测试剂盒中的微流控芯片如上文所述。该试剂盒还包括磁珠、一抗、二抗以及底物。其中，磁珠为20μL的浓度10mg/mL、粒径为1μm的链霉亲和素磁珠，并且磁珠上偶联有对应待测核酸片段的HPV mRNA探针。一抗为10μL的浓度为1μg/mL的Anti-DNA：RNA hybrid抗体(S9.6抗体)。二抗为10μL的浓度为1μg/mL的β-半乳糖苷酶标记的羊抗鼠抗体。底物为FDG(荧光素2-β-D-吡喃半乳糖苷)。另外，含有待测核酸片段的待测样本的体积为1mL。

本实施例还提供一种核酸检测方法，该方法包括以下步骤：

(1)将偶联有探针的磁珠的溶液、待测样本以及杂交缓冲液(50mM柠檬酸钠、750mMNaCl，pH 7.2)混合孵育5min，得到含有磁珠-DNA：RNA复合物的溶液。

(2)将第(1)步的反应产物与一抗、二抗混合孵育5min，形成磁珠-DNA：RNA-一抗-二抗的磁珠复合体的溶液。

(3)将混合溶液从第一进液口注入微流控芯片，同时将底物溶液从第三进液口注入微流控芯片，将氟油HFE7500(氟碳表面活性剂FSA，1wt％)从第二进液口注入微流控芯片，第一进液口、第二进液口和第三进液口的流速分别为0.1mL/h、0.4mL/h和0.1mL/h，混合反应，形成液滴。

(4)液滴在开始进入到检测室20分钟后，通过荧光显微镜对检测室进行成像。

在上述检测方法中，控制流速最终形成的液滴的体积为1×10^-14L左右。

在上述检测方法中，使用纯化后的HPV DNA作为标准品形成标准曲线。HPV DNA的浓度从1×10⁶拷贝/mL开始，并进行10倍梯度稀释。记录显微镜图像并进行分析以定量HPVDNA的浓度。由于液滴被填充在成像区域内，因此将带有荧光的明亮液滴占液滴总量的分数用作计算HPV DNA浓度的输出信号。

结果见图6和图7，其中，图6是实施例1中不同浓度样品的荧光图像，a～f分别表示10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸copies/mL的浓度梯度，图7是不同浓度标准品绘制得到的标准曲线。结合图7，检测范围为10⁶拷贝/mL到10³拷贝/mL，线性关系为Y＝5.829×log(X)-18.59，R²＝0.964。因此，该实施例所提供的检测方法最低可检测10³数量级的核酸分子。

与商用产品Hybrid Capture 2相比，该实施例所提供的检测HPV的方法的LOD更低，时间和试剂消耗更少。与基于PCR的方法相比，该检测方法避免了高成本、复杂的处理程序和气溶胶污染的问题。该方法简单、通用，并且具有出色的定量能力。

从上述实施例可以看出，本申请的方案通过将常规生化反应压缩在飞升级的微液滴反应器中，可以将微小生化信号进行浓缩，使得不易被检测的信号能更容易被检测到。利用磁珠进行探针的修饰，在捕获到目标核酸分子后，DNA：RNA的杂交双链被Anti-DNA：RNAhybrid抗体捕获。鼠源Anti-DNA:RNA hybrid抗体利用酶标的羊抗鼠抗体进行标记，形成最终的免疫复合体。免疫复合体与其荧光底物通过液滴微流控芯片产生数十万个，尺寸为十微米左右的液滴。当液滴中存在免疫复合体时，其中的酶能够催化荧光底物产生荧光信号，并进行拍照分析。根据荧光液滴占所有液滴的比例，可计算得到核酸分子的绝对定量结果。

综上所述，基于液滴的核酸杂交法可以实现免扩增的高灵敏度核酸检测，一方面利用抗原抗体结合的特异性，实现在复杂样本中的高灵敏检测，另一方面，具有检测时间短的优势，整个检测过程可以控制在30分钟以内，便于快速诊断。此外，还可以通过设计多个微流通道，实现多个靶标的检测分析。

实施例2

本实施例提供一种核酸检测试剂盒，与实施例1的区别在于，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，底物为TMB(3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine)。采用实施例1中的方法进行检测，分析检测结果发现，与实施例1具有类似的检测范围和较低的LOD。

上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。