阅读说明：本技术 用于鉴定孕早期胎儿染色体性别的引物和探针、鉴定方法及试剂盒 (Primer and probe for identifying chromosome sex of fetus in early pregnancy, identification method and kit ) 是由 周英杰 刘鹏 刘学军 刘慈 于 2019-09-18 设计创作，主要内容包括：本发明涉及基因鉴定技术领域,具体公开一种用于鉴定胎儿染色体性别的引物和探针、鉴定方法及试剂盒。所述用于鉴定胎儿性别的引物和探针根据男性性别决定基因SRY设计的引物和探针以及根据Y染色体AZF区域中的a区域、b区域和c区域的基因序列分别设计的3对引物和探针。本发明设计多对引物及相应的探针,检测过程中以四个通道荧光检测的方法来判断SRY基因和Y染色体的存在,具有准确性高检测通量高以及灵敏度高的特点。(The invention relates to the technical field of gene identification, and particularly discloses a primer, a probe, an identification method and a kit for identifying the sex of a chromosome of a fetus. The primer and the probe for identifying the fetal sex are designed according to a male sex determination gene SRY and 3 pairs of primers and probes respectively designed according to gene sequences of a region a, a region b and a region c in an AZF region of a Y chromosome. The invention designs a plurality of pairs of primers and corresponding probes, judges the existence of the SRY gene and the Y chromosome by a four-channel fluorescence detection method in the detection process, and has the characteristics of high accuracy, high detection flux and high sensitivity.)

用于鉴定孕早期胎儿染色体性别的引物和探针、鉴定方法及 试剂盒

技术领域

本发明涉及基因鉴定技术领域，尤其涉及用于鉴定胎儿染色体性别的引物和探针、鉴定方法及试剂盒。

背景技术

为降低性别连锁遗传病发病率，提高人群遗传素质和出生人口质量，孕期胎儿性别鉴定技术成为风险评估的必要技术手段之一。

目前对于胎儿性别的产前鉴定分为有创性和无创性，有创性产前诊断主要为羊膜腔穿刺技术，该方法对胎儿和孕妇都有一定的危险性，易导致宫内感染、流产、胎儿死亡等不良反应，不容易被孕妇及家人所接受；无创性产前诊断主要为超声影像诊断技术，此类检查可从形态学检出胎儿性别或是否存在畸形，但在孕早期其敏感性较低，鉴定范围受限，因此发展新的无创性方法来鉴定胎儿性别或基因异常具有重要的临床意义。

孕妇血浆中胎儿游离DNA的发现为产前鉴定提供了新的研究方向，通过提取母体血浆中胎儿游离DNA，对胎儿性别决定基因SRY和Y染色体特异性位点进行分析，从而达到鉴定胎儿染色体性别的目的，目前用于检测胎儿游离DNA的方法包括：巢式PCR、荧光定量PCR、荧光原位杂交、高通量基因测序等。但母体血浆中胎儿游离DNA的含量较低，目前所用的鉴定方法灵敏度和特异性均受到影响。

目前已有通过男性性别决定基因SRY设计引物和探针，用单基因、单通道方法，通过荧光定量PCR检测SRY基因是否存在，来鉴定胎儿性别，但在孕早期(妊娠6-8周)，胎儿游离DNA浓度较低，较易出现因模板浓度低造成PCR扩增失败，需多进行次重复DNA提取和检测，增加鉴定的难度和鉴定成本。若同时对SRY基因和Y染色体特异区域多个位点进行检测，传统荧光定量PCR方法检测通量低，且不方便设置内参，操作繁琐，大大限制了荧光定量PCR方法的应用。

发明内容

针对现有通过妊娠6周后的孕妇血浆中胎儿游离DNA进行胎儿染色体性别鉴定的方法存在检测灵敏度低、模板扩增易失败、鉴定成本高以及传统荧光定量PCR方法检测通量低、不易设置内参、操作繁琐等问题，本发明提供一种用于鉴定胎儿染色体性别的引物和探针、鉴定方法及试剂盒。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种用于鉴定孕早期胎儿染色体性别的引物和探针，包括

根据男性性别决定基因SRY设计的上游引物SEQ ID NO:1、下游引物SEQ ID NO:2及探针SEQ ID NO:3；

根据Y染色体AZF基因序列中的a区域设计的上游引物SEQ ID NO:4、下游引物SEQID NO:5及探针SEQ ID NO:6；

根据Y染色体AZF基因序列中的b区域设计的上游引物SEQ ID NO:7、下游引物SEQID NO:8及探针SEQ ID NO:9；

根据Y染色体AZF基因序列中的c区域设计的上游引物SEQ ID NO:10、下游引物SEQID NO:11及探针SEQ ID NO:12；

所述探针SEQ ID NO:3、6、9和12分别携带不同的荧光基团。

相对于现有技术，本发明提供的用于鉴定孕早期胎儿性别的引物和探针中包含四对不同的引物及相应的探针，四种引物可在同一荧光定量RCR反应体系中同时进行PCR扩增，可实现同一反应体系的多重荧光定量PCR，且四种探针携带不同的荧光基团，检测过程中以四个通道荧光检测的方法来判断SRY基因和Y染色体的存在，与以往方法相比，在不增加采血量、不延长检测时间以及不改变采血孕周的情况下，有效地保证了结果的准确性，检测通量高，灵敏度高，在提取的游离DNA的浓度达到0.2ng/ul的浓度下就可实现其检测效果，实现了孕早期胎儿染色体性别的快速鉴定。

还包括根据锌指蛋白基因ZFX/ZFY设计的参照上游引物SEQ ID NO:13、下游引物SEQ ID NO:14及探针SEQ ID NO:15；

根据Y染色体AZF基因序列中的a区域设计的参照上游引物SEQ ID NO:16、下游引物SEQ ID NO:17及探针SEQ ID NO:18；

根据Y染色体AZF基因序列中的b区域设计的参照上游引物SEQ ID NO:19、下游引物SEQ ID NO:20及探针SEQ ID NO:21；

根据Y染色体AZF基因序列中的c区域设计的参照上游引物SEQ ID NO:22、下游引物SEQ ID NO:23及探针SEQ ID NO:24；

所述探针SEQ ID NO:3和15携带相同的荧光基团，所述探针SEQ ID NO:6和18携带相同的荧光基团，所述探针SEQ ID NO:9和21携带相同的荧光基团，所述探针SEQ ID NO:12和24携带相同的荧光基团。

本发明根据锌指蛋白基因ZFX/ZFY设计的参照引物及探针SEQ ID NO:13-15对模板进行荧光定量PCR扩增来作为判断多重荧光定量PCR反应体系的有效性，结合根据AZF基因序列a、b、c区域分别设计的引物和探针SEQ ID NO:16-24对模板进行荧光定量PCR扩增来作为Y染色体存在的进一步参照，可实现对提取的游离DNA的样品采集、提取和扩增各步骤进行严格质控，进一步保证了结果的准确性。

优选的，所述不同的荧光基团选自FAM、VIC、ROX和Cy5，即所述探针SEQ ID NO:3、6、9和12所携带的不同的荧光基团可选自FAM、VIC、ROX和Cy5中的任意一种。

本发明还提供利用所述引物和探针进行孕早期胎儿染色体性别鉴定的方法，该方法，至少包括以下步骤：

a、从母体外周血中提取游离DNA；

b、以提取的游离DNA为模板，加入根据SRY和AZF基因序列中的a、b和c区域设计的引物和探针SEQ ID NO:1-12；在荧光定量PCR反应体系中进行荧光定量多重PCR反应；

c、分别用探针SEQ ID NO:3、6、9和12携带的四个荧光基团对应的四个荧光检测通道检测荧光定量多重PCR反应，若探针SEQ ID NO:3携带的荧光基团对应的荧光通道检测出扩增曲线，且探针SEQ ID NO:6、9和12携带的三个荧光基团对应的三个荧光通道中至少有一个荧光通道检测出扩增曲线，则胎儿含有Y染色体；若探针SEQ ID NO:3、6、9和12携带的四个荧光基团对应的四个荧光通道都检测不出荧光信号，则胎儿不含Y染色体。

相对于现有技术，本发明提供的鉴定方法，操作简单，检测通量高，实时荧光监测灵敏度高，采用多重荧光定量PCR技术，以四个通道荧光检测的方法，判断SRY基因和Y染色体的存在，在不增加采血量、不延长检测时间和不改变采血孕周的情况下，检测成功率达到100％，准确率可达到100％以上。

优选的，步骤b中所述的荧光定量PCR反应体系为25ul，包括：

所述PCR反应体系中的引物和探针的浓度为10uM；所述DNA模板的浓度≥0.2ng/ul；

步骤b中所述荧光定量多重PCR反应过程如下：

预热：50℃，2min，

预变性：95℃，5min，

变性：95℃，15s，

退火：60℃，30s，

延伸：72℃，30s，

变性、退火和延伸共38个循环，

总延伸：72℃，5min。

本发明还提供另一种利用所述引物和探针进行孕早期胎儿染色体性别鉴定的方法，该方法，至少包括以下步骤：

a、从母体外周血中提取游离DNA；

b、以提取的游离DNA为模板，加入根据SRY和AZF基因序列中的a、b和c区域设计的引物和探针SEQ ID NO:1-12，得到荧光定量PCR反应体系A；

以提取的游离DNA为模板，加入根据ZFX/ZFY和AZF基因序列中的a、b和c区域设计的参照引物和探针SEQ ID NO:13-24，得到荧光定量PCR反应体系B；

荧光定量PCR反应体系A和B同时进行荧光定量多重PCR反应；

c、分别用探针SEQ ID NO:3、6、9和12携带的四种荧光基团对应的荧光检测通道检测所述体系A和B的荧光定量多重PCR反应，检测过程中，若探针SEQ ID NO:3携带的荧光基团对应的荧光检测通道测出2条扩增曲线，且探针SEQ ID NO:6、9和12携带的三种荧光基团对应的荧光检测通道中至少有一个通道检测出1条扩增曲线，则胎儿含有Y染色体；若探针SEQ ID NO:3携带的荧光基团对应的荧光检测通道只检测出1条扩增曲线，且探针SEQ IDNO:6、9和12携带的三种荧光基团对应的荧光检测通道都无扩增曲线，则胎儿不含Y染色体；检测过程中，若探针SEQ ID NO:3携带的荧光基团对应的荧光检测通道未检测出扩增曲线，则PCR反应体系有误，检测结果无效。

相对于现有技术，本发明提供的鉴定方法，操作简单，检测通量高，实时荧光监测灵敏度高，采用两管两体系多重荧光定量PCR技术，以四个通道荧光检测的方法，同时还设置了四对参照引物和探针来判断SRY基因和Y染色体的存在，在不增加采血量、不延长检测时间和不改变采血孕周的情况下，检测成功率达到100％，准确率可达到100％。

优选的，步骤b中所述的荧光定量PCR反应体系A为25ul，包括：

余量的ddH2O；所述的荧光定量PCR反应体系B为25ul，包括：

所述PCR反应体系A和B中的引物和探针的浓度为10uM；所述DNA模板的浓度≥0.2ng/ul；

步骤b中所述荧光定量多重PCR反应过程如下：

预热：50℃，2min，

预变性：95℃，5min，

变性：95℃，15s，

退火：60℃，30s，

延伸：72℃，30s，

变性、退火和延伸共38个循环，

总延伸：72℃，5min。

本发明还提供了用于鉴定孕早期胎儿染色体性别的试剂盒，该试剂盒具体包括权利要求1-3任一项所述的引物和探针、PCR缓冲液和DNA聚合酶。

通过上述试剂盒，可以快速检测孕早期(6-8周)的胎儿染色体性别，进而判断出胎儿性别，检测方法简单、快速、检测的成功率和检测结果的准确率较高，实现了孕期胎儿性别的快速诊断。

附图说明

图1A是本发明实施例1中的检测的胎儿为男性时FAM通道的检测信号；

图1B是本发明实施例1中的检测的胎儿为男性时VIC通道的检测信号；

图1C是本发明实施例1中的检测的胎儿为男性时ROX通道的检测信号；

图1D是本发明实施例1中的检测的胎儿为男性时Cy5通道的检测信号；

图2A是本发明实施例1中检测的胎儿为女性时FAM通道的检测信号；

图2B是本发明实施例1中检测的胎儿为女性时VIC通道的检测信号；

图2C是本发明实施例1中检测的胎儿为女性时ROX通道的检测信号；

图2D是本发明实施例1中检测的胎儿为女性时Cy5通道的检测信号；

图3A是本发明实施例2中检测的胎儿为男性时FAM通道的检测信号；

图3B是本发明实施例2中检测的胎儿为男性时VIC通道的检测信号；

图3C是本发明实施例2中检测的胎儿为男性时ROX通道的检测信号；

图3D是本发明实施例2中检测的胎儿为男性时Cy5通道的检测信号；

图4A是本发明实施例2中检测的胎儿为女性时FAM通道的检测信号；

图4B是本发明实施例2中检测的胎儿为女性时VIC通道的检测信号；

图4C是本发明实施例2中检测的胎儿为女性时ROX通道的检测信号；

图4D是本发明实施例2中检测的胎儿为女性时Cy5通道的检测信号；

图5A是本发明实施例2中检测阳性对照的FAM通道的检测信号；

图5B是本发明实施例2中检测阳性对照的VIC通道的检测信号；

图5C是本发明实施例2中检测阳性对照的ROX通道的检测信号；

图5D是本发明实施例2中检测阳性对照的Cy5通道的检测信号；

图6A是本发明实施例2中检测阴性对照的FAM通道的检测信号；

图6B是本发明实施例2中检测阴性对照的VIC通道的检测信号；

图6C是本发明实施例2中检测阴性对照的ROX通道的检测信号；

图6D是本发明实施例2中检测阴性对照的Cy5通道的检测信号；

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种用于鉴定孕早期胎儿染色体性别的引物和探针，包括

根据男性性别决定基因SRY设计上游引物SEQ ID NO:1、下游引物SEQ ID NO:2及探针SEQ ID NO:3；

根据Y染色体AZF基因序列中的a区域设计的上游引物SEQ ID NO:4、下游引物SEQID NO:5及探针SEQ ID NO:6；

根据Y染色体AZF基因序列中的b区域设计的上游引物SEQ ID NO:7、下游引物SEQID NO:8及探针SEQ ID NO:9；

根据Y染色体AZF基因序列中的c区域设计的上游引物SEQ ID NO:10、下游引物SEQID NO:11及探针SEQ ID NO:12；

其中SEQ ID NO:3携带的荧光基团选用FAM，SEQ ID NO:6携带的荧光基团选用VIC，SEQ ID NO:9携带的荧光基团选用ROX，SEQ ID NO:12携带的荧光基团选用Cy5。

利用上述引物和探针进行孕早期胎儿性染色体别鉴定的方法，包括以下步骤：

a、从母体外周血中提取游离DNA：

血浆分离：

(a)从怀孕6周的母体中抽取外周血，配平待离心采血管，4℃，1600rcf，离心10min；

(b)离心后取上层血浆1400ul，转入新的EP管中，常温，16000rcf，离心10min；

(c)取1300ul离心完毕的血浆，转入另一新的EP管中，-20℃保存待用。

样本制备

采用商业化试剂盒-血浆游离DNA提取试剂盒(磁珠法)，从血浆中提取胎儿游离DNA，提取步骤如下：

(1)将血浆样品室温17900g离心5min；

(2)向15ml BD管中加入试剂Ⅱ15ul、磁珠30ul，试剂Ⅰ100ul、裂解液2ml，取步骤(1)离心后的样品1.2ml加入BD管；

(3)将BD管放在垂直混合仪上12r/min室温混匀20min；

(4)将(3)混匀完毕的混合液靠近磁力架，轻轻移动BD管并将底部靠近磁力架，可见磁珠聚集在BD管底部，待上清中无磁珠悬浮即可；

(5)取2.0ml离心管于磁力架上，将BD管中磁珠转移至2.0ml离心管中，静置1min，弃上清；

(6)向2.0ml离心管中加入500ul洗液Ⅰ，将离心管从磁力架取下，用手轻弹管底，轻柔混匀磁珠，混匀后放回磁力架，室温静置1min，弃上清；

(7)向2.0ml离心管中加入500ul洗液Ⅱ，将离心管从磁力架取下，用手轻弹管底，轻柔混匀磁珠，混匀后放回磁力架，室温静置1min，弃上清；

(8)在磁力架上向2.0ml离心管磁珠另一侧缓慢加入550ul洗液Ⅲ，切勿冲起磁珠，轻轻颠倒磁力架，室温静置1min，弃上清；

(9)将2.0ml离心管在离心机上瞬时离心，放回磁力架，吸弃残留液体，要尽可能吸去完全；

(10)将2.0ml离心管从磁力架取下放在离心管架上，向2.0ml离心管加入42ul洗脱液，轻弹管底，混匀磁珠；

(11)将离心管放入55℃水浴锅中反应10min，中间轻弹混匀3-4次；

(12)将2.0ml离心管瞬时离心后放回磁力架，静置3-5分钟，取上清至1.5ml离心管中；

(13)每个样品取出2ul，使用Qubit fluorometer 3.0核酸定量计检测样品DNA浓度，浓度≥0.2ng/ul时即可作为模板进行荧光定量PCR。

b、以提取的游离DNA为模板，加入根据SRY和AZF基因序列中的a、b和c区域设计的引物和探针SEQ ID NO:1-12，，在荧光定量PCR反应体系中进行荧光定量多重PCR反应；

其中荧光定量PCR反应体系为25ul，具体包括：

所述PCR反应体系中的引物和探针的浓度为10uM；所述DNA模板的浓度为0.2ng/ul；

荧光定量多重PCR反应过程如下：

预热：50℃，2min；

预变性：95℃，5min；

变性：95℃，15s，

退火：60℃，30s，

延伸：72℃，30s，

变性、退火和延伸共38个循环，

总延伸：72℃，5min。

c、分别用FAM、VIC、ROX和Cy5四个荧光基团对应的四个荧光检测通道检测荧光定量多重PCR反应，在荧光定量多重PCR反应的第一次退火开始时收集FAM/VIC/ROX/Cy5信号，若FAM通道能检测出扩增曲线，VIC、ROX和Cy5三个荧光通道中至少有一个通道检测出扩增曲线，则胎儿有Y染色体，正常情况下胎儿为男性；若FAM通道和VIC、ROX和Cy5三个荧光通道都检测不出荧光信号，则胎儿胎儿不含Y染色体，正常情况下胎儿为女性。

在检测过程中同时设置一个阳性对照和一个阴性对照；阳性对照进行荧光定量PCR反应使用的模板为分别包含SRY基因和Y染色体AZF基因a、b、c区域的质粒混合液；阴性对照进行荧光定量PCR反应使用的模板为去离子水，阳性对照和阴性对照中加入的引物、试剂及荧光定量PCR反应过程与上述检测过程相同。

利用上述检测引物及检测方法对10名孕6周的孕妇进行采血鉴定，所孕胎儿含有Y染色体时母体外周血的荧光信号为：FAM通道有1条扩增曲线，如图1A所示，VIC、ROX、Cy5通道都有1条扩增曲线，检测如图1B-1D所示；所孕胎儿不含Y染色体时母体外周血的荧光信号，FAM通道无扩增曲线，如图2A所示，VIC、ROX、Cy5通道都无扩增曲线，如图2B-2D所示。

阳性对照体系的荧光定量多重PCR反应的检测结果是FAM、VIC、ROX、Cy5四个通道都有1条扩增曲线；阴性对照体系的荧光定量多重PCR反应的检测结果是FAM、VIC、ROX、Cy5四个通道都无扩增曲线；说明该检测方法中使用的引物、探针及荧光定量多重PCR反应过程没有问题。

上述检测结果的准确性达到100％，且每一个样品的检测结果均有效，即检测成功率达到100％。

实施例2

一种用于鉴定孕早期胎儿性别的引物和探针，包括

根据男性性别决定基因SRY设计的上游引物SEQ ID NO:1、下游引物SEQ ID NO:2及探针SEQ ID NO:3；

根据Y染色体AZF基因序列中的a区域设计的上游引物SEQ ID NO:4、下游引物SEQID NO:5及探针SEQ ID NO:6；

根据Y染色体AZF基因序列中的b区域设计的上游引物SEQ ID NO:7、下游引物SEQID NO:8及探针SEQ ID NO:9；

根据Y染色体AZF基因序列中的c区域设计的上游引物SEQ ID NO:10、下游引物SEQID NO:11及探针SEQ ID NO:12；

其中SEQ ID NO:3携带的荧光基团为FAM，SEQ ID NO:6携带的荧光基团为VIC，SEQID NO:9携带的荧光基团为ROX，SEQ ID NO:12携带的荧光基团为Cy5。

还包括根据锌指蛋白基因ZFX/ZFY设计的内对照上游引物SEQ ID NO:13、下游引物SEQ ID NO:14及探针SEQ ID NO:15；

根据Y染色体AZF基因序列中的a区域设计的内对照上游引物SEQ ID NO:16、内对照下游引物SEQ ID NO:17及探针SEQ ID NO:18；

根据Y染色体AZF基因序列中的b区域设计的内对照上游引物SEQ ID NO:19、内对照下游引物SEQ ID NO:20及探针SEQ ID NO:21；

根据Y染色体AZF基因序列中的c区域设计的内对照上游引物SEQ ID NO:22、内对照下游引物SEQ ID NO:23及探针SEQ ID NO:24；

所述探针SEQ ID NO:3和15携带的荧光基团选用FAM，所述探针SEQ ID NO:6和18携带的荧光基团选用VIC，所述探针SEQ ID NO:9和21携带的荧光基团选用ROX，所述探针SEQ ID NO:12和24携带的荧光基团选用Cy5。

利用上述引物和探针进行孕早期胎儿染色体性别鉴定的方法，包括以下步骤：

a、从母体外周血中提取游离DNA：

血浆分离：

(a)从怀孕6周的母体中抽取外周血，配平待离心采血管，4℃，1600rcf，离心10min；

(b)离心后取上层血浆1400ul，转入新的EP管中，常温，16000rcf，离心10min；

(c)取1300ul离心完毕的血浆，转入另一新的EP管中，-20℃保存待用。

样本制备

采用商业化试剂盒-血浆游离DNA提取试剂盒(磁珠法)，从血浆中提取胎儿游离DNA，提取步骤如下：

(1)将血浆样品室温17900g离心5min；

(2)向15ml BD管中加入试剂Ⅱ15ul、磁珠30ul，试剂Ⅰ100ul、裂解液2ml，取步骤(1)离心后的样品1.2ml加入BD管；

(3)将BD管放在垂直混合仪上12r/min室温混匀20min；

(4)将(3)混匀完毕的混合液靠近磁力架，轻轻移动BD管并将底部靠近磁力架，可见磁珠聚集在BD管底部，待上清中无磁珠悬浮即可；

(5)取2.0ml离心管于磁力架上，将BD管中磁珠转移至2.0ml离心管中，静置1min，弃上清；

(6)向2.0ml离心管中加入500ul洗液Ⅰ，将离心管从磁力架取下，用手轻弹管底，轻柔混匀磁珠，混匀后放回磁力架，室温静置1min，弃上清；

(7)向2.0ml离心管中加入500ul洗液Ⅱ，将离心管从磁力架取下，用手轻弹管底，轻柔混匀磁珠，混匀后放回磁力架，室温静置1min，弃上清；

(8)在磁力架上向2.0ml离心管磁珠另一侧缓慢加入550ul洗液Ⅲ，切勿冲起磁珠，轻轻颠倒磁力架，室温静置1min，弃上清；

(9)将2.0ml离心管在离心机上瞬时离心，放回磁力架，吸弃残留液体，要尽可能吸去完全；

(10)将2.0ml离心管从磁力架取下放在离心管架上，向2.0ml离心管加入42ul洗脱液，轻弹管底，混匀磁珠；

(11)将离心管放入55℃水浴锅中反应10min，中间轻弹混匀3-4次；

(12)将2.0ml离心管瞬时离心后放回磁力架，静置3-5分钟，取上清至1.5ml离心管中；

(13)每个样品取出2ul，使用Qubit fluorometer 3.0核酸定量计检测样品DNA浓度，浓度≥0.2ng/ul时即可作为模板进行荧光定量PCR。

b、以提取的游离DNA为模板，加入根据SRY和AZF基因序列中的a、b和c区域设计的引物和探针SEQ ID NO:1-12，，得到荧光定量PCR反应体系A；

以提取的游离DNA为模板，加入根据ZFX/ZFY和AZF基因序列中的a、b和c区域设计的内对照引物和探针SEQ ID NO:13-24，得到荧光定量PCR反应体系B；

荧光定量PCR反应体系A和B同时进行荧光定量多重PCR反应。

其中荧光定量PCR反应体系A为25ul，包括：

所述的荧光定量PCR反应体系B为25ul，包括：

所述PCR反应体系A和B中的引物和探针的浓度为10uM；所述DNA模板的浓度≥0.2ng/ul；

步骤b中所述荧光定量多重PCR反应过程如下：

预热：50℃，2min；

预变性：95℃，5min；

变性：95℃，15s，

退火：60℃，30s，

延伸：72℃，30s，

变性、退火和延伸共38个循环，

总延伸：72℃，5min。

c、分别用FAM、VIC、ROX和Cy5四个荧光基团对应的荧光检测通道检测荧光定量多重PCR反应，在荧光定量多重PCR反应的第一次退火开始时收集FAM/VIC/ROX/Cy5信号，若FAM通道有两条扩增曲线，且VIC、ROX和Cy5三个荧光通道中至少有一个通道检测出1条扩增曲线，则胎儿含有Y染色体，正常情况下胎儿为男性；若FAM通道只有1条扩增曲线，且VIC、ROX、Cy5通道都无扩增曲线，则胎儿不含Y染色体，正常情况下胎儿为女性；检测过程中，若探针FAM通道未检测出扩增曲线，则PCR反应体系有误，检测结果无效。

在检测过程中同时设置一个阳性对照和一个阴性对照；阳性对照进行荧光定量PCR反应使用的模板为分别包含SRY基因和Y染色体AZF基因a、b、c区域的质粒混合液；阴性对照进行荧光定量PCR反应使用的模板为去离子水，阳性对照和阴性对照中加入的引物、试剂及荧光定量PCR反应过程与上述检测过程相同。

利用上述检测引物及检测方法对10名孕6周的孕妇进行采血鉴定，所孕胎儿为男性时母体外周血的荧光信号为：FAM通道有2条扩增曲线，如图3A所示，VIC、ROX、Cy5通道都有2条扩增曲线，如图3B-3D所示；所孕胎儿为女性时母体外周血的荧光信号为：FAM通道有1条扩增曲线，如图4A所示，VIC、ROX、Cy5通道都无扩增曲线，如图4B-4D所示。

阳性对照体系的荧光定量多重PCR反应的检测结果是FAM、VIC、ROX、Cy5四个通道都有2条扩增曲线，如图5A-5D所示；阴性对照体系的荧光定量多重PCR反应的检测结果是FAM、VIC、ROX、Cy5四个通道都无扩增曲线，如图6A-6D所示；说明该检测方法中使用的引物、探针及荧光定量多重PCR反应过程没有问题。

上述检测结果的准确性达到100％，且每一个样品的检测结果均有效，即检测成功率达到100％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北医科大学第二医院

<120> 用于鉴定孕早期胎儿染色体性别的引物和探针、鉴定方法及试剂盒

<130> 2019.09

<160> 24

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

cattcttcca ggaggcaca 19

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gagtcggtct gagattgctg tggctttcgt acagtcatcc 40

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ccgcagatcc cgcttcgg 18

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

acaagggatt ttacatacag acata 25

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gagtcggtct gagattgctg ctctgaagcc tactacctgg ag 42

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ctaatgcaag ctggctaact cc 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

tcatagaggc taggctcaca a 21

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

gagtcggtct gagattgctg ctgcaggcag taataaggga 40

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

cacccactgg aatctaccaa agccc 25

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gagttacagg attcggcgtg 20

<210> 11

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gagtcggtct gagattgctg aacaaaagtt atgtgctcgt cat 43

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

ctgaaactgt ggtggaggag ga 22

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

aagataagtt tacataacca cctgg 25

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

gagtcggtct gagattgctg agttcttgct gtggactgcc 40

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

cacaagctga ccagcaaggc agag 24

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

agacttggta atggcttccc 20

<210> 17

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

gagtcggtct gagattgctg cctgatctca gacgtccagc t 41

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

ccaaagactg ggccccttaa acaac 25

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

aaactgtctg cctcaccata aa 22

<210> 20

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

gagtcggtct gagattgctg catgctatgc acttcagaaa ct 42

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

tctggaacat tctacttgaa gcg 23

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

gggtgttacc agaaggcaa 19

<210> 23

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

gagtcggtct gagattgctg caaacctaaa agcaattcta aacct 45

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

catgaacaat gggatgtggg c 21