阅读说明：本技术 地衣芽孢杆菌LCCC10150在生产β-葡聚糖酶和烟叶发酵中的应用 (Application of bacillus licheniformis LCCC10150 in production of beta-glucanase and tobacco fermentation ) 是由 郝捷 赵新海 柴颖 池景良 郭春生 钟丽娟 陈晨 杨洪峰 刘海龙 郭荣刚 *** 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10150在生产β-葡聚糖酶和烟叶发酵中的应用,地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10150能够产生高酶活性的β-葡聚糖酶,利用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10150生产β-葡聚糖酶,为β-葡聚糖酶的生产来源提供了一个新的途径,可以实现β-葡聚糖酶的规模化生产；将具有产高酶活力的β-葡聚糖酶的地衣芽孢杆菌应用到烟叶发酵中,能加速烟叶中葡聚糖的分解,明显缩短烟叶的发酵周期,提升烟叶的品质。(The invention provides an application of Bacillus licheniformis (LCCC 10150) in beta-glucanase production and tobacco fermentation, the Bacillus licheniformis (LCCC 10150) can produce beta-glucanase with high enzymatic activity, the Bacillus licheniformis (LCCC 10150) is used for producing the beta-glucanase, a new way is provided for the production source of the beta-glucanase, and the large-scale production of the beta-glucanase can be realized; the bacillus licheniformis with beta-glucanase with high enzyme activity is applied to the fermentation of tobacco leaves, the decomposition of glucan in the tobacco leaves can be accelerated, the fermentation period of the tobacco leaves is obviously shortened, and the quality of the tobacco leaves is improved.)

地衣芽孢杆菌LCCC10150在生产β-葡聚糖酶和烟叶发酵中的 应用

技术领域

本发明涉及一种地衣芽孢杆菌LCCC10150在生产β-葡聚糖酶和烟叶发酵中的应用，属于微生物应用的技术领域。

背景技术

烟叶发酵是烟叶加工过程中的重要环节之一，烟叶发酵实质实在一定的温度和湿度条件下，促使烟叶理化特性发生深刻变化的过程，是卷烟工业提高产品质量的一种初加工方法。

对于烟叶的发酵，目前多数采用自然发酵与人工发酵。自然发酵主要是借助自然气候的变化进行发酵的，它的主要特点是在烟叶贮藏期间，利用一年一度的春季温度上升，促进烟叶内酶的活动，使烟叶经过缓慢的发酵过程，以达到改善烟叶品质的目的。人工发酵是利用人为的适合烟叶内在品质变化的条件(即适宜的温度和湿度)，促使烟叶加快变化的方法。但两种方法均存在发酵进展缓慢的缺陷。

β-葡聚糖酶是催化水解β-葡聚糖的多种酶的总称，是烟叶发酵中用到的主要酶类之一。目前国际上工业化生产葡聚糖最常用的产酶菌种：地衣芽孢杆菌，可以用于食品的酶制剂生产。因此，筛选获得一种高酶活力的地衣芽孢杆菌，具有重要的意义。

现有技术CN103820356B公开了一种高产β-葡聚糖酶酶的地衣芽胞杆菌菌株。该菌株是将原始菌株CCTCC NO：M2013538，经紫外-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变得到。该菌株所产的β-葡聚糖酶酶活力高达8000-10000u/ml，是原始菌株的2.5倍。该菌株必须经过诱变才能得到高酶活力的β-葡聚糖酶，对诱变条件要求控制严格。目前，未有对已有的地衣芽胞杆菌菌株进行筛选，获得高酶活力的β-葡聚糖酶，且地衣芽胞杆菌菌株在烟叶发酵中的应用还未有任何报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10150在生产β-葡聚糖酶和烟叶发酵中的应用，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10150能够高产β-葡聚糖酶，十分适用于生产β-葡聚糖酶和烟叶发酵。

一方面，本发明提供了一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10150在生产β-葡聚糖酶中的应用。地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10150能够产生高酶活性的β-葡聚糖酶，为β-葡聚糖酶的生产来源提供了一个新的来源。

另一方面，本发明还提供了利用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10150生产β-葡聚糖酶的方法，该方法包括将地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)LCCC10150接种于液体培养基中进行发酵培养，得到发酵液的步骤。

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10150的接种量10⁵～10⁷cfu/ml，所述培养为振荡培养，转速为100～200r/min，温度为20～40℃，时间为1～3d；

优选的，接种量为10⁶cfu/ml，转速为160r/min，温度为35℃，时间为2d；

优选的，所述液体培养基含有NaNO₃ 0.2g、K₂HPO₄ 0.1g、KCl 0.05g、MgSO₄·7H₂O0.05g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、燕麦粉5g、蒸馏水100mL，培养基的pH为6.5～7.0；

优选的，pH为6.7。

进一步的，所述方法还包括将发酵液离心，上清液中加入硫酸铵进行沉淀，得粗酶液的步骤。

优选的，离心的转速为8000～12000rpm，时间为8～12min；

优选的，上清液加30～50％饱和度硫酸铵充分溶解后，离心，上清液加60～80％饱和度硫酸铵，离心后得粗酶。

所述方法还包括将粗酶液依次使用SephadexG-25柱脱盐，SephadexG 100柱层析进行纯化的步骤。

优选的，SephadexG-25柱脱盐时，用45～55mmol/L，pH 5～5.5的醋酸钠缓冲液洗脱，洗脱速度为55～65ml/h；

和/或SephadexG 100柱层析时，用45～55mmol/L，pH 5～5.5的醋酸钠缓冲液洗脱，洗脱速度为10～15mL/h。

另一方面，本发明提供了一种烟叶发酵方法，在烟叶中接种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10150进行发酵。

优选的，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10150的接种量为10⁵～10⁷cfu/g，发酵的温度为20～40℃，湿度为50～70％，时间为7～14d。

本发明的有益效果为：

本发明公开了地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10150能够产生高酶活力的β-葡聚糖酶，为β-葡聚糖酶的生产来源提供了一个新的途径，将具有产高酶活力的β-葡聚糖酶的地衣芽孢杆菌应用到烟叶发酵中，能加速烟叶中葡聚糖的分解，明显缩短烟叶的发酵周期，提升烟叶的品质。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，以下实施例仅为方便本领域技术人员理解本发明技术方案，实现或使用本发明所做的说明，并不以此限定本发明的保护范围。

本发明中，如未指定，所采用原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。本发明使用的衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)购于辽宁省微生物菌种保藏中心，编号LCCC10150。

实施例中的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

实施例1液体菌种培养及产酶工艺

液体菌种培养工艺：

通过对培养基条件、装液量、培养温度、培养时间等多因素培养条件优化研究，获得一级液体菌种如下培养工艺：

液体培养基配方：NaNO₃ 0.2g、K₂HPO₄ 0.1g、KCl 0.05g、MgSO₄·7H₂O 0.05g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、燕麦粉5g、蒸馏水100mL，培养基的pH为6.7。

装液量为：500mL三角瓶装120mL。

灭菌条件：1atm，30min。

培养条件：温度为30～40℃，摇床转速为100～200r/min。

培养周期：12～14h。

菌种质量标准：

感观指标：培养基颜色：乳白色。菌液放置1h后分层，底部可见沉淀物，高度为40％。

显微情况：中杆，整齐，较健壮，杆内可见内容物，刚形成芽孢。

活菌数：15～20亿/mL。

溶液pH：6.5～7.0。

产酶生产工艺:

通过对培养基条件、装液量、培养温度、培养时间与产酶关系等多因素培养条件优化研究，获得菌种产酶生产工艺：

液体培养基配方：NaNO₃ 0.2g、K₂HPO₄ 0.1g、KCl 0.05g、MgSO₄·7H₂O 0.05g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、燕麦粉5g、蒸馏水100mL，培养基的pH为6.7。

装液量为：70～75％。

灭菌条件：1atm，30min。

培养条件：温度为35℃，转速为100～200r/min。

培养周期：24～60h。

培养液质量标准：

感观指标：培养基颜色：乳白色。菌液放置10min后分层，底部可见沉淀物，高度为40％。

显微情况：很少有完整杆菌存在，几乎都为芽孢。

溶液pH：7.2～7.4

测得的发酵液的酶活为：≥1.0U/mL。

实施例2利用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10150生产β-葡聚糖酶的制备

利用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10150生产β-葡聚糖酶的制备方法包括：

(1)β-葡聚糖酶粗提：

将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10150以接种量10⁶cfu/ml接种于液体培养基中在160r/min，35℃，发酵培养2d。

液体培养基含有NaNO₃ 0.2g、K₂HPO₄ 0.1g、KCl 0.05g、MgSO₄·7H₂O 0.05g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、燕麦粉5g、蒸馏水100mL，培养基的pH为6.7。

发酵上清液经10000rpm，离心10min除菌体及杂质，上清液加40％饱和度硫酸铵放置过夜，离心弃去沉淀，上清液加70％饱和度硫酸铵，离心得粗酶。

根据微生物的发酵特性可知，微生物发酵过程中在产β-葡聚糖酶的同时还会产生淀粉酶、蛋白酶和糖化酶等胞外酶，这些酶对糖化水解烟草中的多糖非常有利，还有研究发现粗酶液的稳定性高于纯酶，这可能是因为粗酶液中的杂蛋白对酶的活性有一定的保护作用。

(2)β-葡聚糖酶纯化

为了研究β-葡聚糖酶的酶学性质，则需要对硫酸铵沉淀后的粗酶进行进一步纯化，流程为：

发酵液离心去除菌体和杂质—硫酸铵分段沉淀—SephadexG-25脱盐—SephadexG100柱层析—纯化的酶。

Sephadex G-25柱脱盐：将70％饱和硫酸铵沉淀物溶解于50ml 50mmol/L醋酸钠缓冲液(pH 5.3)中，然后取25m1上Sephadex G-25柱(50×3cm)进行脱盐，用50mmol/L醋酸钠缓冲液(pH 5.3)洗脱，洗脱速度为60ml/h。每管收集3m1，测定蛋白质浓度，收集含蛋白质的组分。

SephadexG-100柱层析：合并上述含蛋白质的组分(36m1)并浓缩，取15ml上Sephadex G-100(50×3cm)柱，用上述相同缓冲液进行洗脱分离，洗脱速度为12ml/h。每管收集2mI，收集含酶组分。

结果：粗酶液经硫酸铵沉淀、SephadexG-25脱盐、SephadexG-100柱层析后得到电泳级纯酶，纯化过程酶活力收率为13.9％，纯化倍数为6.6，比酶活由粗酶的1432U/mg提高到9500U/mg，达到电泳级纯度。

实施例3地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10150制备的在烟叶发酵中的应用

将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10150接种于烟叶，或将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10150与其它菌株，例如枯草芽孢杆菌或酵母菌一同加入烟叶中，用于发酵。其中，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10150的接种量为10⁵～10⁷cfu/g，发酵条件为：温度20～40℃，湿度为50～70％，时间为7～14d。

或将实施例2的纯化后的β-葡聚糖酶或含有β-葡聚糖酶的粗酶液或发酵液加入烟叶中，用来发酵，烟叶中加入的β-葡聚糖酶的酶活力为10-20U/mg，发酵条件为：温度20～40℃，湿度为50～70％，时间为7～14d。

使用本发明所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10150，β-葡聚糖酶或含有其的酶液，用来发酵烟叶，明显缩短了烟叶的发酵周期，烟叶的品质也有了明显的提升。

本发明以2018重庆B4F原烟作为对照组，以加入10⁶cfu/g的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10150作为处理组1，加入15U/mg制得的β-葡聚糖酶酶粉作为处理组2，来发酵烟叶，发酵的温度为35℃，湿度为55％，时间为10d，发酵后烟叶中各化学成分的变化如表1所示。

由表1可知，加入地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10150或β-葡聚糖酶后，烟叶中淀粉含量明显下降，烟叶中总糖含量增加，能够增加烟香，柔和烟气、增加烟气的爆发性，改善烟气品质。

表1各处理中烟叶的化学成分

以上所述，仅为本申请的实施例而已，本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。