阅读说明：本技术 纤维二糖水解酶变体和编码它们的多核苷酸 (Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same ) 是由 K·博尔奇 K·詹森 K·克罗赫 B·麦克布拉耶 P·韦斯特 J·卡尔 J·奥尔森 T 于 2014-03-07 设计创作，主要内容包括：本发明涉及纤维二糖水解酶变体和编码它们的多核苷酸。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。(The present invention relates to cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding them. The invention also relates to polynucleotides encoding these variants; nucleic acid constructs, vectors, and host cells comprising the polynucleotides; and methods of using these variants.)

具体实施方式

中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述酸中的两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐，或前述酸中的两种或更多种的混合物。

在一个方面中，该组合物包含一种或多种有机酸，并且任选地进一步包含杀死的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀死的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。

这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含一种防腐剂和/或抗微生物(例如抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域中已知的其他试剂。

这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含多种酶活性，如选自由以下各项组成的组的一种或多种(例如，若干种)酶：纤维素酶、半纤维素酶、过氧化氢酶、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶以及膨胀蛋白。这些发酵液配制品或细胞组合物还可以包括选自下组的一种或多种(例如，若干种)酶，该组由以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如，α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变位酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白分解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。

该细胞杀灭的全培养液或组合物可以包含在发酵终止时得到的发酵物质的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成(例如，纤维素酶和/或一种或多种葡糖苷酶的表达)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物含有耗尽的细胞培养基、胞外酶、和杀死的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。

在此描述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶组分，例如杀死的细胞、细胞碎片、培养基组分、和或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以除去不溶性组分以提供澄清的液体组合物。

可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673所述的方法产生本发明的全培养液配制品和细胞组合物。

下文中给出本发明的组合物的优选用途的实例。可以基于本领域已知的方法来确定组合物的剂量和使用该组合物的其他条件。

酶组合物

本发明还涉及包含本发明的一种变体的组合物。优选地，这些组合物富含这种变体。术语“富含”指示该组合物的纤维二糖水解酶活性已经增加，例如，富集因子为至少1.1。

这些组合物可以包括本发明的一种变体作为主要酶组分，例如一种单组分组合物。可替代地，这些组合物可以包括多种酶活性，例如选自下组的一种或多种(如，若干种)酶，该组由以下各项组成：纤维素酶、半纤维素酶、具有增强纤维素分解活性的GH61多肽、过氧化氢酶、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶以及膨胀蛋白。这些组合物还可以包括选自下组的一种或多种(例如，若干种)酶，该组由以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如，α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变位酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白分解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。这些组合物可根据本领域已知的方法制备并且可以是液体或干燥组合物的形式。可以根据本领域中已知的方法稳定这些组合物。

下文中给出本发明的组合物的优选用途的实例。可以基于本领域已知的方法来确定组合物的剂量和使用该组合物的其他条件。

用途

本发明还针对使用本发明的具有纤维二糖水解酶I活性的变体或其组合物的以下方法。

本发明还涉及用于降解纤维素材料的方法，这些方法包括：在本发明的纤维二糖水解酶变体的存在下，用一种酶组合物处理该纤维素材料。在一个方面中，这些方法进一步包括回收该降解的纤维素材料。可以使用本领域已知的方法将该纤维素材料的降解的可溶性产物与不溶性纤维素材料分开，这些方法是例如像离心、过滤或重力沉降。

本发明还涉及产生发酵产物的方法，这些方法包括：(a)在本发明的纤维二糖水解酶变体的存在下，用一种酶组合物糖化一种纤维素材料；(b)用一种或多种(例如，若干种)发酵微生物发酵该糖化的纤维素材料，以产生该发酵产物；并且(c)从发酵中回收该发酵产物。

本发明还涉及发酵纤维素材料的方法，这些方法包括：用一种或多种(例如，若干种)发酵微生物发酵该纤维素材料，其中在本发明的纤维二糖水解酶变体的存在下，用一种酶组合物糖化该纤维素材料。在一个方面中，发酵纤维素材料产生发酵产物。在另一个方面中，这些方法进一步包括从发酵中回收该发酵产物。

本发明的方法可以用于将纤维素材料糖化为可发酵糖，并且将可发酵糖转化为多种有用的发酵产物，例如燃料(乙醇、正丁醇、异丁醇、生物柴油、喷气燃料)和/或平台化合物(例如酸、醇、酮、气体、油等)。由该纤维素材料产生所希望的发酵产物典型地涉及预处理、酶水解(糖化)、以及发酵。

根据本发明的纤维素材料的加工可以使用本领域常规的方法来完成。此外，本发明的方法可以使用被配置成根据本发明来操作的任何常规生物质加工设备来实施。

分开或同时的水解(糖化)和发酵包括但不限于：分开水解和发酵(SHF)、同时糖化和发酵(SSF)、同时糖化和共发酵(SSCF)、杂合的水解和发酵(HHF)、分开水解和共发酵(SHCF)、杂合的水解和共发酵(HHCF)，以及直接微生物转化(DMC)，有时还被称为合并的生物加工(CBP)。SHF使用分开的处理步骤，以首先将纤维素材料酶促水解为可发酵糖(例如，葡萄糖、纤维二糖、以及戊糖单体)，并且然后将可发酵糖发酵为乙醇。在SSF中，纤维素材料的酶水解和糖发酵成乙醇被组合在一个步骤中(菲利皮迪斯·G.P.(Philippidis,G.P.)，1996，纤维素生物转化技术(Cellulose bioconversion technology)，生物乙醇手册：生产和利用(Handbook on Bioethanol:Production and Utilization)，怀曼·C.E(Wyman,C.E.)编辑，泰勒-弗朗西斯出版集团(Taylor&Francis)，华盛顿特区(Washington,DC)，179-212))。SSCF涉及多种糖的共发酵(希恩(Sheehan)和希默尔(Himmel)，1999，生物技术进展(Biotechnol.Prog.)15:817-827)。HHF涉及一个分开的水解步骤，并且另外涉及一个同时糖化和水解步骤，这些步骤可以在同一反应器中进行。HHF过程中的步骤可以在不同的温度下进行，即高温酶糖化，接着在发酵菌株能够耐受的更低温度下进行SSF。DMC在一个或多个(例如，若干个)步骤中合并了所有的三个过程(酶生产、水解、和发酵)，其中使用相同的生物生产用于将纤维素材料转化为可发酵糖的酶并且用于将可发酵糖转化为终产物的酶(林德(Lynd)等人，2002，微生物学与分子生物学评论(Microbiol.Mol.Biol.Reviews)66:506-577)。在此应理解的是，本领域中已知的包括预处理、酶水解(糖化)、发酵、或其组合的任何方法，可以用于实施本发明的方法。

常规的装置可以包括一个分批补料搅拌反应器、一个批式搅拌反应器、一个具有超滤作用的连续流搅拌反应器、和/或一个连续活塞流柱式反应器(continuous plug-flowcolumn reactor)(德卡斯特胡斯克拉兹(de Castilhos Corazza)等人，2003，技术学报(Acta Scientiarum.Technology)25:33-38；古萨考瓦(Gusakov)和斯尼特森(Sinitsyn)，1985，酶学与微生物学技术(Enz.Microb.Technol.)7:346-352)、一个碾磨反应器(刘(Ryu)和李(Lee)，1983，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)25:53-65)。另外的反应器类型包括：用于水解和/或发酵的流化床反应器、升流层(upflow blanket)反应器、固定化反应器、以及挤出机型反应器。

预处理。在实践本发明的方法中，可以使用本领域中已知的任何预处理工艺来破坏纤维素材料的植物细胞壁组分(钱德拉(Chandra)等人，2007，生化工程/生物技术进展(Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.)108:67-93；盖尔贝(Galbe)和赛琪(Zacchi)，2007，生化工程/生物技术进展，108:41-65；亨德里克斯(Hendriks)和塞曼(Zeeman)，2009，生物资源技术(Bioresource Technol.)100:10-18；马塞尔(Mosier)等人，2005，生物资源技术96:673-686；泰和拉德(Taherzadeh)和卡里米(Karimi)，2008，分子科学国际杂志(Int.J.ofMol.Sci.)9:1621-1651；杨(Yang)和怀曼(Wyman)，2008，生物燃料，生物产品和生物精制Biofpr.(Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr.)2:26-40)。

纤维素材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行粒度减小、筛分、预浸泡、润湿、洗涤和/或调理。

常规预处理包括但不限于：蒸汽预处理(伴随或不伴随***)、稀酸预处理、热水预处理、碱预处理、石灰预处理、湿氧化、湿***、氨纤维***、有机溶剂预处理、以及生物预处理。另外的预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO₂、超临界H₂O、臭氧、离子液体以及γ辐射预处理。

可以在水解和/或发酵之前对纤维素材料进行预处理。优选在水解前进行预处理。可替代地，可以同时用酶水解进行预处理，以释放可发酵糖，例如葡萄糖、木糖、和/或纤维二糖。在多数情况下，预处理步骤自身导致将生物质转化为可发酵糖(即使在没有酶的情况下)。

蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏植物细胞壁成分，包括木质素、半纤维素、以及纤维素，以使纤维素和其他级分，例如，半纤维素可接近酶。纤维素材料经过或穿过反应容器，将蒸汽注入该反应容器以增加温度至所需温度和压力，并且将蒸汽保持在其中持续希望的反应时间。优选在140℃-250℃，例如160℃-200℃或170℃-190℃进行蒸汽预处理，其中最佳温度范围取决于化学催化剂的任选添加。蒸汽预处理的停留时间优选是1-60分钟，例如1-30分钟、1-20分钟、3-12分钟、或4-10分钟，其中最适停留时间取决于温度和化学催化剂的任选添加。蒸汽预处理允许相对较高的固体加载量，这样使得纤维素材料在预处理过程中通常仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后的材料的***放料组合，这被称为蒸汽***，即，快速闪变至大气压和材料湍流，以通过破碎增加可及的表面积(达夫(Duff)和默里(Murray)，1996，生物资源技术(Bioresource Technology)855:1-33；盖博(Galbe)和小林(Zacchi)，2002，应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)59:618-628；美国专利申请号2002/0164730)。在蒸汽预处理过程中，半纤维素乙酰基被裂解，并且所得到的酸自催化半纤维素部分水解成单糖和寡糖。仅在有限的程度上去除木质素。

化学预处理：术语“化学处理”是指促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放的任何化学预处理。这种预处理可以将结晶纤维素转化为无定形纤维素。适合的化学预处理工艺的实例包括例如稀酸预处理、石灰预处理、湿法氧化、氨纤维/冷冻膨胀(AFEX)、氨渗滤(APR)、离子液体、以及有机溶剂预处理。

有时在蒸汽预处理之前添加一种化学催化剂(例如H₂SO₄或SO₂)(典型地是0.3至5％w/w)，该催化剂减少时间并降低温度、增加回收率、并改进酶水解(巴列斯特罗斯(Ballesteros)等人，2006，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)129-132:496-508；瓦尔加(Varga)等人，2004，应用生物化学与生物技术113-116:509-523；塞斯尼尔(Sassner)等人，2006，酶与微生物技术(Enzyme Microb.Technol.)39:756-762)。在稀酸预处理中，纤维素材料与稀酸(典型地是H₂SO₄)和水混合，以形成浆料，由蒸汽加热至希望的温度，并且在停留时间后闪变至大气压。可采用多种反应器设计来进行稀酸预处理，例如活塞流反应器、逆流反应器或连续逆流收缩床反应器(达夫(Duff)和默里(Murray)，1996，见上文；谢尔(Schell)等人，2004，生物资源技术(Bioresource Technology)91:179-188；李(Lee)等人，1999，生物化学工程/生物技术进展(Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.)65:93-115)。

还可以使用在碱性条件下的若干种预处理方法。这些碱性预处理包括但不限于：氢氧化钠、石灰、湿氧化、氨渗滤(APR)、以及氨纤维/冷冻膨胀(AFEX)预处理。

用氧化钙或氢氧化钙，在85℃-150℃的温度下进行石灰预处理，并且停留时间为从1小时到几天(怀曼(Wyman)等人，2005，生物资源技术(Bioresource Technol.)96:1959-1966；马塞尔(Mosier)等人，2005，生物资源技术96:673-686)。WO 2006/110891、WO 2006/110899、WO 2006/110900以及WO 2006/110901披露了使用氨的预处理方法。

湿氧化是一种热预处理，其典型地在添加氧化剂(如过氧化氢或过压氧)的情况下在180℃-200℃下持续5-15分钟进行(施密特(Schmidt)和汤姆森(Thomsen)，1998，生物资源技术(Bioresource Technol.)64:139-151；帕罗内(Palonen)等人，2004，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)117:1-17；瓦尔加等人，2004，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)88:567-574；马丁(Martin)等人，2006，化学技术与生物技术杂志(J.Chem.Technol.Biotechnol.)81:1669-1677)。优选在1％-40％干物质，例如2％-30％干物质或5％-20％干物质进行预处理，并且通常通过添加碱，例如碳酸钠提高初始pH。

被称为湿***(湿氧化和蒸汽***的组合)的湿氧化预处理方法的修改方案能够处理高达30％的干物质。在湿***中，在某一停留时间后，在预处理期间引入氧化剂(oxidizing agent)。然后通过急骤蒸发至大气压结束预处理(WO 2006/03228)。

氨纤维膨胀(AFEX)涉及在如90℃-150℃的中等温度和如17至20巴的高压下，用液体或气态氨处理纤维素材料5至10分钟，其中干物质含量可以高达60％(格拉帕里(Gollapalli)等人，2002，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)98:23-35；俊达瓦特(Chundawat)等人，2007，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)96:219-231；阿里扎德(Alizadeh)等人，2005，应用生物化学与生物技术121:1133-1141；泰莫里(Teymouri)等人，2005，生物资源技术(Bioresource Technology)96:2014-2018)。在AFEX预处理过程中，纤维素和半纤维素保持相对完整。木质素-碳水化合物复合物被裂解。

有机溶剂预处理通过使用含水乙醇(40％-60％乙醇)在160℃-200℃下萃取30-60分钟而将纤维素材料脱木质素(潘(Pan)等人，2005，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)90:473-481；潘等人，2006，生物技术与生物工程94:851-861；库拉比(Kurabi)等人，2005，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)121:219-230)。通常加入硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，大部分半纤维素和木质素被去除。

适合的预处理方法的其他实例由谢尔(Schell)等人，2003，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)105-108:69-85，和马塞尔(Mosier)等人，2005，生物资源技术(Bioresource Technology)96:673-686，以及美国专利申请2002/0164730进行描述。

在一个方面中，化学预处理优选作为稀酸处理，并且更优选作为连续稀酸处理进行。酸通常是硫酸，但也可以使用其他酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢、或其混合物。弱酸处理优选在1至5，例如1至4或1至2.5的pH范围中进行。在一个方面中，酸浓度优选处于从0.01wt.％至10wt.％酸，例如0.05wt.％至5wt.％酸或0.1wt.％至2wt.％酸的范围内。使酸与纤维素材料相接触，并且保持在优选140℃-200℃，例如165℃-190℃范围内的温度下，持续从1至60分钟范围内的时间。

在另一个方面中，预处理在水性浆料中进行。在优选方面中，在预处理过程中纤维素材料以优选在10wt％-80wt％之间，如20wt％-70wt％或30wt％-60wt％，如大约40wt％的量存在。预处理的纤维素材料可以不洗涤或使用本领域已知的任何方法洗涤，例如，用水洗涤。

机械预处理或物理预处理：术语“机械预处理”或“物理预处理”是指促进颗粒粒度减小的任何预处理。例如，这种预处理可以涉及各种类型的研磨或碾磨(例如，干磨、湿磨、或振动球磨)。

纤维素材料可以物理地(机械地)且化学地预处理。机械或物理预处理可以与以下相结合：蒸汽/蒸汽***、水热解(hydrothermolysis)、稀酸或弱酸处理、高温、高压处理、辐射(例如微波福射)或其组合。在一个方面中，高压意指在优选约100至约400psi，例如约150至约250psi范围中的压力。在另一个方面中，高温意指在约100℃至约300℃，例如约140℃至约200℃范围内的温度。在一个优选方面中，机械或物理预处理在分批过程中使用蒸***水解器系统，例如从顺智公司(Sunds Defibrator AB)，瑞典可获得的顺智水解器(SundsHydrolyzer)来进行，该系统使用如上所定义的高压和高温。这些物理预处理和化学预处理可以根据需要顺序地进行或同时进行。

因此，在一个优选方面中，使纤维素材料经受物理(机械)或化学预处理、或其任何组合，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。

生物预处理：术语“生物预处理”是指促进纤维素、半纤维素、和/或木质素从纤维素材料中分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以涉及应用溶解木质素的微生物和/或酶(参见，例如，舒·T.-A.(Hsu,T.-A.)，1996，生物质的预处理(Pretreatmentof biomass)，生物乙醇手册：生产和利用(Handbook on Bioethanol:Production andUtilization)，怀曼C.E.(Wyman,C.E.)编辑，泰勒-弗朗西斯出版集团，华盛顿特区，179-212；高希(Ghosh)和辛格(Singh)，1993，应用微生物学进展(Adv.Appl.Microbiol.)39:295-333；麦克米兰·J.D.(McMillan,J.D.)，1994，预处理木质纤维素生物质：综述(Pretreating lignocellulosic biomass:a review)，用于燃料生产的生物质的酶转化(Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production)，希默尔·M.E.(Himmel,M.E.)、贝克·J.O.(Baker,J.O.)、以及奥弗伦·R.P.(Overend,R.P.)编辑，美国化学学会讨论会系列566(ACS Symposium Series 566)，美国化学学会(American ChemicalSociety)，华盛顿特区，第15章；贡·C.S.(Gong,C.S.)、卡奥·N.J.(Cao,N.J.)、杜·J.(Du,J.)、以及曹·G.T.(Tsao,G.T.)，1999，由可再生资源生产乙醇(Ethanol productionfrom renewable resources)，生物化学工程/生物技术的进展(Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology)，舍佩尔·T.(Scheper,T.)编辑，施普林格出版社(Springer-Verlag)，柏林，海德堡，德国，65:207-241)；奥尔森(Olsson)和哈恩-哈格达尔(Hahn-Hagerdal)，1996，酶与微生物技术(Enz.Microb.Tech.)18:312-331；以及瓦蓝德(Vallander)和埃里克松(Eriksson)，1990，生物化学工程/生物技术的进展42:63-95)。

糖化。在水解步骤(还称为糖化)中，将(例如预处理的)纤维素材料水解，以将纤维素和/或半纤维素分解成可发酵糖，如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、***糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶性寡糖。水解由酶组合物在本发明的纤维二糖水解酶变体的存在下酶促进行。这些组合物的酶可以同时或依次添加。

酶水解优选在易于由本领域技术人员确定的条件下，在合适的含水环境中执行。在一个方面中，水解在适合于一种或多种酶的活性，即对于该一种或多种酶来说最佳的条件下进行。水解可以作为进料分批过程或连续过程进行，其中将纤维素材料逐渐进料至例如含酶的水解溶液中。

糖化通常在受控的pH、温度以及混合条件下在搅拌釜反应器或发酵罐中进行。适合的处理时间、温度以及pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，糖化可以持续长达200小时，但是典型地进行优选约12至约120小时，例如约16至约72小时或约24至约48小时。温度优选在约25℃至约70℃，例如约30℃至约65℃、约40℃至约60℃、或约50℃至55℃的范围内。pH优选在约3至约8，例如约3.5至约7、约4至约6、或约4.5至约5.5的范围内。干固体含量优选在约5wt％至约50wt％，例如约10wt％至约40wt％或约20wt％至约30wt％的范围内。

这些酶组合物可以包含有用于降解纤维素材料的任何蛋白。

在一个方面中，该酶组合物包括或进一步包括选自下组的一种或多种(如，若干种)蛋白质，该组由以下各项组成：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、木质素分解酶、氧化还原酶、果胶酶、蛋白酶以及膨胀蛋白。在另一方面中，该纤维素酶优选是选自下组的一种或多种(例如，若干种)酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶以及β-葡糖苷酶。在另一个方面中，该半纤维素酶优选是选自下组的一种或多种(例如，若干种)酶，该组由以下各项组成：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、***聚糖酶、***呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶以及木糖苷酶。在另一个方面中，该氧化还原酶优选是选自下组的一种或多种(例如，若干种)酶，该组由以下各项组成：过氧化氢酶、漆酶以及过氧化物酶。

在另一个方面中，该酶组合物包括一种或多种(例如，若干种)纤维素分解酶。在另一个方面中，该酶组合物包括或进一步包括一种或多种(例如，若干种)半纤维素分解酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种或多种(例如，若干种)纤维素分解酶和一种或多种(例如，若干种)半纤维素分解酶。在另一个方面中，该酶组合物包括选自纤维素分解酶和半纤维素分解酶的组的一种或多种(例如，若干种)酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种内切葡聚糖酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种纤维二糖水解酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种β-葡糖苷酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。在另一个方面中，该酶组合物包括一种内切葡聚糖酶和一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。在另一个方面中，该酶组合物包括一种纤维二糖水解酶和一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。在另一个方面中，该酶组合物包括一种β-葡糖苷酶和一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。在另一个方面中，该酶组合物包括一种内切葡聚糖酶和一种纤维二糖水解酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种内切葡聚糖酶和一种纤维二糖水解酶I、一种纤维二糖水解酶II、或纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II的组合。在另一个方面中，该酶组合物包括一种内切葡聚糖酶和一种β-葡糖苷酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种β-葡糖苷酶和一种纤维二糖水解酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种β-葡糖苷酶和一种纤维二糖水解酶I、一种纤维二糖水解酶II、或纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II的组合。在另一个方面中，该酶组合物包括一种内切葡聚糖酶、一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽以及一种纤维二糖水解酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种内切葡聚糖酶、一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、以及一种纤维二糖水解酶I、一种纤维二糖水解酶II、或纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II的组合。在另一个方面中，该酶组合物包括一种内切葡聚糖酶、一种β-葡糖苷酶、以及一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。在另一个方面中，该酶组合物包括一种β-葡糖苷酶、一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、以及一种纤维二糖水解酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种β-葡糖苷酶、一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、以及一种纤维二糖水解酶I、一种纤维二糖水解酶II、或纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II的组合。在另一个方面中，该酶组合物包括一种内切葡聚糖酶、一种β-葡糖苷酶、以及一种纤维二糖水解酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种内切葡聚糖酶、一种β-葡糖苷酶、以及一种纤维二糖水解酶I、一种纤维二糖水解酶II、或纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II的组合。在另一个方面中，该酶组合物包括一种内切葡聚糖酶、一种纤维二糖水解酶、一种β-葡糖苷酶、以及一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。在另一个方面中，该酶组合物包括一种内切葡聚糖酶、一种β-葡糖苷酶、一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、以及一种纤维二糖水解酶I、一种纤维二糖水解酶II、或纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II的组合。

在另一个方面中，该酶组合物包括一种乙酰甘露聚糖酯酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种乙酰木聚糖酯酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种***聚糖酶(例如，α-L-***聚糖酶)。在另一个方面中，该酶组合物包括一种***呋喃糖苷酶(例如，α-L-***呋喃糖苷酶)。在另一个方面中，该酶组合物包括一种香豆酸酯酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种阿魏酸酯酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种半乳糖苷酶(例如，α-半乳糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶)。在另一个方面中，该酶组合物包括一种葡糖醛酸糖苷酶(例如，α-D-葡糖醛酸糖苷酶)。在另一个方面中，该酶组合物包括一种葡萄糖醛酸酯酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种甘露聚糖酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种甘露糖苷酶(例如，β-甘露糖苷酶)。在另一个方面中，该酶组合物包括一种木聚糖酶。在一个优选方面中，该木聚糖酶是一种家族10木聚糖酶。在另一个优选方面中，该木聚糖酶是一种家族11木聚糖酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种木糖苷酶(例如β-木糖苷酶)。

在另一个方面中，该酶组合物包括一种酯酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种棒曲霉素。在另一个方面中，该酶组合物包括一种木质素分解酶。在一个优选方面中，该木质素分解酶是一种锰过氧化物酶。在另一个优选方面中，该木质素分解酶是一种木质素过氧化物酶。在另一个优选方面中，该木质素分解酶是一种H₂O₂产生酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种果胶酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种氧化还原酶。在另一个优选方面中，该氧化还原酶是一种过氧化氢酶。在另一个优选方面中，该氧化还原酶是一种漆酶。在另一个优选方面中，该氧化还原酶是一种过氧化物酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种蛋白酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种膨胀蛋白。

在本发明的方法中，可以在糖化、糖化和发酵、或发酵之前或期间添加该一种或多种酶。

该酶组合物的一种或多种(例如，若干种)组分可以是天然蛋白、重组蛋白或天然蛋白与重组蛋白的组合。例如，一种或多种(例如，若干种)组分可以是用作宿主细胞以重组表达该酶组合物的一种或多种(例如，若干种)其他组分的细胞的天然蛋白。在此应理解的是，重组蛋白对于宿主细胞可以是异源的(例如，外源的)以及原生的。可以作为单组分生成酶组合物的一种或多种(例如若干种)组分，然后将它们组合以形成酶组合物。酶组合物可以是多组分和单组分蛋白制剂的组合。

在本发明的方法中使用的酶可以是以任何适于使用的形式存在的，例如像发酵液配制品或细胞组合物、具有或不具有细胞碎片的细胞裂解物、半纯化或纯化的酶制剂、或作为酶的来源的宿主细胞。该酶组合物可以是干粉或颗粒、非尘颗粒、液体、稳定化的液体或稳定化的受保护的酶。可以根据已建立的方法例如通过添加稳定剂(如糖、糖醇或其他多元醇)、和/或乳酸或另一种有机酸，对液体酶制剂进行稳定化。

酶和纤维二糖水解酶变体的最佳量取决于若干因素，包括但不限于：纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶组分的混合物、纤维素材料、纤维素材料的浓度、纤维素材料的一种或多种预处理、温度、时间、pH以及发酵生物(例如，用于同时糖化和发酵)的纳入。

在一个方面中，纤维素分解酶或半纤维素分解酶对纤维素材料的有效量是约0.5至约50mg，例如，约0.5至约40mg、约0.5至约25mg、约0.75至约20mg、约0.75至约15mg、约0.5至约10mg、或约2.5至约10mg/g纤维素材料。

在另一个方面中，纤维二糖水解酶变体对纤维素材料的有效量是约0.01至约50.0mg，例如，约0.01至约40mg、约0.01至约30mg、约0.01至约20mg、约0.01至约10mg、约0.01至约5mg、约0.025至约1.5mg、约0.05至约1.25mg、约0.075至约1.25mg、约0.1至约1.25mg、约0.15至约1.25mg、或约0.25至约1.0mg/g纤维素材料。

在另一个方面中，纤维二糖水解酶变体对纤维素分解酶或半纤维素分解酶的有效量是约0.005至约1.0g，例如，约0.01至约1.0g、约0.15至约0.75g、约0.15至约0.5g、约0.1至约0.5g、约0.1至约0.25g、或约0.05至约0.2g/g纤维素分解酶或半纤维素分解酶。

具有纤维素分解酶活性或半纤维素分解酶活性的多肽，以及适用于纤维素材料的降解的其他蛋白质/多肽，例如具有纤维素分解增强活性的GH61多肽(在下文统称为“具有酶活性的多肽”)可以源自或获自任何合适的来源，包括古细菌、细菌、真菌、酵母、植物或动物来源。术语“获得的”在此还意指该酶可能已在宿主生物中采用在此所描的方法重组产生，其中重组产生的酶对于宿主生物是原生的或外源的，或具有修饰的氨基酸序列，例如，具有一个或多个(例如，若干个)缺失、***和/或取代的氨基酸，即重组产生的酶为天然氨基酸序列的突变体和/或片段，或通过本领域已知的核酸改组方法产生的酶。原生酶的含义中涵盖天然变体，而外源酶的含义中涵盖如通过定点诱变或改组获得的变体。

具有酶活性的多肽可以是一种细菌多肽。例如，该多肽可以是具有酶活性的***多肽，例如芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳酸杆菌属、乳球菌属、梭菌属、土芽孢杆菌属、热解纤维素菌属、热酸菌属、热裂菌属(Thermobifidia)、或海洋芽孢杆菌属多肽，或具有酶活性的革兰氏阴性细菌多肽，例如大肠杆菌、假单孢菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、螺杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、或脲原体属多肽。

在一个方面中，该多肽是具有酶活性的嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌多肽。

在另一个方面中，该多肽是具有酶活性的似马链球菌、酿脓链球菌、***链球菌、或马链球菌兽疫亚种多肽。

在另一个方面中，该多肽是具有酶活性的不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、或浅青紫链霉菌多肽。

具有酶活性的多肽还可以是真菌多肽，并且更优选地是一种具有酶活性的酵母多肽，如假丝酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属多肽；或更优选地是一种具有酶活性的丝状真菌多肽，如枝顶孢霉属、伞菌属、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、Botryospaeria、拟蜡菌属、毛喙壳属、金孢子菌属、麦角菌属、旋孢腔菌属、鬼伞属、乳白蚁属、棒囊壳属、隐丛赤壳菌属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、线黑粉酵母属、镰孢属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙齿菌属、蘑燕属、小腔球菌属、梨孢菌属、黑果菌属(Melanocarpus)、多孔菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、瘤胃壶菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉菌属、裂褶菌属、柱顶孢属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、小包脚菇属、或炭角菌属多肽。

在一个方面中，该多肽是具有酶活性的卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酶母、或卵形酵母多肽。

在另一个方面中，该多肽是具有酶活性的解纤维枝顶孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌、热带金孢子菌、莫达瑞姆金孢子菌、狭边金孢子菌、租金孢子菌、昆士兰金孢子菌、带纹金孢子菌、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、灰腐质霉、特异腐质霉、柔毛腐质霉、白耙齿菌、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、绳状青霉菌、产紫青霉菌、黄孢平革菌、无色梭孢壳菌(Thielaviaachromatica)、阿波梭孢壳菌(Thielavia albomyces)、白毛梭孢壳菌(Thielaviaalbopilosa)、澳洲梭孢壳霉、菲美蒂梭孢壳菌(Thielavia fimeti)、小孢梭孢壳霉、卵孢梭孢壳霉、秘鲁梭孢壳霉(Thielavia peruviana)、瘤孢梭孢壳霉、毛梭孢壳霉、亚嗜热梭孢壳菌(Thielavia subthermophila)、土生梭孢霉、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、绿色木霉、或褐孢长毛盘菌多肽。

还可以使用具有酶活性的多肽的化学修饰的或蛋白工程化的突变体。

该酶组合物的一种或多种(例如，若干种)组分可以是重组组分，即，通过克隆编码该单一组分的DNA序列并且随后用该DNA序列转化细胞并且在宿主中表达产生(参见例如，WO 91/17243和WO 91/17244)。该宿主可以是异源宿主(酶对于宿主来说是外源的)，但该宿主在某些条件下也可以是同源宿主(酶对于宿主来说是原生的)。还可以通过纯化来自发酵液的这样一种蛋白来制备单组分纤维素分解蛋白。

在一个方面中，该一种或多种(例如，若干种)纤维素分解酶包括商业纤维素分解酶制剂。适用于本发明的商业纤维素分解酶制剂的实例包括例如：CTec(诺维信公司)、CTec2(诺维信公司)、CTec3(诺维信公司)、CELLUCLAST^TM(诺维信公司)、NOVOZYM^TM 188(诺维信公司)、SPEZYME^TM CP(杰能科国际(Genencor Int.))、ACCELLERASE^TM TRIO(杜邦公司(DuPont))、NL(DSM公司)；S/L 100(DSM公司)、ROHAMENT^TM 7069W(罗姆公司(GmbH))、或CMAX3^TM(Dyadic国际有限公司(Dyadic International,Inc.))。以从约0.001wt.％至约5.0wt.％的固体，例如0.025wt.％至约4.0wt.％的固体、或约0.005wt.％至约2.0wt.％的固体的有效量添加纤维素分解酶制剂。

可在本发明的方法中使用的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于：解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO 91/05039；WO 93/15186；美国专利申请号5,275,944；WO 96/02551；美国专利申请号5,536,655，WO 00/70031，WO 05/093050)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶(萨里拉赫蒂(Saarilahti)等人，1990，基因(Gene)90:9-14)、褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)内切葡聚糖酶III(WO 05/093050)、以及褐色嗜热裂孢菌内切葡聚糖酶V(WO 05/093050)。

可以用于本发明的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于：里氏木霉内切葡聚糖酶I(彭蒂莱(Penttila)等人，1986，基因(Gene)45:253-263，里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I(GenBank:M15665)、里氏木霉内切葡聚糖酶II(萨洛黑莫(Saloheimo)等人，1988，基因63:11-22)，里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II(GenBank:M19373)、里氏木霉内切葡聚糖酶III(奥卡达(Okada)等人，1988，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)64:555-563，GenBank:AB003694)、里氏木霉内切葡聚糖酶V(萨洛黑莫等人，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13:219-228，GenBank:Z33381)、棘孢曲霉内切葡聚糖酶(黄(Ooi)等人，1990，核酸研究(Nucleic Acids Research)18:5884)、白曲霉内切葡聚糖酶(坂元(Sakamoto)等人，1995，当代遗传学(Current Genetics)27:435-439)、尖镰孢内切葡聚糖酶(GenBank:L29381)、灰腐质霉高温变种(Humicola grisea var.thermoidea)内切葡聚糖酶(GenBank:AB003107)、热白丝菌(Melanocarpus albomyces)内切葡聚糖酶(GenBank:MAL515703)、粗糙脉孢菌内切葡聚糖酶(GenBank:XM_324477)、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、嗜热毁丝霉CBS 117.65内切葡聚糖酶、金黄色嗜热子囊菌内切葡聚糖酶I(GenBank:AF487830)、里氏木霉菌株号VTT-D-80133内切葡聚糖酶(GenBank:M15665)、以及嗜松青霉内切葡聚糖酶(WO 2012/062220)。

可用在本发明中的纤维二糖水解酶的实例包括但不限于：棘孢曲霉纤维二糖水解酶II(WO 2011/059740)、烟曲霉纤维二糖水解酶I(WO 2013/028928)、烟曲霉纤维二糖水解酶II(WO 2013/028928)、嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶I、嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II、特异腐质霉纤维二糖水解酶I、嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶II(WO 2009/042871)、奥斯塔尼青霉(Penicillium occitanis)纤维二糖水解酶I(GenBank:AY690482)、埃默森篮状菌纤维二糖水解酶I(GenBank:AF439936)、赫卡尼亚梭孢壳霉(Thielavia hyrcanie)纤维二糖水解酶II(WO 2010/141325)、土生梭孢霉纤维二糖水解酶II(CEL6A，WO 2006/074435)、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、以及褐孢长毛盘菌纤维二糖水解酶II(WO 2010/057086)。

可用在本发明中的β-葡糖苷酶的实例包括但不限于来自以下各项的β-葡糖苷酶：棘孢曲霉(川口(Kawaguchi)等人，1996，基因(Gene)173:287-288)、烟曲霉(WO 2005/047499)、黑曲霉(丹(Dan)等人，2000，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)275:4973-4980)、米曲霉(WO 02/095014)、巴西青霉菌IBT 20888(WO 2007/019442和WO 2010/088387)、土生梭孢霉(WO 2011/035029)、以及褐孢长毛盘菌(WO 2007/019442)。

该β-葡糖苷酶可以是一种融合蛋白。在一个方面中，该β-葡糖苷酶是米曲霉β-葡糖苷酶变体BG融合蛋白(WO 2008/057637)或米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)。

其他有用的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶披露于使用根据以下的分类的许多糖基水解酶家族中：亨利萨特(Henrissat)，1991，生物化学杂志(Biochem.J.)280:309-316；以及亨利萨特和贝洛赫(Bairoch)，1996，生物化学杂志316:695-696。

可以在本发明中使用的其他纤维素分解酶描述于WO 98/13465、WO 98/015619、WO98/015633、WO 99/06574、WO 99/10481、WO 99/025847、WO 99/031255、WO 2002/101078、WO2003/027306、WO 2003/052054、WO 2003/052055、WO 2003/052056、WO 2003/052057、WO2003/052118、WO 2004/016760、WO 2004/043980、WO 2004/048592、WO 2005/001065、WO2005/028636、WO 2005/093050、WO 2005/093073、WO 2006/074005、WO 2006/117432、WO2007/071818、WO 2007/071820、WO 2008/008070、WO 2008/008793、美国专利号5,457,046、美国专利号5,648,263、以及美国专利号5,686,593中。

在本发明的方法中，具有纤维素分解增强活性的任何GH61多肽都可以用作酶组合物的组分。

在本发明的方法中有用的GH61多肽的实例包括但不限于来自于以下各项的GH61多肽：土生梭孢霉(WO 2005/074647、WO 2008/148131和WO 2011/035027)、金黄色嗜热子囊菌(WO 2005/074656和WO 2010/065830)、里氏木霉(WO 2007/089290和WO 2012/149344)、嗜热毁丝霉(WO 2009/085935、WO 2009/085859、WO 2009/085864、WO 2009/085868及WO2009/033071)、烟曲霉(WO 2010/138754)、嗜松青霉(WO 2011/005867)、嗜热子嚢菌属(WO2011/039319)、青霉属(埃默森青霉)(WO 2011/041397和WO 2012/000892)、甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceous)(WO 2011/041504)、棘孢曲霉(WO 2012/125925)、疏棉状嗜热丝孢菌(WO 2012/113340、WO 2012/129699、WO 2012/130964及WO 2012/129699)、Aurantiporus alborubescens(WO 2012/122477)、褐孢长毛盘菌(WO 2012/122477)、托姆青霉(WO 2012/122477)、柄篮状菌(WO 2012/135659)、特异腐质霉(WO 2012/146171)、樟绒枝霉(WO 2012/101206)、Talaromyces leycettanus(WO 2012/101206)、以及嗜热毛壳菌(WO 2012/101206)和嗜热篮状菌(Talaromyces thermophilus)(WO 2012/129697和WO2012/130950)。

在一个方面中，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽在根据WO 2008/151043的可溶性活化二价金属阳离子(例如锰或铜)的存在下使用。

在另一个方面中，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽在二氧化合物、二环化合物、杂环化合物、含氮化合物、醌化合物、含硫化合物、或从预处理的纤维素材料(如预处理的玉米秸杆)获得的液体的存在下使用(WO 2012/021394、WO 2012/021395、WO 2012/021396、WO 2012/021399、WO 2012/021400、WO 2012/021401、WO 2012/021408、以及WO2012/021410)。

二氧基化合物可以包括包含两个或更多个氧原子的任何适合化合物。在一些方面中，二氧基化合物包含一个如在此所述的被取代的芳基部分。二氧基化合物可以包括一个或多个(例如，若干个)羟基和/或羟基衍生物，而且还包括缺乏羟基和羟基衍生物的取代的芳基部分。二氧基化合物的非限制性实例包括邻苯二酚或儿茶酚；咖啡酸；3,4-二羟基苯甲酸；4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯二醇；连苯三酚；没食子酸；3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯；2,3,4-三羟基二苯甲酮；2,6-二甲氧基苯酚；芥子酸；3,5-二羟基苯甲酸；4-氯-1,2-苯二醇；4-硝基-1,2-苯二醇；丹宁酸；没食子酸乙酯；羟乙酸甲酯；二羟基富马酸；2-丁炔-1,4-二醇；克酮酸；1,3-丙二醇；酒石酸；2,4-戊二醇；3-乙氧基-1,2-丙二醇；2,4,4'-三羟基二苯甲酮；顺-2-丁烯-1,4-二醇；3,4-二羟基-3-环丁烯-1,2-二酮；二羟基丙酮；丙烯醛缩醛；4-羟基苯甲酸甲酯；4-羟基苯甲酸；以及3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸甲酯；或其盐或溶剂化物。

双环化合物可以包括如在此所描述的任何适合的取代的稠合环系统。这些化合物可以包含一个或多个(例如，若干个)另外的环，并且除非另外说明，否则不限于具体数目的环。在一个方面中，双环化合物是一种类黄酮。在另一方面中，双环化合物是一种任选取代的异类黄酮。在另一个方面中，双环化合物是一种任选取代的花色离子(flavylium ion)，如一种任选取代的花色素或任选取代的花色素苷、或其衍生物。双环化合物的非限制性实例包括：表儿茶素、槲皮素、杨梅黄酮、紫衫叶素、堪非醇、桑色素、刺槐素、柚皮素、异鼠李素、芹黄素、矢车菊素、矢车菊素苷、黑豆多酚、花青素鼠李葡糖苷、或其盐或溶剂合物。

杂环化合物可以是如在此所描述的任何适合的化合物，如包含一个杂原子的一种任选取代的芳香族或非芳香族环。在一个方面中，杂环是包含一个任选地被取代的杂环烷基部分或一个任选地被取代的杂芳基部分的一种化合物。在另一个方面中，任选地被取代的杂环烷基部分或任选地被取代的杂芳基部分是一个任选地被取代的5元杂环烷基或一个任选地被取代的5元杂芳基部分。在另一个方面中，任选地被取代的杂环烷基或任选地被取代的杂芳基部分是一个选自以下的任选地被取代的部分：吡唑基、呋喃基、咪唑基、异噁唑基、噁二唑基、噁唑基、吡咯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、噻唑基、***基、噻吩基、二氢噻吩并吡唑基、硫茚基、咔唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并***基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、异喹啉基、异吲哚基、吖啶基、苯并异唑基、二甲基乙内酰脲、吡嗪基、四氢呋喃基、吡咯啉基、吡咯烷基、吗啉基、吲哚基、二氮杂卓基、氮杂卓基、硫杂卓基、哌啶基以及氧杂卓基。在另一个方面中，任选地被取代的杂环烷基部分或任选地被取代的杂芳基部分是一个任选地被取代的呋喃基。杂环化合物的非限制性实例包括(1,2-二羟基乙基)-3,4-二羟基呋喃-2(5H)-酮；4-羟基-5-甲基-3-呋喃酮；5-羟基-2(5H)-呋喃酮；[1,2-二羟基乙基]呋喃-2,3,4(5H)-三酮；α-羟基-γ-丁内酯；核糖酸γ-内酯；己糖醛酸(aldohexuronicaldohexuronic acid)γ-内酯；葡萄糖酸δ-内酯；4-羟基香豆素；二氢苯并呋喃；5-(羟基甲基)糠醛；联糠醛；2(5H)-呋喃酮；5,6-二氢-2H-吡喃-2-酮；以及5,6-二氢-4-羟基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮；或其盐或溶剂化物。

含氮化合物可以是具有一个或多个氮原子的任何适合化合物。在一个方面中，含氮化合物包含一个胺、亚胺、羟胺或氮氧化物部分。含氮化合物的非限制性实例包括丙酮肟；紫尿酸；吡啶-2-醛肟；2-氨基苯酚；1,2-苯二胺；2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基；5,6,7,8-四氢生物蝶呤；6,7-二甲基-5,6,7,8-四氢蝶呤；以及顺丁烯酰胺酸；或其盐或溶剂化物。

醌化合物可以是如在此所描述的包含一个醌部分的任何适合的化合物。醌化合物的非限制性实例包括：1,4-苯醌、1,4-萘醌、2-羟基-1,4-萘醌、2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌或辅酶Q₀、2,3,5,6-四甲基-1,4-苯醌或杜醌、1,4-二羟基蒽醌、3-羟基-1-甲基-5,6-二氢吲哚二酮或肾上腺素红、4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌、吡咯并喹啉醌、或其盐或溶剂化物。

含硫化合物可以是包含一个或多个硫原子的任何适合的化合物。在一个方面中，含硫化合物包含一个选自以下各项的部分：亚硫酰基、硫醚、亚磺酰基、磺酰基、硫酰胺、磺酰胺、磺酸以及磺酸酯。含硫化合物的非限制性实例包括乙硫醇；2-丙硫醇；2-丙烯-1-硫醇；2-巯基乙磺酸；苯硫酚；苯-1,2-二硫酚；半胱氨酸；蛋氨酸；谷胱甘肽；胱氨酸；或其盐或溶剂化物。

在一个方面中，以上述这样一种化合物对纤维素的葡糖基单元的以下摩尔比将有效量的该化合物添加至纤维素材料中：约10^-6至约10，例如，约10^-6至约7.5、约10^-6至约5、约10^-6至约2.5、约10^-6至约1、约10^-5至约1、约10^-5至约10^-1、约10^-4至约10^-1、约10^-3至约10^-1、或约10^-3至约10^-2。在另一个方面中，这样一种化合物的有效量是约0.1μM至约1M，例如约0.5μM至约0.75M、约0.75μM至约0.5M、约1μM至约0.25M、约1μM至约0.1M、约5μM至约50mM、约10μM至约25mM、约50μM至约25mM、约10μM至约10mM、约5μM至约5mM、或约0.1mM至约1mM。

术语“液体(liquor)”意指在如描述于WO 2012/021401中的条件下，由处理浆料中的木质纤维素和/或半纤维素材料、或其单糖(例如，木糖、***糖、甘露糖等)所产生的溶液相(水相、有机相或其组合)、及其可溶性内容物。用于GH61多肽的纤维素分解增强的液剂可以通过，任选在催化剂(例如酸)的存在下、任选在有机溶剂的存在下、并且任选与物理破坏一种木质纤维素或半纤维素材料(或原料)组合，通过施加热和/或压力来对该材料进行处理，并且然后将溶液与残余固体分离来产生。在由纤维素分解酶制剂对纤维素底物的水解过程中，从液体与GH61多肽的组合中可得到纤维素分解增强的程度是由这类条件决定的。可以使用本领域的标准方法，如过滤、沉淀或离心，而将液剂与经过处理的材料进行分离。

在一个方面中，该液体对纤维素的有效量是约10^-6至约10g/g的纤维素，例如约10^-6至约7.5g、约10^-6至约5g、约10^-6至约2.5g、约10^-6至约1g、约10^-5至约1g、约10^-5至约10^-1g、约10^-4至约10^-1g、约10^-3至约10^-1g、或约10^-3至约10^-2g/g的纤维素。

在一个方面中，该一种或多种(例如，若干种)半纤维素分解酶包含商业半纤维素分解酶制剂。适于在本发明中使用的商业化半纤维素分解酶制剂的实例包括例如SHEARZYME^TM(诺维信公司)、HTec(诺维信公司)、HTec2(诺维信公司)、HTec3(诺维信公司)、(诺维信公司)、(诺维信公司)、HC(诺维信公司)、木聚糖酶(杰能科公司)、XY(杰能科公司)、XC(杰能科公司)、TX-200A(AB酶公司(AB Enzymes))、HSP 6000木聚糖酶(DSM)、DEPOL^TM 333P(生物催化剂有限公司(Biocatalysts Limit)，威尔士，英国)、DEPOL^TM 740L(生物催化剂有限公司，威尔士，英国)以及DEPOL^TM 762P(生物催化剂有限公司，威尔士，英国)、ALTERNAFUEL 100P(Dyadic公司)和ALTERNA FUEL 200P(Dyadic公司)。

在本发明的方法中有用的木聚糖酶的实例包括但不限于来自以下各项的木聚糖酶：棘孢曲霉(GeneSeqP：AAR63790；WO 94/21785)、烟曲霉(WO 2006/078256)、嗜松青霉(WO2011/041405)、青霉属(WO 2010/126772)、疏棉状嗜热丝孢菌(GeneSeqP：BAA22485)、嗜热篮状菌(GeneSeqP：BAA22834)、土生梭孢霉NRRL 8126(WO 2009/079210)、以及褐孢长毛盘菌(WO 2011/057083)。

在本发明的方法中有用的β-木糖苷酶包括但不限于来自以下各项的β-木糖苷酶：粗糙脉孢菌(SwissProt:Q7SOW4)、里氏木霉(UniProtKB/TrEMBL:Q92458)、埃默森篮状菌(SwissProt:Q8X212)、以及嗜热篮状菌(GeneSeqP:BAA22816)。

在本发明的方法中有用的乙酰木聚糖酯酶的实例包括但不限于来自以下各项的乙酰木聚糖酯酶：棘孢曲霉(WO 2010/108918)，球毛壳菌(UniProt:Q2GWX4)，细丽毛壳(Chaetomium gracile)(GeneSeqP:AAB82124)，特异腐质霉DSM 1800(WO 2009/073709)，红褐肉座菌(WO 2005/001036)，嗜热毁丝菌(Myceliophtera thermophila)(WO 2010/014880)，粗糙脉孢菌(UniProt:q7s259)，颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)(UniProt:Q0UHJ1)，以及土生梭孢霉NRRL 8126(WO 2009/042846)。

在本发明的方法中有用的阿魏酸酯酶(feruloyl esterase，ferulic acidesterase)的实例包括但不限于来自以下的阿魏酸酯酶：特异腐质霉DSM 1800(WO 2009/076122)，费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)(UniProt:A1D9T4)，粗糙脉孢菌(UniProt:Q9HGR3)，黄灰青霉(Penicillium aurantiogriseum)(WO 2009/127729)，以及土生梭孢霉(WO 2010/053838和WO 2010/065448)。

在本发明的方法中有用的***呋喃糖苷酶的实例包括但不限于来自以下的***呋喃糖苷酶：黑曲霉(GeneSeqP:AAR94170)、特异腐质霉DSM 1800(WO 2006/114094和WO 2009/073383)、以及大型亚灰树花菌(M.giganteus)(WO 2006/114094)。

在本发明的方法中有用的α-葡糖醛酸糖苷酶的实例包括但不限于来自以下的α-葡糖醛酸糖苷酶：棒曲霉(UniProt:alcc12)、烟曲霉(SwissProt:Q4WW45)、黑曲霉(UniProt:Q96WX9)、土曲霉(SwissProt:Q0CJP9)、特异腐质霉(WO 2010/014706)、黄灰青霉(WO 2009/068565)、埃默森篮状菌(UniProt:Q8X211)、以及里氏木霉(UniProt:Q99024)。

在本发明的方法中有用的氧化还原酶的实例包括但不限于：烟曲霉过氧化氢酶、Aspergillus lentilus过氧化氢酶、黑曲霉过氧化氢酶、米曲霉过氧化氢酶、特异腐质霉过氧化氢酶、粗糙脉孢菌过氧化氢酶、埃默森青霉过氧化氢酶、嗜热色串孢(Scytalidiumthermophilum)过氧化氢酶、柄篮状菌过氧化氢酶、金黄色嗜热子囊菌过氧化氢酶、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)漆酶、嗜热毁丝霉漆酶、Polyporus pinsitus漆酶、鲜红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)漆酶、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)漆酶、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)漆酶、灰盖鬼伞过氧化物酶、大豆过氧化物酶、以及王棕(Royal palm)过氧化物酶。

用于本发明的方法中的具有酶活性的多肽可以通过在含有适合碳源和氮源以及无机盐的营养培养基上，使用本领域中已知的程序发酵上述微生物菌株来产生(参见，例如，班尼特，J.W.(Bennett,J.W.)和拉热，L.(LaSure,L.)(编辑)，真菌中的更多基因操纵(More Gene Manipulations in Fungi)，学术出版社，加州，1991)。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。适合于生长和酶产生的温度范围和其他条件在本领域中是已知的(参见，例如，贝利·J.E.(Bailey,J.E.)和奥利斯·D.F.(Ollis,D.F.)，生物化学工程基础(BiochemicalEngineering Fundamentals)，麦格劳-希尔图书公司(McGraw-Hill Book Company)，纽约，1986)。

发酵可以是导致酶或蛋白质的表达或分离的培养细胞的任何方法。所以，可以将发酵理解为包括摇瓶培养，或者在一种适合的培养基中并且在允许表达或分离该酶的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批补料发酵或固态发酵)。通过上述方法产生的所得酶可以从发酵培养基回收并且通过常规程序纯化。

发酵。可以通过能够将糖直接或间接发酵成所希望的发酵产物的一种或多种(例如，若干种)发酵微生物发酵从水解的纤维素材料获得的可发酵糖。“发酵”或“发酵过程”是指任何发酵过程或包括发酵步骤的任何过程。发酵方法还包括用于消费性醇工业(例如啤酒和葡萄酒)、乳品工业(例如发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的发酵方法。发酵条件取决于所希望的发酵产物和发酵生物，并且可以由本领域的普通技术人员容易地确定。

在发酵步骤中，预处理和酶水解步骤所导致的从纤维素材料释放的糖由发酵生物(如酵母)发酵成一种产物，例如，乙醇。水解(糖化)和发酵可以是分开的或同时的。

在实践本发明的发酵步骤中可以使用任何适合的水解的纤维素材料。该材料一般是基于经济学，即，每当量糖势的成本，以及对酶致转变的难降解性而进行选择。

术语“发酵培养基”在此可理解为指在添加一种或多种发酵微生物之前的培养基，如，由糖化过程产生的培养基，以及在同时糖化和发酵过程(SSF)中使用的培养基。

“发酵微生物”是指适用于所希望的发酵方法以产生发酵产物的任何微生物，包括细菌和真菌生物。发酵生物可以是己糖和/或戊糖发酵生物、或其组合。己糖和戊糖发酵生物二者均是本领域中所熟知的。适合的发酵微生物能够将糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、***糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、和/或寡糖)直接或间接地发酵(即，转化)成所希望的发酵产物。产生乙醇的细菌和真菌发酵生物的实例由琳(Lin)等人，2006，应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)69:627-642描述。

能够发酵己糖的发酵微生物的实例包括细菌生物和真菌生物，如酵母。酵母包括以下各项的菌株：假丝酵母属、克鲁维酵母属、以及酵母菌属，例如萨纳瑞西斯假丝酵母(Candida sonorensis)、马克斯克鲁维酵母、以及酿酒酵母。

可以发酵处于其原生状态的戊糖的发酵微生物的实例包括细菌和真菌生物，如某一种酵母。发酵木糖的酵母包括假丝酵母属的菌株，优选是休哈塔假丝酵母(C.sheatae)或萨纳瑞西斯假丝酵母(C.sonorensis)；以及毕赤酵母属的菌株，例如是树干毕赤酵母，像树干毕赤酵母CBS 5773。发酵戊糖的酵母包括管囊酵母属的菌株，优选是嗜鞣管囊酵母(P.tannophilus)。不能发酵戊糖(如木糖和***糖)的生物可以通过本领域已知方法来进行遗传修饰而发酵戊糖。

能够有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌的实例包括，例如，凝结芽孢杆菌、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)、发酵植物多糖梭菌(Clostridium phytofermentans)、土芽孢杆菌属、解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter saccharolyticum)、以及运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)(菲利皮迪斯，G.P.(Philippidis,G.P.)，1996，纤维素生物转化技术(Cellulosebioconversion technology)，生物乙醇手册：生产和利用(Handbook on Bioethanol:Production and Utilization)，怀曼，C.E(Wyman,C.E.)编辑，泰勒-弗朗西斯出版集团(Taylor&Francis)，华盛顿特区(Washington,DC)，179-212)。

其他发酵生物包括以下各项的菌株：芽孢杆菌属，如凝结芽孢杆菌；假丝酵母属，如萨纳瑞西斯假丝酵母、甲醇山梨糖假丝酵母(C.methanosorbosa)、迪丹斯假丝酵母(C.diddensiae)、***滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、C.naedodendra、布朗克假丝酵母(C.blankii)、嗜虫假丝酵母(C.entomophilia)、芸薹假丝酵母(C.brassicae)、假热带假丝酵母(C.pseudotropicalis)、博伊丁假丝酵母(C.boidinii)、产朊假丝酵母(C.utilis)、以及休哈塔假丝酵母；梭菌属，如丙酮丁醇梭菌、热纤维梭菌、以及发酵植物多糖梭菌；大肠杆菌，特别是已被遗传修饰以改善乙醇产率的大肠杆菌菌株；土芽孢杆菌属种；汉逊酵母属，如异常汉逊酵母(Hansenula anomala)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)，如产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)；克鲁维酵母属，如马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)、以及脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)；裂殖酵母属，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)，如解糖热厌氧杆菌、以及发酵单胞菌属(Zymomonas)，如运动发酵单胞菌。

适用于乙醇产生的可商购的酵母包括例如，BIOFERM^TM AFT和XR(NABC-北美生物产品基团(North American Bioproducts Corporation)，佐治亚州，美国)、ETHANOL RED^TM酵母(弗曼迪斯/乐斯福(Fermentis/Lesaffre)，美国)、FALI^TM(菲氏酵母(Fleischmann’sYeast)，美国)、FERMIOL^TM(帝斯曼配料部(DSM Specialties))、GERT STRAND^TM(GertStrand AB，瑞典)、以及SUPERSTART^TM和THERMOSACC^TM新鲜酵母(乙醇技术(EthanolTechnology)，威斯康辛州，美国)。

在一个方面中，发酵微生物已经经过遗传修饰，以提供发酵戊糖的能力，如利用木糖的微生物、利用***糖的微生物、以及共同利用木糖和***糖的微生物。

将异源基因克隆到多种发酵微生物中已经构建出能够将己糖和戊糖转化成乙醇(共发酵)的生物(陈(Chen)和霍(Ho)，1993，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)39-40:135-147；霍等人，1998，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)64:1852-1859；科特(Kotter)和西拉塞(Ciriacy)，1993，应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)38:776-783；维尔福森(Walfridsson)等人，1995，应用与环境微生物学61:4184-4190；凯珀(Kuyper)等人，2004，欧洲微生物学会联合会酵母研究(FEMS Yeast Research)4:655-664；比尔(Beall)等人，1991，生物技术与生物工程(Biotech.Bioeng.)38:296-303；英格拉姆(Ingram)等人，1998，生物技术与生物工程58:204-214；张(Zhang)等人，1995，科学(Science)267:240-243；狄安妲(Deanda)等人，1996，应用与环境微生物学62:4465-4470；WO 2003/062430)。

在一个方面中，该发酵生物包括编码本发明的变体的多核苷酸。

在另一个方面中，该发酵生物包括编码在此描述的一种或多种纤维素分解酶、半纤维素分解酶和辅助酶的一个或多个多核苷酸。

本领域中熟知的是，以上所描述的生物还可以用于产生其他物质，如在此所描述的。

典型地向降解的纤维素材料或水解物中添加发酵微生物，并且进行发酵持续约8至约96小时，例如约24至约60小时。温度典型地在约26℃至约60℃之间，例如约32℃或50℃，并且pH为约pH 3至约pH 8，例如pH 4至5、6或7。

在一个方面中，应用酵母和/或另一种微生物至降解的纤维素材料并且进行发酵，持续约12至约96小时，例如典型地24-60小时。在另一个方面中，温度优选在约20℃至约60℃之间，例如约25℃至约50℃、约32℃至约50℃、或约32℃至约50℃，并且pH通常为约pH 3至约pH 7，例如约pH 4至约pH 7。然而，一些发酵生物(例如细菌)具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微生物优选以每ml发酵液大约10⁵至10¹²，优选从大约10⁷至10¹⁰，特别是大约2×10⁸个活细胞计数的量施用。关于使用酵母进行发酵的进一步指南可以见于例如“醇教材”(“The Alcohol Textbook”)(K·雅克(K.Jacques)、T.P.里昂(T.P.Lyons)以及D.R.凯尔索尔(D.R.Kelsall)编辑，诺丁汉大学出版社(Nottingham University Press)，英国(United Kingdom)1999)，将其通过引用结合在此。

发酵刺激剂可以与在此所描述的任何方法组合使用，以进一步改进发酵方法，特别是改进发酵微生物的性能，如，提高速度和乙醇产率。“发酵刺激剂”是指用于发酵微生物(特别是酵母)生长的刺激剂。用于生长的优选发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸、烟酸、内消旋肌醇、硫胺素、吡哆醇、对氨基苯酸、叶酸、核黄素、以及维生素A、B、C、D和E。例如参见阿尔弗雷多(Alfenore)等人，通过在进料分批方法过程中的一种维生素进料策略改进乙醇产生和酿酒酵母的存活力(Improving ethanolproduction and viability of Saccharomyces cerevisia by a vitamin feedingstrategy during fed-batch process)，施普林格(2002)，其通过引用结合在此。矿物质的实例包括可以供应包含P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu营养素的矿物质和矿物盐。

发酵产品：发酵产品可以是由发酵得到的任何物质。发酵产物可以是而不限于：醇(例如，***糖醇、正丁醇、异丁醇、乙醇、甘油、甲醇、乙二醇、1,3-丙二醇(丙二醇)、丁二醇、丙三醇、山梨醇、以及木糖醇)；烷烃(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、以及十二烷)；环烷烃(例如，环戊烷、环己烷、环庚烷、以及环辛烷)；烯烃(例如，戊烯、己烯、庚烯、以及辛烯)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、以及苏氨酸)；气体(例如，甲烷、氢气(H₂)、二氧化碳(CO₂)、以及一氧化碳(CO))；异戊二烯；酮(例如，丙酮)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸、以及木糖酸)；以及聚酮化合物。

在一个方面中，该发酵产物是一种醇。术语“醇”涵盖包含一个或多个羟基部分的物质。醇可以是而不限于：正丁醇、异丁醇、乙醇、甲醇、***糖醇、丁二醇、乙二醇、甘油(glycerin)、丙三醇(glycerol)、1,3-丙二醇、山梨醇、木糖醇。参见例如，宫(Gong)等人，1999，由可再生资源生产乙醇(Ethanol production from renewable resources)，在生化工程/生物技术进展(Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology)中，舍佩尔，T.(Scheper,T.)编辑，施普林格出版社，柏林，海德堡，德国，65:207-241；西尔维拉(Silveira)和乔纳斯(Jonas)，2002，应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)59:400-408；尼加姆(Nigam)和辛格，1995，加工生物化学(Process Biochemistry)30(2):117-124；埃塞吉(Ezeji)等人，2003，微生物与生物技术世界杂志(World Journal of Microbiology and Biotechnology)19(6):595-603。

在另一个方面中，该发酵产物是一种烷烃。该烷烃可以是非支链或支链烷烃。烷烃可以是而不限于：戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、或十二烷。

在另一个方面中，该发酵产物是一种环烷烃。环烷烃可以是而不限于：环戊烷、环己烷、环庚烷或环辛烷。

在另一个方面中，该发酵产物是一种烯烃。该烯烃可以是非支链或支链烯烃。烯烃可以是而不限于：戊烯、己烯、庚烯或辛烯。

在另一个方面中，该发酵产物是一种氨基酸。有机酸可以是而不限于：天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、或苏氨酸。参见例如理查德(Richard)和马加里蒂(Margaritis)，2004，生物技术和生物工程(Biotechnology and Bioengineering)87(4):501-515。

在另一个方面中，该发酵产物是一种气体。气体可以是而不限于：甲烷、H₂、CO₂、或CO。参见例如，片冈(Kataoka)等人，1997，水科学与技术(Water Science and Technology)36(6-7):41-47；以及古纳森兰(Gunaseelan)，1997，生物质与生物能源(Biomass andBioenergy)13(1-2):83-114。

在另一个方面中，该发酵产物是异戊二烯。

在另一个方面中，该发酵产物是一种酮。术语“酮”涵盖包含一个或多个酮部分的物质。酮可以是而不限于：丙酮。

在另一个方面中，发酵产品是一种有机酸。有机酸可以是而不限于：乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸、或木糖酸)。参见，例如，陈(Chen)和李(Lee)，1997，生物化学与生物技术(Biochem.Biotechnol.)63-65:435-448。

在另一个方面中，该发酵产物是聚酮化合物。

回收。可以使用本领域中已知的任何方法可任选地从发酵培养基回收一种或多种发酵产物，这些方法包括但不限于，色谱法、电泳程序、差别溶解度、蒸馏、或萃取。例如，通过常规蒸馏方法从发酵的纤维素材料中分离和纯化醇。可以获得具有高达约96vol.％的纯度的乙醇，这可以用作例如燃料乙醇、饮用乙醇，即可饮用的中性烈酒、或工业乙醇。

植物

本发明还涉及分离的植物，例如，转基因植物、植物部分或植物细胞，这些植物包括本发明的多核苷酸，以便以可回收的量表达和产生纤维二糖水解酶变体。该变体可以从植物或植物部分回收。可替代地，可以按原样将含有该变体的植物或植物部分用于改善食品或饲料的质量，例如，改善营养价值、可口性、以及流变性质，或用以破坏抗营养因子。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，如草甸草(蓝草，早熟禾属)；饲草，如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草，如翦股颖属(Agrostis)；以及谷类，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、以及玉蜀黍(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草、豆类(如羽扇豆(lupins)、马铃薯、糖甜菜(sugarbeet)、豌豆、豆(bean)和大豆(soybean))、以及十字花科植物(十字花科(familyBrassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及紧密相关的模式生物拟南芥)。

植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、以及块茎、以及包括这些部分的独立组织，例如，表皮、叶肉、薄壁组织(parenchyme)、维管组织、分生组织。特定植物细胞区室，如叶绿体、质外体(apoplast)、线粒体、液泡、过氧化物酶体以及细胞质也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论是何种组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以有助于本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和种皮。

同样包含于本发明范围内的是这类植物、植物部分以及植物细胞的子代。

表达变体的转基因植物或植物细胞可以根据本领域已知的方法来构建。简而言之，通过如下方法构建该植物或植物细胞：将编码变体的一个或多个表达构建体并入到植物宿主基因组或叶绿体基因组中，并且使所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。

表达构建体宜为包括编码变体的多核苷酸的核酸构建体，该多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当的调节序列可操作地连接。而且，表达构建体可包含用于鉴别整合了此表达构建体的植物细胞的选择性标记，和将此构建体引入所讨论的植物所必需的DNA序列(后者取决于所用的引入DNA的方法)。

例如，基于希望在何时、何处、以及如何表达该变体来确定对调节序列如启动子和终止子序列和任选的信号或转运序列的选择(斯蒂科林(Sticklen)，2008，自然综述(Nature Reviews)9:433-443)。例如，编码变体的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且可以使基因产物靶向特定组织或植物部分，如种子或叶。调节序列由例如塔格(Tague)等人，1988，植物生理学(Plant Physiology)86:506描述。

对于组成型表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1、或稻肌动蛋白1启动子(弗兰克(Franck)等人，1980，细胞(Cell)21:285-294；克里斯滕森(Christensen)等人，1992，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)18:675-689；张(Zhang)等人，1991，植物细胞(Plant Cell)3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是以下各项的启动子，例如来自贮藏库组织(例如种子、马铃薯块茎、和果实)(爱德华兹(Edwards)和科鲁兹(Coruzzi)，1990，遗传学年鉴(Ann.Rev.Genet.)24:275-303)，或来自代谢库组织(例如分生组织)(伊藤(Ito)等人，1994，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)24:863-878)，种子特异性启动子，例如来自水稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白或白蛋白启动子(吴(Wu)等人，1998，植物与细胞生理学(Plant Cell Physiol.)39:885-889)，来自豆球蛋白B4的蚕豆启动子和来自蚕豆的未知种子蛋白基因(康拉德(Conrad)等人，1998，植物生理学杂志(J.Plant Physiol.)152:708-711)，来自种子油体蛋白的启动子(陈(Chen)等人，1998，植物与细胞生理学(Plant CellPhysiol.)39:935-941)，来自欧洲油菜的贮藏蛋白napA启动子，或本领域已知的任何其他种子特异性启动子，例如，如在WO 91/14772中所述的。此外，启动子可以是叶特异性启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(京冢(Kyozuka)等人，1993，植物生理学(PlantPhysiol.)102:991-1000)、小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(麦卓(Mitra)和希金斯(Higgins)，1994，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)26:85-93)、来自稻的aldP基因启动子(加贺屋(Kagaya)等人，1995，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)248:668-674)、或伤口诱导型启动子(如马铃薯pin2启动子)(许(Xu)等人，1993，植物分子生物学22:573-588)。同样地，启动子可以通过非生物处理来诱导，如温度、干旱、或盐度变化，或通过外源施加的激活该启动子的物质来诱导，例如乙醇、***、植物激素(如乙烯、脱落酸和赤霉酸)、以及重金属。

启动子增强子元件也可以用于实现变体在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是置于启动子与编码变体的多核苷酸之间的内含子。例如，许等人，1993，见上文，披露了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。

该选择性标记基因及该表达构建体的任何其他部分可以选自本领域中可用的那些。

可以根据本领域中已知的常规技术将核酸构建体结合到植物基因组中，这些常规技术包括土壤杆菌介导的转化、病毒介导的转化、微注射、粒子轰击、生物射弹转化、以及电穿孔(加塞尔(Gasser)等人，1990，科学244:1293；波特里库斯(Potrykus)，1990，生物/技术8:535；岛本(Shimamoto)等人，1989，自然338:274)。

目前根癌土壤杆菌介导的基因转移是一种用于产生转基因双子叶植物(关于综述，请参见霍伊卡(Hooykas)和施尔伯鲁特(Schilperoort)，1992，植物分子生物学(PlantMol.Biol.)19:15-38)并且用于转化单子叶植物的方法，但对于这些植物还常常使用其他的转化方法。用于产生转基因单子叶植物的方法是粒子(涂覆有转化DNA的微观金或钨粒子)轰击胚愈伤组织或发育中的胚(克里斯托(Christou)，1992，植物杂志(Plant J.)2:275-281；岛本，1994，生物技术当前述评(Curr.Opin.Biotechnol.)5:158-162；瓦西尔(Vasil)等人，1992，生物/技术(Bio/Technology)10:667-674)。用于转化单子叶植物的替代方法是基于原生质体转化，如由奥米儒勒(Omirulleh)等人，1993，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)21:415-428所描述。另外的转化方法包括美国专利号6,395,966和7,151,204(两者都通过引用以其全文结合于此)中所描述的那些。

在转化后，根据本领域熟知的方法选出已并入了表达构建体的转化体，并使其再生成为完整植物。通常设计转化程序用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或利用特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。

除用本发明的构建体直接转化特定植物基因型外，还可以通过使具有该构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物进行杂交来产生转基因植物。例如，可以通过杂交将编码变体的构建体引入特定植物品种中，无需总是直接地转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖了从根据本发明已经转化的细胞直接再生的植物，而且还涵盖了这类植物的后代。如在此使用的，后代可以是指根据本发明制备的亲本植物的任何代的后代。此类后代可以包含根据本发明制备的DNA构建体。杂交导致通过供体植物系与起始系交叉授粉，将转基因引入植物系。此类步骤的非限制性实例描述于美国专利号7,151,204中。

植物可以通过回交转化方法生成。例如，植物包含被称为回交转化的基因型、种系、近交体、或杂交体的植物。

可以使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景渗入到另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可以用于避免由表型变异导致的错误。另外，遗传标记可以在具体杂交的个别后代中提供有关良种种质相对程度的数据。例如，当具有所希望性状并且另外具有非农艺学所希望的遗传背景的植物与良种亲本杂交时，可以使用遗传标记来选择不仅具有感兴趣的性状，还具有相对较大比例所希望种质的后代。以此方式，使一种或多种性状渗入特定遗传背景所需的世代数得以最小化。

本发明还涉及产生本发明的变体的方法，包括：(a)在有助于产生该变体的条件下培养包含编码该变体的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；并且(b)回收该变体。

通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。

实例

菌株

将米曲霉菌株MT3568用作表达编码纤维二糖水解酶I及其变体的里氏木霉基因的宿主。米曲霉MT3568是米曲霉JaL355的amdS(乙酰胺酶)破坏的基因衍生物(WO 2002/40694)，其中通过破坏米曲霉乙酰胺酶(amdS)基因修复pyrG营养缺陷型。

培养基和溶液

COVE蔗糖板或斜面由342g的蔗糖、20g的琼脂粉、20ml的COVE盐溶液、以及补足至1升的去离子水构成。该培养基通过在15psi下高压杀菌15分钟来进行灭菌(细菌学分析手册(Bacteriological Analytical Manual)，第8版，修订A，1998)。将该培养基冷却至60℃并且然后添加10mM乙酰胺、15mM CsCl以及X-100(50μl/500ml)。

COVE盐溶液由26g的MgSO₄·7H₂O、26g的KCl、26g的KH₂PO₄、50ml的COVE痕量金属溶液、以及补足至1升的去离子水构成。

COVE痕量金属溶液由0.04g的Na₂B₄O₇·10H₂O、0.4g的CuSO₄·5H₂O、1.2g的FeSO₄·7H₂O、0.7g的MnSO₄·H₂O、0.8g的Na₂MoO₄·2H₂O、10g的ZnSO₄·7H₂O、以及补足至1升的去离子水构成。

DAP-4C培养基由20g的右旋糖、10g的麦芽糖、11g的MgSO₄·7H₂O、1g的KH₂PO₄、2g的柠檬酸、5.2g的K₃PO₄·H₂O、0.5g的酵母提取物(Difco)、1ml的消泡剂、0.5ml的KU6痕量金属溶液、2.5g的CaCO₃、以及补足至1升的去离子水构成。该培养基通过在15psi下高压杀菌15分钟来进行灭菌(细菌学分析手册(Bacteriological Analytical Manual)，第8版，修订A，1998)。在使用之前，每150ml的培养基添加3.5ml的无菌的50％(NH₄)₂HPO₄和5ml的无菌的20％乳酸。

G2-Gly培养基由18g的酵母提取物、24g的甘油(86％-88％)、1ml消泡剂、以及补足至1升的去离子水构成。

KU6痕量金属溶液由0.13g的NiCl₂、2.5g的CuSO₄·5H₂O、13.9g的FeSO₄·7H₂O、8.45g的MnSO₄·H₂O、6.8g的ZnCl₂、3g的柠檬酸、以及补足至1升的去离子水构成。

LB培养基由10g的细菌用胰蛋白胨(Bacto-Tryptone)、5g的酵母提取物、10g的氯化钠，以及补足至1升的去离子水构成。

LB板由10g的细菌用胰蛋白胨、5g的酵母提取物、10g的氯化钠、15g的细菌用琼脂，以及补足至1升的去离子水构成。

PDA板由马铃薯浸出液(马铃薯浸出液是通过将300g切片的(经过洗涤但未削皮)的马铃薯在水中煮沸30分钟，并且然后将该培养液倾析或滤过粗滤布而制成)构成。然后，添加蒸馏水，直到悬浮液的总体积为1升。然后，添加20g的右旋糖和20g的琼脂粉。该培养基通过在15psi下高压杀菌15分钟来进行灭菌(细菌学分析手册(BacteriologicalAnalytical Manual)，第8版，修订A，1998)。

TAE缓冲液由40mM Tris碱、20mM乙酸钠、以及1mM EDTA二钠构成。

YP+2％葡萄糖培养基由去离子水中的1％酵母提取物、2％蛋白胨、以及2％葡萄糖构成。

YP+2％麦芽糖培养基由10g的酵母提取物、20g的蛋白胨、20g的麦芽糖、以及补足至1升的去离子水构成。

实例1：里氏木霉纤维二糖水解酶I的DNA序列信息的来源

里氏木霉GH7纤维二糖水解酶I基因的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中。基因组序列信息由美国能源部联合基因组研究所(JGI)生成并且由马丁内斯(Martinez)等人，2008，自然生物技术(Nature Biotechnology)26(5):553-560公布。全长纤维二糖水解酶I的氨基酸序列可公开地获自国家生物技术信息中心(NCBI)并且被注释为GenBank:EGR44817.1(SEQ ID NO:2)。里氏木霉纤维二糖水解酶I基因的cDNA序列和推导的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:2中。

基于可公开获得的氨基酸序列，产生编码全长纤维二糖水解酶I的密码子优化的合成基因，用于米曲霉表达，基于由古斯塔夫松(Gustafsson)等人，2004，生物技术趋势(Trends in Biotechnology)22(7):346-353研发的算法。通过基因合成服务(生命科技公司(Life Technologies Corp.)，圣地亚哥，加州，美国)用5’Bam HI限制酶切位点、3’Hind III限制酶切位点和位于起始密码子和Bam HI限制酶切位点之间的Kozac共有序列(CACC)合成密码子优化的编码序列(SEQ ID NO:4)。

实例2：里氏木霉纤维二糖水解酶I的定点诱变

将编码里氏木霉纤维二糖水解酶I的密码子优化的合成基因提供于非指定卡那霉素抗性大肠杆菌克隆载体中。为了产生里氏木霉纤维二糖水解酶I M6变体(SEQ ID NO:5用于突变体DNA序列，并且SEQ ID NO:6用于变体)，将AAC密码子(N197)替换为GCC密码子(197A)并且将AAC密码子(N200)替换为GCC密码子(200A)。使用引物设计(安捷伦科技公司(Agilent Technologies,Inc.)，威明顿，特拉华州，美国)在线工具如下所示设计两个用于定点诱变的合成引物，以引入将AAC密码子(N197)变为GCC密码子(197A)并将AAC密码子(N200)变为GCC密码子(200A)的定点突变。

使用下述引物和程序，通过由基因合成提供的卡那霉素抗性大肠杆菌克隆载体的两次PCR扩增帮助编码野生型里氏木霉纤维二糖水解酶的合成基因的定点诱变：

引物F-N197A：

5’-GGGAACCCTCGTCGGCCAACGCCAACACCG-3’(SEQ ID NO:23)

引物R-N197A：

5’-CGGTGTTGGCGTTGGCCGACGAGGGTTCCC-3’(SEQ ID NO:24)

引物F-N200A：

5’-TCGTCGGCCAACGCCGCCACCGGCATTGGAGG-3’(SEQ ID NO:25)引物R-N200A：

5’-CCTCCAATGCCGGTGGCGGCGTTGGCCGACGA-3’(SEQ ID NO:26)

使用高保真PCR试剂盒(Finnzymes Oy公司，艾斯堡，芬兰)通过PCR连续地引入两个突变。PCR溶液由10μl的5X HF缓冲液(FINNZYMES Oy公司，艾斯堡，芬兰)、1μl的dNTP(10mM)、0.5μl的DNA聚合酶(0.2单位/μl)(FINNZYMES Oy公司，艾斯堡，芬兰)、2.5μl的引物F-N197A(10μM)、2.5μl的引物R-N197A(10μM)、1μl的模板DNA(载体，10ng/μl)以及32.5μl的去离子水构成，总体积为50μl。使用PTC-200DNA引擎(MJ研究公司(MJ Research Inc.)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)进行PCR，编程为1个循环，在98℃下持续30秒；和16个循环，每个循环在98℃下持续30秒，在55℃下持续1分钟，以及在72℃下持续4分钟。然后将PCR溶液保持在15℃，直至从PCR仪中移出。

PCR后，将10个单位的Dpn I直接添加至PCR溶液中并在37℃下孵育1小时。然后，根据厂商的方案将1μl的Dpn I处理的PCR溶液转化进ONETOP10F′化学感受态大肠杆菌细胞(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，加州，美国)中，并且将其分散在补充有0.05mg卡那霉素/ml的LB板上。在37℃下孵育过夜后，观察到转化体在LB卡那霉素板上在选择下生长。将两个转化体在补充有0.05mg卡那霉素/ml的LB培养基中进行培养并且使用Spin Miniprep试剂盒(凯杰公司(QIAGEN Inc.)，巴伦西亚，加州，美国)分离质粒。

使用应用生物系统3730xl DNA分析仪(Applied Biosystems 3730xl DNAAnalyzer)(应用生物系统公司(Applied Biosystems)，福斯特城，加州，美国)，用以下所示的载体引物和里氏木霉纤维二糖水解酶I基因特异性引物(R-Central公司)对分离的质粒测序，以便确定不含PCR错误并且含有AAC至GCC突变的代表性质粒。

引物F-载体：

5’-CGTTGTAAAACGACGGCC-3’(SEQ ID NO:27)

引物R-载体：

5’-TGTTAATGCAGCTGGCAC-3’(SEQ ID NO:28)

引物R-Central：

5’-CTTGTCGGAGAACGACGA-3’(SEQ ID NO:29)

选择一个不含PCR错误并且含有AAC(N197)至GCC(197A)突变的质粒克隆并且将其指定为质粒pN197A。

进行第二轮PCR，以使用高保真PCR试剂盒通过PCR引入N200A突变。PCR溶液由10μl的5X HF缓冲液、1μl的dNTP(10mM)、0.5μl的DNA聚合酶(0.2单位/μl)、2.5μl的引物F-N200A(10μM)、2.5μl的引物R-N200A(10μM)、1μl的模板DNA(pN197A，10ng/μl)以及32.5μl的去离子水构成，总体积为50μl。使用PTC-200DNA引擎进行PCR，编程为1个循环，在98℃下持续30秒；和16个循环，每个循环在98℃下持续30秒，在55℃下持续1分钟，以及在72℃下持续4分钟。然后将PCR溶液保持在15℃，直至从PCR仪中移出。

PCR后，将10个单位的Dpn I直接添加至PCR溶液中并在37℃下孵育1小时。然后，根据厂商的方案将1μl的Dpn I处理的PCR溶液转化进ONETOP10F′化学感受态大肠杆菌细胞中，并且将其分散在补充有0.05mg卡那霉素/ml的LB板上。在37℃下孵育过夜后，观察到转化体在LB卡那霉素板上在选择下生长。将两个转化体在补充有0.05mg卡那霉素/ml的LB培养基中进行培养并且使用Spin Miniprep试剂盒分离质粒。

使用应用生物系统3730xl DNA分析仪，用以上所示的引物F-载体、R-载体和R-Central对分离的质粒测序，以便确定不含PCR错误并且含有AAC至GCC突变的代表性质粒。

选择一个不含PCR错误并且含有AAC(N197)至GCC(197A)和ACC(N200)至GCC(200A)突变的质粒克隆并且将其指定为质粒pM6。在此将该变体指定为“M6变体”。

实例3：包含编码纤维二糖水解酶I的里氏木霉cDNA序列的米曲霉表达载体的构建

根据厂商的说明书，用Fast Digest Bam HI和Hind III(菲门特斯公司(Fermentas Inc.)，格伦伯尼，马里兰州，美国)消化由基因合成提供的编码里氏木霉纤维二糖水解酶I(SEQ ID NO:4)的卡那霉素抗性大肠杆菌克隆载体。使用TAE缓冲液，通过1.0％琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶切下1552bp产物带，并且使用ILLUSTRA^TM GFX^TM DNA纯化试剂盒(GE医疗集团生命科学部(GE Healthcare LifeSciences)，布隆德比，丹麦)进行纯化。

然后，使用T4 DNA连接酶(新英格兰生物实验室(New England Biolabs)，伊普斯威奇，马萨诸塞州，美国)将1552bp片段克隆进用Bam HI和Hind III消化的pDau109(WO2005/042735)中。将Bam HI-Hind III消化的pDau109和含有里氏木霉纤维二糖水解酶I编码序列的Bam HI/Hind III片段以1:3的摩尔比混合(即，质量比大约2.5:1或20ng:50ng)并且根据厂商的说明书，在具有1mM ATP的1X T4 DNA连接酶缓冲液(新英格兰生物实验室，伊普斯威奇，马萨诸塞州，美国)中，在16℃下，用50单位的T4 DNA连接酶连接过夜。将里氏木霉纤维二糖水解酶I基因克隆进Bam HI-Hind III消化的pDau109中，导致里氏木霉纤维二糖水解酶I基因在NA2-tpi双启动子的控制下进行转录。NA2-tpi启动子是来自编码黑曲霉中性α-淀粉酶的基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因的未翻译的前导序列替换了未翻译的前导序列。

根据厂商的方案，将连接混合物转化进ONETOP10F′化学感受态大肠杆菌细胞中，并且将其分散在补充有0.1mg氨比西林/ml的LB板上。在37℃下孵育过夜后，观察到菌落在LB氨比西林板上在选择下生长。

使用以下引物，如下所述，在菌落上通过PCR验证里氏木霉纤维二糖水解酶I基因***进pDau109中。

引物F-pDau109

5’-CCCTTGTCGATGCGATGTATC-3’(SEQ ID NO:30)

引物R-pDau109

5’-ATCCTCAATTCCGTCGGTCGA-3’(SEQ ID NO:31)

将1.1X预混合液(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific)，罗斯基勒，丹麦)用于PCR。PCR溶液由10μl的1.1X预混合液、0.5μl的引物F-pDau109(10μM)和0.5μl的引物R-pDau109(10μM)构成。使用牙签将少量的细胞转移至PCR溶液中。使用PTC-200DNA引擎进行PCR，编程为1个循环，在94℃下持续3分钟；30个循环，每个循环在94℃下持续30秒，在50℃下持续1分钟，以及在72℃下持续2分钟；以及1个循环，在72℃下持续1分钟。然后将PCR溶液保持在15℃，直至从PCR仪中移出。

使用TAE缓冲液，通过1.0％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，其中观察到一个1860bpPCR产物带，从而证实里氏木霉纤维二糖水解酶I编码序列***进pDau109中。

将含有里氏木霉纤维二糖水解酶I质粒构建体的大肠杆菌转化体在补充有0.1mg的氨比西林/ml的LB培养基中进行培养并且使用Spin Miniprep试剂盒分离质粒DNA。将该质粒指定为pKHJN0036。

实例4：包含编码纤维二糖水解酶I M6变体的里氏木霉cDNA序列的米曲霉表达载体的构建

根据厂商的说明书，用Fast Digest Bam HI和Hind III消化编码里氏木霉纤维二糖水解酶I M6变体的质粒pM6。使用TAE缓冲液，通过1.0％琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶切下1552bp产物带，并且使用ILLUSTRA^TM GFX^TM DNA纯化试剂盒进行纯化。

然后，使用T4 DNA连接酶将1552bp片段克隆进用Bam HI和Hind III消化的pDau109中。将Bam HI-Hind III消化的pDau109和含有里氏木霉纤维二糖水解酶I M6变体编码序列的Bam HI/Hind III片段以1:3的摩尔比混合(即，质量比大约2.5:1或20ng:50ng)并且在具有1mM ATP的1X T4DNA连接酶缓冲液中，在16℃下，用50单位的T4 DNA连接酶连接过夜。将里氏木霉纤维二糖水解酶I M6变体基因克隆进Bam HI-Hind III消化的pDau109中，导致里氏木霉纤维二糖水解酶I M6变体基因在上述NA2-tpi双启动子的控制下进行转录。

根据厂商的方案，将连接混合物转化进ONE TOP10F′化学感受态大肠杆菌细胞中，并且将其分散在补充有0.1mg氨比西林/ml的LB板上。在37℃下孵育过夜后，观察到菌落在LB氨比西林板上在选择下生长。

使用以下所示的引物F-pDau109和R-pDau109(实例3)，如下所述，在菌落上通过PCR验证里氏木霉纤维二糖水解酶I M6变体基因***进pDau109中。

引物F-pDau109

5’-CCCTTGTCGATGCGATGTATC-3’(SEQ ID NO:30)

引物R-pDau109

5’-ATCCTCAATTCCGTCGGTCGA-3’(SEQ ID NO:31)

将1.1X预混合液用于PCR。PCR溶液由10μl的1.1X预混合液、0.5μl的引物F-pDau109(10μM)和0.5μl的引物R-pDau109(10μM)构成。使用牙签将少量的细胞转移至PCR溶液中。使用PTC-200DNA引擎进行PCR，编程为1个循环，在94℃下持续3分钟；30个循环，每个循环在94℃下持续30秒，在50℃下持续1分钟，以及在72℃下持续2分钟；以及1个循环，在72℃下持续1分钟。然后将PCR溶液保持在15℃，直至从PCR仪中移出。

使用TAE缓冲液，通过1.0％琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应产物，其中观察到一个1860bp PCR产物带，从而证实里氏木霉纤维二糖水解酶I M6变体编码序列***进pDau109中。

将含有里氏木霉纤维二糖水解酶I M6变体质粒构建体的大肠杆菌转化体在补充有0.1mg的氨比西林/ml的LB培养基中进行培养并且使用Spin Miniprep试剂盒分离质粒。将该质粒指定为pKHJN0059。

实例5：野生型里氏木霉纤维二糖水解酶I的表达

根据克里斯滕森(Christensen)等人，1988，生物技术(Biotechnology)6，1419-1422和WO 2004/032648，将表达质粒pKHJN0036转化进米曲霉MT3568原生质体中。根据EP0238023B1，第14-15页的方法制备米曲霉MT3568原生质体。

在使转化体在PDA板上形成孢子之前，在COVE蔗糖板上通过单一的分生孢子纯化转化体。将转化体的孢子接种进包含0.75ml的YP+2％葡萄糖培养基的96深孔板中并且在30℃下静止孵育4天。从96深孔培养的培养上清液分析转化体的里氏木霉纤维二糖水解酶I的产生。使用E-Page 8％SDS-PAGE 48孔凝胶(英杰公司，卡尔斯巴德，加州，美国)和考马斯亮蓝染色通过SDS-PAGE分析验证表达。基于由SDS-PAGE给出的表达水平，选择一个转化体并且将其指定为米曲霉CBH I。

对于较大规模的生产，将米曲霉CBH I孢子分散到COVE蔗糖斜面上并且在37℃下孵育五天。用5ml的0.01％20将融合的孢子斜面洗涤两次，以使收集的孢子的数目最大化。然后，使用孢子悬浮液接种七个包含150ml的DAP-4C培养基的500ml烧瓶。将培养株在30℃下进行孵育，同时以100rpm进行恒定振荡。在接种后第四天，经由瓶盖MF75 SuporMachV 0.2μm PES过滤器(bottle top MF75MachV 0.2μm PES filter)(赛默飞世尔科技公司，罗斯基勒，丹麦)通过过滤收集培养液。使用E-Page 8％SDS-PAGE 48孔凝胶和考马斯亮蓝染色通过SDS-PAGE分析验证表达。来自米曲霉CBH I的培养液产生了里氏木霉纤维二糖水解酶I的大约80kDa的带。

实例6：里氏木霉纤维二糖水解酶I M6变体的表达

根据克里斯滕森(Christensen)等人，1988，见上文和WO 2004/032648，将表达质粒pKHJN0059转化进米曲霉MT3568原生质体中。根据欧洲专利EP 0238023，第14-15页的方法制备米曲霉MT3568原生质体。

在使转化体在PDA板上形成孢子之前，在COVE蔗糖板上通过单一的分生孢子纯化转化体。将转化体的孢子接种进包含0.75ml的YP+2％葡萄糖培养基的96深孔板中并且在30℃下静止孵育4天。从96深孔培养的培养上清液分析转化体的里氏木霉纤维二糖水解酶IM6变体的产生。使用E-Page 8％SDS-PAGE 48孔凝胶和考马斯亮蓝染色通过SDS-PAGE分析验证表达。基于由SDS-PAGE给出的表达水平，选择一个转化体用于进一步工作并且将其指定为米曲霉M6。

对于较大规模的生产，将米曲霉M6孢子分散到COVE蔗糖斜面上并且在37℃下孵育五天。用5ml的0.01％20将融合的孢子斜面洗涤两次，以使收集的孢子的数目最大化。然后，使用孢子悬浮液接种七个包含150ml的DAP-4C培养基的500ml烧瓶。将培养株在30℃下进行孵育，同时以100rpm进行恒定振荡。在接种后第四天，经由瓶盖MF75 SuporMachV 0.2μm PES过滤器通过过滤收集培养液。使用E-Page 8％SDS-PAGE 48孔凝胶和考马斯亮蓝染色通过SDS-PAGE分析验证表达。来自米曲霉M6的培养液产生了里氏木霉纤维二糖水解酶I M6变体的大约80kDa的带。

实例7：里氏木霉野生型纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶I M6变体的纯化

将米曲霉CBH I(实例5)和米曲霉M6(实例6)的过滤的培养液调节至pH 7.0并使用0.22μm PES过滤器(Nalge Nunc国际集团，罗契斯特，纽约，美国)过滤。然后，将硫酸铵添加至每一滤液中，至浓度为1.8M。

根据以下程序纯化每一滤液。将滤液装载在用1.8M硫酸铵，25mM HEPES(pH 7.0)平衡的Phenyl6Fast Flow柱(高分辨率(high sub))(通用电气医疗集团(GE Healthcare)，英国)上。用0.54M硫酸铵洗涤后，将结合的蛋白用25mM HEPES(pH 7.0)分批洗脱。收集级分并且使用12-孔4％-12％Bis-Tris凝胶(通用电气医疗集团，皮斯卡特维，新泽西州，美国)通过SDS-PAGE进行分析。基于如上所述的SDS-PAGE，将这些级分合并并且将其施加至用25mM MES(pH 6.0)平衡的SEPHADEX^TM G-25(中)柱(通用电气医疗集团，英国)上。收集级分，通过如上所述的SDS-PAGE进行分析，并合并。将合并的级分施加至用25mM MES(pH 6.0)平衡的6ml RESOURCE^TM 15Q柱(通用电气医疗集团，英国)上，并且针对野生型纤维二糖水解酶用线性0-300mM氯化钠梯度(12个柱体积)或针对变体用线性0-350mM氯化钠梯度(14个柱体积)洗脱结合的蛋白。收集级分并且使用4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(西格玛化学有限公司(Sigma Chemical Co.)，圣路易斯，密苏里州，美国)和4-硝基苯基-β-D-吡喃乳糖苷(lactopyranoside)(西格玛化学有限公司，圣路易斯，密苏里州，美国)作为底物通过SDS-PAGE、A₂₈₀和活性测量值进行分析。在96孔Nunc微量滴定板(赛默科技公司(Thermo Scientific)，森尼韦尔，加州，美国)中进行测定。测定缓冲液为50mM伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)缓冲液(50mM H₃PO₄、50mM CH₃COOH、50mM H₃BO₃)与50mMKCl、1mM CaCl₂、0.01％X-100，用NaOH将pH调节至6.0。将20μl的蛋白溶液样品吸移进每个孔中并且添加测定缓冲液中的120μl的1mM底物。使用底物4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷确定β-葡糖苷酶活性并且使用4-硝基苯基-β-D-吡喃乳糖苷确定纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶变体活性。通过用20μl的4-硝基酚盐标准品(0、0.05、0.075、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mM)替换蛋白溶液来生成标准曲线。必要的话，将样品稀释于测定缓冲液中，以产生在标准曲线范围内的吸收。将板密封并且在750rpm振荡下在恒温混匀仪(thermomixer)中于37℃下孵育15分钟。孵育后，立即通过添加100μl的0.5M甘氨酸-2mMEDTA(pH 10)而终止反应并且在405nm下测量吸收。记录每个样品的“空白”(其中在终止溶液后添加蛋白)的吸收并且将其从结果中减掉，以获得释放的4-硝基酚盐的吸收。

基于SDS-PAGE、A₂₈₀和活性测量值，将级分合并为终产物。

将里氏木霉野生型纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶I M6变体分别纯化至浓度为57μM和38μM，如分别使用计算的摩尔消光系数84810M^-1·cm^-1和84810M^-1·cm^-1通过A₂₈₀所测量的。

实例8：在微晶纤维素上测量里氏木霉纤维二糖水解酶M6变体的活性

使用微晶纤维素(PH101；西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)，圣路易斯，密苏里州，美国)作为底物，将纯化的纤维二糖水解酶I M6变体(实例7)的活性与纯化的里氏木霉野生型纤维二糖水解酶I(实例7)进行比较。将微晶纤维素以60g/升的作为测定缓冲液的2mM CaCl₂-50mM乙酸钠(pH 5)悬浮。

在连接至Julabo F12水浴器(布赫&霍尔姆公司(Buch&Holm A/S)，海莱乌，丹麦)的水套玻璃比色槽中测量里氏木霉野生型纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶I M6变体的活性。每个反应室都填充有5ml的微晶纤维素悬浮液并在600rpm下进行磁力搅拌。使用具有Fusion 100注射泵(Chemyx公司，斯坦福，得克萨斯州，美国)的250μl玻璃注射器(汉密尔顿有限公司(Hamilton Co.)，波士顿，马萨诸塞州，美国)将酶经1秒的注射时间(野生型：8.8μl，528μl/分钟；M6变体：13.16μl，789μl/分钟)注射进比色槽中，至终浓度为100nM(5μg/ml)。在用80μl的1M NaOH淬灭之前，允许反应在25℃下进行5小时。

从每个反应中移出2个2ml的样品并且用0.2μM亲水性NML针筒式滤器(赛多利斯斯泰迪生物技术公司(Sartorius Stedim Biotech S.A.)，哥廷根，德国)过滤。将滤液以1:10用milliQ水稀释(未稀释地测量对照)并且使用配备有4mm x 25cmCARBOPAC^TM PA10柱(赛默科技公司，森尼韦尔，加州，美国)、Dionex GP40梯度泵(赛默科技公司，森尼韦尔，加州，美国)和具有金工作电极(标准碳水化合物环境)的Dionex ED40电化学检测器(赛默科技公司，森尼韦尔，加州，美国)的Dionex ICS-5000DC高效液相色谱(HPLC)系统(赛默科技公司，森尼韦尔，加州，美国)分析葡萄糖、纤维二糖和纤维三糖含量。使用以下梯度程序以1ml/分钟的流速将寡糖在CARBOPAC^TM PA10柱上分离：用50mM氢氧化钠等度洗脱0-4分钟；4-28分钟，线性梯度，至90mM氢氧化钠中的100mM乙酸钠；28-29分钟，线性梯度，至200mM氢氧化钠中的450mM乙酸钠；29-30分钟，线性梯度，至100mM氢氧化钠；30-31分钟，线性梯度，至50mM氢氧化钠；以及31-35分钟，在初始条件下重新平衡。合并的外部标准品为([葡萄糖]/[纤维二糖]/[纤维三糖])：1μM/2μM/0.5μM、2μM/4μM/1μM、3μM/6μM/1.5μM、4μM/8μM/2μM以及5μM/10μM/2.5μM。使用7色谱数据系统(赛默飞世尔科技公司，罗斯基勒，丹麦)进行色谱图峰积分、标准曲线和浓度测定。

如示于图1和表1中的结果证明，与野生型纤维二糖水解酶相比，纤维二糖水解酶IM6变体针对微晶纤维素的活性增加大约65％。

表1：在pH 5和25℃下5小时后，通过里氏木霉野生型纤维二糖水解酶I及其纤维二糖水解酶I M6变体由微晶纤维素产生的糖。

	[葡萄糖](μM)	[纤维二糖](μM)	[纤维三糖](μM)
				对照	15.9	1.6	2.5
野生型	22.9±0.3	121.4±4.3	5.4±4x 10<sup>-3</sup>
				M6变体	29.1±10<sup>-3</sup>	201.7±0.5	8.1±0.04

实例9：预处理的玉米秸杆水解测定

在美国能源部国家可再生能源实验室(NREL)使用1.4wt％硫酸在165℃和107psi下对玉米秸秆预处理8分钟。预处理的玉米秸秆(PCS)中的水不溶性固形物含有56.5％纤维素、4.6％半纤维素、以及28.4％木质素。纤维素和半纤维素通过两段硫酸水解、以及随后通过使用NREL标准分析程序#002的高效液相色谱法的分析进行测定。在用硫酸水解纤维素和半纤维素级分后，使用NREL标准分析程序#003通过重量分析法测定木质素。

通过在剧烈混合下添加10M NaOH将PCS的pH调节至5.0，并且然后在120℃下高压杀菌20分钟来制备未碾磨、未洗涤PCS(全浆料PCS)。全浆料PCS的干重是29％。通过在Cosmos ICMG 40多效用湿研磨机(EssEmm公司，泰米尔纳德邦，印度)中碾磨全浆料PCS来制备碾磨的未洗涤的PCS(干重32.35％)。

PCS的水解使用2.2ml深孔平板(爱思进(Axygen)，联合市(Union City)，加州，美国)在1.0ml的总反应体积中进行。用50mg的不溶性PCS固形物/ml的含有1mM硫酸锰和不同酶组合物的不同蛋白负载量(表示为mg蛋白质/克纤维素)的50mM乙酸钠(pH 5.0)缓冲液进行水解。制备酶组合物并且然后将其以从50μl至200μl的范围的体积同时添加至所有的孔中，在每个反应中的终体积为1ml。然后使用ALPS-300^TM板式热封机(ALPS-300^TM plateheat sealer)(阿博基因公司(Abgene)，埃普索姆，英国)将板密封，充分混合，并且在特定温度下孵育72小时。一式三份地重复所有报道的实验。

在水解后，使用0.45μm96孔过滤器板(密理博(Millipore)，贝德福德，马萨诸塞州，美国)过滤样品并且如以下所描述分析滤液的糖含量。在不立即使用时，将过滤的等分部分冷冻在-20℃下。通过以下方式测量稀释于0.005M H₂SO₄中的样品的糖浓度：使用4.6X 250mmHPX-87H柱(伯乐实验室有限公司，赫拉克勒斯，加州，美国)，通过用0.05％w/w苯甲酸-0.005M H₂SO₄在65℃、0.6ml/分钟的流速下洗脱，并且通过整合来自由纯糖样品标定的折射指数检测(1100HPLC，安捷伦科技(Agilent Technologies)，圣克拉拉，加州，美国)的葡萄糖、纤维二糖、以及木糖信号进行定量。使用所得葡萄糖和纤维二糖等效量来计算各反应的纤维素转化的百分比。

单独测量葡萄糖和纤维二糖。针对适当稀释因子来调节所测量的糖浓度。通过针对在零时间点时，未洗涤PCS中的对应的背景糖浓度调节所测量的糖浓度来测定由未洗涤PCS酶促地产生的糖的净浓度。使用MICROSOFT EXCEL^TM软件(微软，里奇兰，华盛顿，美国)来进行所有HPLC数据处理。

使用以下等式来计算纤维素转化成葡萄糖的程度：％纤维素转化＝[葡萄糖浓度+(1.053x纤维二糖浓度)]/[限制消化物中的(葡萄糖浓度+(1.053x纤维二糖浓度)]X 100。为了计算％纤维素转化，基于纤维素酶对照(100mg的里氏木霉纤维素酶/克纤维素)设置100％转化点。将三份数据点取平均值并且计算标准差。

实例10：不具有纤维二糖水解酶I的酶组合物的制备

如WO 2011/057140中所描述在米曲霉中重组制备烟曲霉GH6A纤维二糖水解酶II(SEQ ID NO:32[DNA序列]和SEQ ID NO:33[推导的氨基酸序列])。将烟曲霉纤维二糖水解酶II的过滤的培养液使用400ml SEPHADEX^TM G-25柱缓冲液交换进50mM乙酸钠(pH 5.0)中。合并级分。

将米曲霉用作宿主，根据WO 2011/057140重组地制备里氏木霉GH5内切葡聚糖酶II(SEQ ID NO:34[DNA序列]和SEQ ID NO:35[推导的氨基酸序列])。将里氏木霉内切葡聚糖酶II的过滤的培养液脱盐并且使用切向流(10K膜，颇尔公司(Pall Corporation))缓冲液交换进20mM Tris(pH 8.0)中。

将里氏木霉用作宿主，根据WO 2011/041397重组地制备青霉属(埃默森青)GH61A多肽(SEQ ID NO:36[DNA序列]和SEQ ID NO:37[推导的氨基酸序列])。为了纯化埃默森青霉GH61A多肽，使用配备有5kDa聚醚砜膜(颇尔滤清器公司(Pall Filtron)，诺斯伯勒，麻萨诸塞州，美国)的切向流动浓缩器(颇尔滤清器公司，诺斯伯勒，麻萨诸塞州，美国)将发酵培养基脱盐进20mM Tris-HCl(pH 8.5)中。将缓冲液交换的样品装载在用20mM Tris-HCl，(pH8.0)预平衡的QFast Flow柱(通用电气医疗集团，皮斯卡特维，新泽西州，美国)上，用20mM Tris-HCl(pH 8.0)和1M NaCl洗脱。合并所选级分，加入0.85M硫酸铵，并装载在用20mM Tris-HCl(pH 7.5)和0.85M硫酸铵预平衡的苯基FastFlow柱上，用20mM Tris-HCl(pH 7.5)洗脱。合并级分，并且使用配备有5kDa聚醚砜膜的切向流动浓缩器(颇尔滤清器公司，诺斯伯勒，麻萨诸塞州，美国)脱盐进50mM乙酸钠(pH 5.0)中。

将米曲霉BECh2(WO 2000/39322)用作宿主，根据WO 2006/078256重组地制备烟曲霉GH10木聚糖酶(xyn3)(SEQ ID NO:38[DNA序列]和SEQ ID NO:39[推导的氨基酸序列])。使用26/10脱盐柱(通用电气医疗集团，皮斯卡特维，新泽西州，美国)将烟曲霉木聚糖酶的过滤的培养液脱盐并缓冲液交换进50mM乙酸钠pH 5.0中。

根据WO 2012/044915重组地制备烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶4M突变体(SEQ ID NO:40[DNA序列]和SEQ ID NO:41[推导的氨基酸序列])。使用配备有10kDa聚醚砜膜(颇尔滤清器公司，诺斯伯勒，马萨诸塞州，美国)的切向流浓缩器(颇尔滤清器公司，诺斯伯勒，马萨诸塞州，美国)浓缩烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶4M的过滤培养液并与包含100mM氯化钠的50mM乙酸钠(pH 5.0)进行缓冲液交换。

将米曲霉JaL355用作宿主(WO 2003/070956)，根据拉斯穆森(Rasmussen)等人，2006，生物技术与生物工程(Biotechnology and Bioengineering)94:869-876重组地制备埃默森篮状菌CBS 393.64β-木糖苷酶(SEQ ID NO:42[DNA序列]和SEQ ID NO:43[推导的氨基酸序列])。将过滤的培养液浓缩并且使用配备有10kDa聚醚砜膜的切向流浓缩器脱盐进50mM乙酸钠(pH 5.0)中。

使用微板BCA^TM蛋白测定试剂盒(Microplate BCA^TM Protein Assay Kit)(赛默飞世尔科技，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)确定上述每种单组分的蛋白浓度，在该试剂盒中将牛血清白蛋白用作蛋白标准品。制备一种酶组合物，其由如下各单组分构成：39.7％烟曲霉Cel6A纤维二糖水解酶II、15.9％里氏木霉GH5内切葡聚糖酶II、23.8％青霉属(埃默森青霉)GH61A多肽、7.9％烟曲霉GH10木聚糖酶、7.9％烟曲霉β-葡糖苷酶以及4.8％埃默森篮状菌β-木糖苷酶。在此将该酶组合物指定为“不具有纤维二糖水解酶I的纤维素分解酶组合物”。

实例11：里氏木霉纤维二糖水解酶I M6变体和里氏木霉野生型纤维二糖水解酶I在纤维素酶组合物对碾磨的未洗涤PCS的水解中的作用的比较

使用碾磨的未洗涤PCS作为底物，在40℃下，向不具有纤维二糖水解酶I的纤维素分解酶组合物(实例10)中添加里氏木霉纤维二糖水解酶I M6变体和里氏木霉野生型纤维二糖水解酶I。单独地以0.8633、1.295和1.9425mg酶蛋白/g纤维素向不具有纤维二糖水解酶I的纤维素酶组合物的2.205mg酶蛋白/g纤维素中添加每种纤维二糖水解酶I。

如在实例9中所描述进行该测定。将具有碾磨的未洗涤的PCS(5％不溶性固形物)的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠(pH 5.0)缓冲液中进行24、48和72小时。所有反应一式三份地进行并且涉及在水解开始时的单一混合。

示于图2、3和4中的结果证明，在第24、48和72小时，包括里氏木霉纤维二糖水解酶I M6变体的纤维素酶组合物具有显著高于包括里氏木霉野生型纤维二糖水解酶I的纤维素酶组合物的纤维素转化。

实例12：通过里氏木霉纤维二糖水解酶I M6变体和里氏木霉野生型纤维二糖水解酶I的差示扫描量热法测定Td

使用VP-毛细管差示扫描量热仪(微量热公司(MicroCal Inc.)，皮斯卡特维，新泽西州，美国)通过差示扫描量热法(DSC)测定里氏木霉野生型纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶I M6变体的热稳定性。在200K/小时的恒定的程序化加热速率下，加热在50mM乙酸钠(pH 5.0)中的酶溶液(大约1mg/ml)后获得的热分析图(Cp对T)中，将热变性温度Td(℃)当作变性峰(主要的吸热峰)的顶端。

将样品和参比溶液(大约0.2ml)从10℃下的储存条件装载到量热仪中(参比：不具有酶的缓冲液)，并且在20℃下热预平衡20分钟，随后从20℃到100℃进行DSC扫描。以大约+/-1℃的精确度确定变性温度。

结果证明，与其纤维二糖水解酶I M6变体的68℃相比，里氏木霉野生型纤维二糖水解酶I的Td为69℃。

实例13：野生型里氏木霉纤维二糖水解酶I的定点诱变

使用编码野生型里氏木霉纤维二糖水解酶I的密码子优化的合成基因(实例1)产生里氏木霉纤维二糖水解酶I TC1-111变体(SEQ ID NO:44用于突变体DNA序列；并且SEQID NO:45用于变体)，将AAC密码子(N198)替换为GCA密码子(198A)。

为了产生里氏木霉纤维二糖水解酶I TC1-116变体(SEQ ID NO:46用于突变体DNA序列；并且SEQ ID NO:47用于变体)，将GCC密码子(A199)缺失(A199*)。

为了产生里氏木霉纤维二糖水解酶I TC1-61变体(SEQ ID NO:48用于突变体DNA序列；并且SEQ ID NO:49用于变体)，将AAC密码子(N200)替换为TGG密码子(200W)。

为了产生里氏木霉纤维二糖水解酶I TC1-103变体(SEQ ID NO:50用于突变体DNA序列；并且SEQ ID NO:51用于变体)，将AAC密码子(N200)替换为GGA密码子(200G)。

使用SOE引物设计工具，如下所示，为每个定点诱变设计两个合成引物。引入的定点突变将AAC密码子(N198)变为GCA密码子(198A)，将AAC密码子(N200)变为TGG密码子(200W)，并且将AAC密码子(N200)变为GGA密码子(200G)，并且将GCC密码子(A199)缺失。

引物F-N198A：

5’-GCTGGGAACCCTCGTCGAACGCAGCCAACACCGGCATTGGA-3’(SEQ ID NO:52)

引物R-N198A：

5’-GTTCGACGAGGGTTCCCAGCCTTCGACGTTTG-3’(SEQ ID NO:53)

引物F-ΔA199：

5’-TGGGAACCCTCGTCGAACAACAACACCGGCATTGGAGGCCAT-3’(SEQ ID NO:54)

引物R-ΔA199：

5’-GTTGTTCGACGAGGGTTCCCAGCCTTCGACG-3’(SEQ ID NO:55)

引物F-N200W：

5’-GAACCCTCGTCGAACAACGCCTGGACCGGCATTGGAGGCCATGG-3’(SEQ ID NO:56)

引物R-N200W：

5’-GGCGTTGTTCGACGAGGGTTCCCAGCCTTCG-3’(SEQ ID NO:57)

引物F-N200G：

5’-GAACCCTCGTCGAACAACGCCGGAACCGGCATTGGAGGCCAT-3’(SEQ ID NO:58)

引物R-N200G：

5’-GGCGTTGTTCGACGAGGGTTCCCAGCCTTCG-3’(SEQ ID NO:59)

通过包含里氏木霉纤维二糖水解酶I基因的pDau109载体的PCR扩增帮助编码野生型里氏木霉纤维二糖水解酶的合成基因的定点诱变：先前将里氏木霉纤维二糖水解酶I基因克隆进Bam HI-Hind III消化的pDau109中，导致里氏木霉纤维二糖水解酶I基因在NA2-tpi双启动子的控制下进行转录。

使用高保真PCR试剂盒通过PCR引入突变。PCR溶液由10μl的5X HF缓冲液、1μl的dNTP(10mM)、0.5μl的DNA聚合酶(0.2单位/μl)、2.5μl的引物F-N198A(10μM)、2.5μl的引物R-N198A(10μM)、10μl的模板DNA(pDAu222-里氏木霉纤维二糖水解酶I，1ng/μl)以及23.5μl的去离子水构成，总体积为50μl。对于GCC缺失(A199*变体)，使用2.5μl的引物F-ΔA199(10μM)、2.5μl的引物R-ΔA199(10μM)。对于ACC至TGG突变(N200W变体)，使用2.5μl引物-F-N200W(10μM)和2.5μl引物R-N200W(10μM)。对于ACC至GGA突变(N200G变体)，使用2.5μl引物-F-N200G(10μM)和2.5μl引物R-N200G(10μM)。

使用PCR System 9700(应用生物系统公司，福斯特城，加州，美国)进行PCR，编程为1个循环，在98℃下持续30秒；和19个循环，每个循环在98℃下持续30秒，在55℃下持续1分钟，以及在72℃下持续4分钟。然后将PCR溶液保持在15℃，直至从PCR仪中移出。

PCR后，将10个单位的Dpn I直接添加至PCR溶液中并在37℃下孵育1小时。然后，根据厂商的方案将1μl的Dpn I处理的PCR溶液转化进ONETOP10F′化学感受态大肠杆菌细胞中，并且将其分散在补充有0.15mg氨比西林/ml的LB板上。在37℃下孵育过夜后，观察到转化体在LB氨比西林板上在选择下生长。将两个转化体在补充有0.15mg氨比西林/ml的LB培养基中进行培养并且使用Spin Miniprep试剂盒分离质粒。

使用应用生物系统3730xl DNA分析仪，用以下所示的载体引物和里氏木霉纤维二糖水解酶I基因特异性引物对分离的质粒测序，以便确定不含PCR错误并且含有所希望的突变的代表性质粒。

引物F-pDau109

5’-CCCTTGTCGATGCGATGTATC-3’(SEQ ID NO:30)

引物F-Central1

5’-CATGTATCGTAAGCTCGCAGTCATCTCC-3’(SEQ ID NO:60)

引物F-Central2

5’-CTTCGTGTCGATGGACGCGG-3’(SEQ ID NO:61)

引物R-Central3

5’-GAACACGAGCCCCTCACTGC-3’(SEQ ID NO:62)

引物R-pDau109

5’-ATCCTCAATTCCGTCGGTCGA-3’(SEQ ID NO:31)

选择一个不含PCR错误并且含有AAC(N198)至GCA(198A)突变的质粒克隆并且将其指定为质粒pN198A。

选择一个不含PCR错误并且含有GCC密码子(A199)至(A199*)缺失突变的质粒克隆并且将其指定为质粒pΔA199。

选择一个不含PCR错误并且含有AAC(N200)至TGG(200W)突变的质粒克隆并且将其指定为质粒pN200W。

选择一个不含PCR错误并且含有AAC(N200)至GGA(200G)突变的质粒克隆并且将其指定为质粒pN200G。

使用引物F-Central1、F-Central2、R-Central3以及R-pDau109对pN198A测序。使用引物F-pDau109、F-Central1、F-Central2、R-Central3以及R-pDau109对pΔA199测序。使用引物F-Central1、F-Central2以及R-pDau109对pN200W测序。使用引物F-Central1、F-Central2以及R-pDau109对pN200G测序。

实例14：里氏木霉纤维二糖水解酶I TC1-111、TC1-116、TC1-61以及TC1-103变体的表达

根据描述于实例6中的方案在米曲霉MT3568中表达质粒pN198A、pΔA199、pN200W以及pN200G。

使用E-Page 8％SDS-PAGE 48孔凝胶和考马斯亮蓝染色通过SDS-PAGE分析验证表达。基于由SDS-PAGE给出的表达水平，为质粒pN198A、pΔA199、pN200W以及pN200G各自选择一个转化体并且将其分别指定为米曲霉ΔA199、N200G、N197A以及N200W。

对于较大规模的生产，将每种米曲霉菌株的孢子分散到COVE蔗糖斜面上并且在37℃下孵育五天。用5ml的0.01％20将每个融合的孢子斜面洗涤两次，以使收集的孢子的数目最大化。然后，使用每种孢子悬浮液接种七个包含150ml的DAP-4C培养基的500ml烧瓶。将培养株在30℃下进行孵育，同时以100rpm进行恒定振荡。在接种后第四天，经由瓶盖MF75 Supor MachV 0.2μm PES过滤器通过过滤收集培养液。使用E-Page8％SDS-PAGE 48孔凝胶和考马斯亮蓝染色通过SDS-PAGE分析验证表达。来自每种米曲霉菌株的培养液都产生了里氏木霉A199*、N200G、N197A以及N200W纤维二糖水解酶变体的大约80kDa的带。

实例16：里氏木霉纤维二糖水解酶I TC1-111、TC1-116、TC1-61以及TC1-103变体的纯化

将发酵液通过具有0.22μm截留的PES瓶顶过滤器(赛默飞世尔科技公司，罗斯基勒，丹麦)进行过滤。向过滤的发酵液中添加硫酸铵，以制备1.8M溶液。

通过HIC/亲和色谱、随后是IEX/亲和色谱纯化发酵液。

在HIC/亲和色谱步骤中，将发酵液施加至用1.8M硫酸铵、25mM HEPES(pH 7.0)平衡的200ml苯基6Fast Flow柱(高分辨率)上。施加样品后，将该柱用2个柱体积的1.8M硫酸铵，随后是1个柱体积的0.54M硫酸铵洗涤。将结合的蛋白用25mM HEPES(pH7.0)分批洗脱。

在280nm下监测蛋白的洗脱。使用12孔4％-12％Bis-Tris凝胶通过SDS-PAGE分析具有280nm高吸光度的级分的纤维二糖水解酶含量。将具有高含量的此蛋白的级分合并并收集，用于进一步纯化。将合并的级分在用25mM MES(pH 6.0)平衡的SEPHADEX^TM G-25(中)柱上脱盐。在280nm下监测蛋白的洗脱并且选择在280nm下具有高吸光度的级分用于第二色谱步骤。

将合并的级分施加至用25mM MES(pH 6.0)平衡的60ml RESOURCE^TM 15Q柱上并且用线性50-300mM氯化钠梯度将结合的蛋白洗脱3个柱体积。在280nm下监测蛋白的洗脱并且在SDS-PAGE上分析在280nm下具有高吸光度的级分。

合并具有高含量的纤维二糖水解酶I的级分。

实例17：在微晶纤维素上测量里氏木霉纤维二糖水解酶I TC1-111、TC1-116、TC1-61以及TC1-103变体的活性

使用洗涤的微晶纤维素(PH101；西格玛-奥德里奇，圣路易斯，密苏里州，美国)作为底物，将纯化的里氏木霉纤维二糖水解酶I TC1-111、TC1-116、TC1-61以及TC1-103变体的活性与纯化的里氏木霉野生型纤维二糖水解酶I进行比较。

通过向离心瓶(1L)中施加180g的微晶纤维素和大约400ml的0.22μm过滤水并混合(手动)而制备洗涤的微晶纤维素。将离心瓶在18℃下以4000rpm离心5分钟(SorvallHereaus Thermoscientific Sorvall Evolution RC超速离心机)。除去上清液并且再次添加400ml的MQ水。将其重复4次。在第4次重复时，在离心之前，将沉淀物与0.22μm过滤水在“Rocker”o/n(IKA KS 130basic)上混合。除去上清液并且将沉淀物用50mM乙酸钠、2mMCaCl₂pH 5缓冲液重悬至终浓度为90g/L。

将纯化的纤维二糖水解酶变体在50mM乙酸钠、2mM CaCl₂(pH 5)中稀释至浓度为9μM。然后，将100μl的稀释的纤维二糖水解酶I变体添加至微量滴定板的每个孔中，随后以90g/升向每个孔中添加200μl的洗涤的微晶纤维素。将微量滴定板迅速转移至恒温混匀仪中并在1100rpm和25℃下孵育1小时。通过使用3s-r离心机(赛默飞世尔科技公司，罗斯基勒，丹麦)在5℃下以3500rpm离心3分钟而终止反应。将五十μl的上清液转移至PCR样品管(0.2ml无裙边96孔PCR板；赛默飞世尔科技公司，罗斯基勒，丹麦)中。将PAHBAH(4-羟基-苯甲酰肼)溶解于缓冲液(0.18M酒石酸钾钠和0.5M NaOH)中，以制备15mg/ml溶液。将七十五μl的PAHBAH溶液添加至PCR样品管中的上清液中。

将PCR样品管放于帕尔帖(Peltier)热循环仪中并在95℃下孵育10分钟并且在20℃下孵育5分钟。孵育后，将100μl转移至96孔微量滴定板中并在410nm下测量吸光度。对于每个运行都包括一个标准品。使用的标准品是在50mM乙酸钠、2mM CaCl₂(pH 5)中稀释至浓度为0.008、0.016、0.0312、0.0625、0.125、0.25、0.5以及1mM的纤维二糖。除标准品之外，每个运行还包括一个空白(不具有纤维二糖水解酶)。对于所有测量值，减去空白测量值。使用这些标准品将吸光度数据标准化为纤维二糖浓度。

如示于图5中的结果证明，与野生型纤维二糖水解酶I相比，纤维二糖水解酶A199*变体针对微晶纤维素的活性增加大约56％。与野生型纤维二糖水解酶I相比，N200G变体的活性增加40％，N198A增加23％并且N200W增加3％。

实例18：预处理的玉米秸杆水解测定

如实例9中所述，在美国能源部国家可再生能源实验室(NREL)预处理玉米秸秆。

通过在剧烈混合下添加10M NaOH将PCS的pH调节至5.0，并且然后在120℃下高压杀菌20分钟来制备未碾磨、未洗涤PCS(全浆料PCS)。全浆料PCS的干重是29％。

通过将具有96个锥形孔的深度1/4英寸的特氟隆板的上表面加工为直径1/4英寸并且将下表面加工为直径1/8英寸而产生一个96孔板。每个孔的中心都在标准96孔微量滴定板的对应孔的中心的等效位置处，在中心上大约23/64英寸。每个孔的所得体积大约是135μl。在下文中，将此96孔铝板称为“填充(fill)板”。通过将适合体积的PCS施加至该板的上表面，然后使用刮刀将该材料铺在表面上并进入洞中，将pH调节的碾磨的未洗涤的PCS用于填充该填充板中的洞。当PCS被挤压通过底表面中的洞时，洞被认为足够满，从而形成面条样管。使用与该填充板表面保持垂直的列装载刮刀(Column Loader Scraper)(密理博，比勒利卡，马萨诸塞州，美国)将过量的PCS从该填充板的顶表面和底表面刮下，使得每个孔中的PCS的表面都与该填充板的表面平齐。然后，将该填充板放在2.2ml深孔板(爱思进，联合市，加州，美国)的顶部，顶表面与该孔板的开口端(例如，该孔板的顶部)相邻，并且将这些孔与该填充板中的PCS填充孔对齐。将该填充板固定在此位置，并且将该装配在Sorvall Legend RT+(赛默科技(ThermoScientific)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)中于2500rpm(1350x g)下离心5分钟。离心后，PCS已经被转移至该深孔板。将3mm玻璃珠(飞世尔科技(Fisher Scientific)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)放置于每个孔中供混合。

在共0.2ml的反应体积中进行PCS的水解。用50mg的不溶性PCS固形物，包含含有1mM硫酸锰和不同酶组合物的不同蛋白负载量(表示为mg蛋白质/克纤维素)的50mM乙酸钠(pH 5.0)缓冲液进行水解。制备酶组合物并且然后将其以从20μl至50μl的范围的体积同时添加至所有的孔中，在每个反应中的终体积为0.2-0.50ml。然后使用ALPS-300^TM板式热封机将板密封，充分混合，并且在特定温度下孵育72小时。一式三份地重复所有报道的实验。

在水解后，使用0.45μm96孔过滤器板过滤样品并且如实例9所述分析滤液的糖含量。

对葡萄糖进行测定。针对适当稀释因子来调节所测量的葡萄糖浓度。通过针对零时间点时未碾磨的未洗涤的PCS中的相应背景葡萄糖浓度调节所测量的葡萄糖浓度来确定从未洗涤的PCS酶促产生的葡萄糖的净浓度。使用MICROSOFT EXCEL^TM软件来进行所有HPLC数据处理。

使用以下等式来计算葡萄糖转化成葡萄糖的程度：％葡萄糖转化＝(葡萄糖浓度)/(限制消化物中的葡萄糖浓度)X 100。为了计算％葡萄糖转化，基于纤维素酶对照(100mg的里氏木霉纤维素酶/克纤维素)设置100％转化点。将三份数据点取平均值并且计算标准差。

实例19：不具有纤维二糖水解酶I的酶组合物#2的制备

如在WO 2011/123450中所述，在米曲霉中重组地制备烟曲霉GH6A纤维二糖水解酶II变体(GENESEQP:AZN71803)。将米曲霉纤维二糖水解酶II的过滤的培养液脱盐并且使用切向流(10K膜，颇尔公司)缓冲液交换进包含100mM氯化钠的50mM乙酸钠(pH 5.0)中。

将米曲霉用作宿主，根据WO 2011/057140重组地制备金黄色嗜热子囊菌GH5内切葡聚糖酶II(GENESEQP:AZI04862)。使用切向流(5K膜，颇尔公司)浓缩金黄色嗜热子囊菌内切葡聚糖酶II的过滤的培养液。使用400ml SEPHADEX^TM G-25柱将浓缩的蛋白脱盐进20mMTris(pH 8.0)中。

如实例10中所披露制备青霉菌属(埃默森青霉)GH61A多肽。

如实例10中所披露制备烟曲霉GH10木聚糖酶(xyn3)。

如实例10所述制备烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶4M突变体。使用微板BCA^TM蛋白测定试剂盒(赛默飞世尔科技，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)确定蛋白浓度，在该试剂盒中将牛血清白蛋白用作蛋白标准品。

如实例10所述制备埃默森篮状菌CBS 393.64β-木糖苷酶。

使用微板BCA^TM蛋白测定试剂盒确定上述每种单组分的蛋白浓度，在该试剂盒中将牛血清白蛋白用作蛋白标准品，青霉菌属(埃默森青霉)GH61A多肽除外，使用理论摩尔消光系数在41730M^-1·cm^-1下对其进行测定。制备一种酶组合物，其由如下各单组分构成：39.7％烟曲霉Cel6A变体纤维二糖水解酶II、15.9％里氏木霉GH5内切葡聚糖酶II、23.8％青霉属(埃默森青霉)GH61A多肽、7.9％烟曲霉GH10木聚糖酶、7.9％烟曲霉β-葡糖苷酶以及4.8％埃默森篮状菌β-木糖苷酶。在此将该酶组合物指定为“不具有纤维二糖水解酶I的纤维素分解酶组合物#2”。

实例20：Rasamsonia emersonii纤维二糖水解酶I的DNA序列信息的来源

野生型Rasamsonia emersonii GH7纤维二糖水解酶I基因的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12中。该基因序列与Genbank条目AF439935.4具有99％一致性。Rasamsonia emersonii纤维二糖水解酶I基因的cDNA序列和推导的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:12中。

基于Rasamsonia emersonii纤维二糖水解酶I的cDNA序列，产生编码全长纤维二糖水解酶I的密码子优化的合成基因，用于米曲霉表达，基于由古斯塔夫松(Gustafsson)等人，2004，生物技术趋势(Trends in Biotechnology)22(7):346-353研发的算法。通过基因合成服务(生命科技公司，圣地亚哥，加州，美国)用5’Bam HI限制酶切位点、3’Hind III限制酶切位点和位于起始密码子和Bam HI限制酶切位点之间的Kozac共有序列(CACC)合成密码子优化的编码序列(SEQ ID NO:64)。

实例21：野生型Rasamsonia emersonii纤维二糖水解酶I的定点诱变

将编码野生型Rasamsonia emersonii纤维二糖水解酶I的密码子优化的合成基因提供于非指定卡那霉素抗性大肠杆菌克隆载体中。

为了产生R.emersonii纤维二糖水解酶I PC1-146变体(SEQ ID NO:65用于突变体DNA序列；并且SEQ ID NO:66用于变体)，将AAC密码子(N194)替换为GCA密码子(194A)并且将AAC密码子(N197)替换为GCA密码子(197A)。

使用SOE引物设计工具，如下所示，为定点诱变设计两个合成引物。引入的定点突变将AAC密码子(N194)变为GCA密码子(194A)并且将AAC密码子(N197)变为GCA密码子(197A)。

引物F-N194A N197A：

5’-AAGGATGGCAGCCCTCGTCCGCAAACGCGGCAACTGGCATCGGTGATCAC-3’(SEQ ID NO:67)

引物R-N194A N197A：

5’-GGACGAGGGCTGCCATCCTTCCACGTTCGC-3’(SEQ ID NO:68)

通过包含被指定为pDau222-R.emersonii纤维二糖水解酶I的R.emersonii纤维二糖水解酶I基因的pDau109载体的PCR扩增帮助编码野生型R.emersonii纤维二糖水解酶I的合成基因的定点诱变。先前将R.emersonii纤维二糖水解酶I基因克隆进Bam HI-Hind III消化的pDau109中，导致R.emersonii纤维二糖水解酶I基因在NA2-tpi双启动子的控制下进行转录。

使用高保真PCR试剂盒通过PCR引入突变。PCR溶液由10μl的5X HF缓冲液、1μl的dNTP(10mM)、0.5μl的DNA聚合酶(0.2单位/μl)、0.25μl的引物F-N194A N197A(100μM)、0.25μl的引物R-N194A N197A(100μM)、10μl的模板DNA(pDau222-R.emersonii纤维二糖水解酶I，1ng/μl)以及28μl的去离子水构成，总体积为50μl。使用PCR System 9700(应用生物系统公司，福斯特城，加州，美国)进行PCR，编程为1个循环，在98℃下持续30秒；和19个循环，每个循环在98℃下持续30秒，在55℃下持续1分钟，以及在72℃下持续4分钟。然后将PCR溶液保持在8℃，直至从PCR仪中移出。

PCR后，将10个单位的Dpn I直接添加至PCR溶液中并在37℃下孵育1小时。然后，根据厂商的方案将1μl的Dpn I处理的PCR溶液转化进ONETOP10F′化学感受态大肠杆菌细胞中，并且将其分散在补充有0.15mg氨比西林/ml的LB板上。在37℃下孵育过夜后，观察到转化体在LB氨比西林板上在选择下生长。将四个转化体在补充有0.15mg氨比西林/ml的LB培养基中进行培养并且使用Spin Miniprep试剂盒分离质粒。

使用应用生物系统3730xl DNA分析仪，用以下所示的载体引物和R.emersonii纤维二糖水解酶I基因特异性引物对分离的质粒测序，以便确定不含PCR错误并且含有所希望的突变的代表性质粒。

引物F-pDau109

5’-CCACACTTCTCTTCCTTCCTCAATCCTC-3’(SEQ ID NO:69)

引物F-Central1

5’-GTGAGGCGAACGTGGAAGGATG-3’(SEQ ID NO:70)

引物R-Central2

5’-gtacctgtgtccgtgccgtcatctg-3’(SEQ ID NO:71)

引物R-pDau109

5’-ATCCTCAATTCCGTCGGTCGA-3’(SEQ ID NO:31)

选择一个不含PCR错误并且含有AAC(N194)至GCA(194A)突变和AAC(N197)至GCA(197A)突变的质粒克隆并且将其指定为质粒pE146。在此将该变体指定为PC1-146。

实例22：包含编码纤维二糖水解酶I的Rasamsonia emersoniic DNA序列的米曲霉表达载体的构建

根据厂商的说明书，用Fast Digest Bam HI和Hind III(菲门特斯公司，格伦伯尼，马里兰州，美国)消化由基因合成提供的编码Rasamsonia emersonii纤维二糖水解酶I的卡那霉素抗性大肠杆菌克隆载体。使用TAE缓冲液，通过1.0％琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶切下1375bp产物带，并且使用ILLUSTRA^TM GFX^TM DNA纯化试剂盒进行纯化。

然后，使用T4 DNA连接酶将1375bp片段克隆进用Bam HI和Hind III消化的pDau109中。将Bam HI-Hind III消化的pDau109和含有里氏木霉纤维二糖水解酶I编码序列的Bam HI/Hind III片段以1:3的摩尔比混合(即，质量比大约2.5:1或20ng:50ng)并且根据厂商的说明书，在具有1mM ATP的1X T4 DNA连接酶缓冲液中，在16℃下，用50单位的T4 DNA连接酶连接过夜。将Rasamsonia emersonii纤维二糖水解酶I基因克隆进Bam HI-Hind III消化的pDau109中导致Rasamsonia emersonii纤维二糖水解酶I基因在NA2-tpi双启动子的控制下进行转录。

根据厂商的方案，将连接混合物转化进ONETOP10F′化学感受态大肠杆菌细胞中，并且将其分散在补充有0.1mg氨比西林/ml的LB板上。在37℃下孵育过夜后，观察到转化体在LB氨比西林板上在选择下生长。使用引物F-pDau109和R-pDau109，如下所述，在转化体上通过PCR验证Rasamsonia emersonii纤维二糖水解酶I基因***进pDau109中。

将1.1X预混合液(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific)，罗斯基勒，丹麦)用于PCR。PCR溶液由10μl的1.1X预混合液、0.5μl的引物F-pDau109(10μM)和0.5μl的引物R-pDau109(10μM)构成。使用牙签将少量的细胞转移至PCR溶液中。使用PTC-200DNA引擎进行PCR，编程为1个循环，在94℃下持续3分钟；30个循环，每个循环在94℃下持续30秒，在50℃下持续1分钟，以及在72℃下持续2分钟；以及1个循环，在72℃下持续1分钟。然后将PCR溶液保持在15℃，直至从PCR仪中移出。

使用TAE缓冲液，通过1.0％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，其中观察到一个1600bpPCR产物带，从而证实Rasamsonia emersonii纤维二糖水解酶I编码序列***进pDau109中。

将含有Rasamsonia emersonii纤维二糖水解酶I质粒构建体的大肠杆菌转化体在补充有0.1mg的氨比西林/ml的LB培养基中进行培养并且使用Spin Miniprep试剂盒分离质粒DNA。将该质粒指定为pKHJN0135。

实例23：野生型Rasamsonia emersonii纤维二糖水解酶I的表达

根据克里斯滕森(Christensen)等人，1988，见上文和WO 2004/032648，将表达质粒pKHJN0135转化进米曲霉MT3568原生质体中。根据EP 0238023B1，第14-15页的方法制备米曲霉MT3568原生质体。

在使转化体在PDA板上形成孢子之前，在COVE蔗糖板上通过单一的分生孢子纯化转化体。将转化体的孢子接种进包含0.75ml的YP+2％葡萄糖培养基的96深孔板中并且在30℃下静止孵育4天。从96深孔培养的培养上清液分析转化体的Rasamsonia emersonii纤维二糖水解酶I的产生。使用E-Page8％SDS-PAGE 48孔凝胶和考马斯亮蓝染色通过SDS-PAGE分析验证表达。基于由SDS-PAGE给出的表达水平，选择一个转化体用于进一步工作并且将其指定为米曲霉ReCBH I。

用于较大规模的生产，将米曲霉ReCBH I孢子分散到COVE蔗糖斜面上并且在37℃下孵育五天。用5ml的0.01％20将融合的孢子斜面洗涤两次，以使收集的孢子的数目最大化。然后，使用孢子悬浮液接种七个包含150ml的DAP-4C培养基的500ml烧瓶。将培养株在30℃下进行孵育，同时以100rpm进行恒定振荡。在接种后第四天，经由瓶盖MF75Supor MachV 0.2μm PES过滤器通过过滤收集培养液。使用E-Page 8％SDS-PAGE48孔凝胶和考马斯亮蓝染色通过SDS-PAGE分析验证表达。来自米曲霉ReCBH I的培养液产生了Rasamsonia emersonii纤维二糖水解酶I的大约60kDa的带。

对于较大规模的生产，将米曲霉ReCBH I孢子分散到COVE蔗糖斜面上并且在37℃下孵育五天。用5ml G2-Gly培养基将融合的孢子斜面洗涤两次。然后，使用孢子悬浮液接种包含150ml的G2-Gly培养基的500ml烧瓶。将预培养物在30℃下进行孵育，同时以150rpm进行恒定振荡。一天后，使用每种预培养物接种四个包含150ml DAP4C-1培养基的500ml烧瓶。在接种后第四天，经由瓶盖MF75 Supor MachV 0.2μm PES过滤器通过过滤收集培养液。

实例24：Rasamsonia emersonii纤维二糖水解酶I PC1-146变体的表达

根据克里斯滕森(Christensen)等人，1988，见上文和WO 2004/032648，将表达质粒pE146转化进米曲霉MT3568原生质体中。根据EP 0238023B1，第14-15页的方法制备米曲霉MT3568原生质体。

在不具有CsCl的COVE蔗糖板上通过单一的分生孢子纯化转化体。将转化体的孢子接种进包含0.50ml的YP+2％麦芽糖培养基的96深孔板中并且在34℃下静止孵育6天。从96深孔培养的培养上清液分析转化体的R.emersonii纤维二糖水解酶I PC1-146变体的产生。通过测量由微晶纤维素的水解释放的还原糖验证表达。在25℃和1100rpm下，在96孔微量滴定板(NUNC赛默飞世尔科技公司，罗斯基勒，丹麦)中进行水解。每种水解反应混合物都包含50mM乙酸钠(pH 5.0)中的90g/升的167μl的微晶纤维素、0.01％X-100、20μl的培养上清液以及63μl的50mM乙酸钠(pH 5.0)、0.01％X-100。将板用胶带密封。通过将板以3500rpm旋转3分钟而终止水解反应。然后，向96孔PCR板(赛默飞世尔科技公司，罗斯基勒，丹麦)中的75μl终止溶液中添加50μl的反应上清液。终止溶液由2％(w/v)NaOH中的15mg/ml 4-羟基苯甲酰肼(西格玛化学有限公司，圣路易斯，密苏里州，美国)、50mg/ml酒石酸钾钠(西格玛化学有限公司，圣路易斯，密苏里州，美国)构成。将板用盖密封并且将混合物在95℃下孵育10分钟并且在20℃下孵育5分钟。然后，将100μl转移至微量滴定板中并且使用Plus 384(分子设备公司(Molecular Devices)，森尼韦尔，加州，美国)测量410nm下的吸光度。还原糖的浓度与氧化的4-羟基苯甲酰肼在410nm下的吸光度成比例。通过向96孔PCR板中的75μl的终止溶液和46μl的milliQ水的混合物中添加4μl的培养上清液而测量培养上清液中的还原糖含量。将板用盖密封并且将混合物在95℃下孵育10分钟并且在20℃下孵育5分钟。然后，将100μl转移至微量滴定板中并在410nm下测量吸光度。从410nm下的水解反应的吸光度中减去来自细胞培养上清液的410nm下的吸光度，以测量由这些酶释放的还原糖的量。

基于微晶纤维素的水解程度，选择一个转化体并且将其指定为米曲霉PC1-146。

对于较大规模的生产，将米曲霉PC1-146孢子分散到COVE蔗糖斜面上并且在37℃下孵育五天。用5ml的G2-Gly培养基将融合的孢子斜面洗涤两次。然后，使用孢子悬浮液接种包含150ml的G2-Gly培养基的500ml烧瓶。将预培养物在30℃下进行孵育，同时以150rpm进行恒定振荡。一天后，使用每种预培养物接种四个包含150ml的DAP-4C培养基的500ml烧瓶。在接种后第四天，经由瓶盖MF75 Supor MachV 0.2μm PES过滤器通过过滤收集培养液。

实例25：Rasamsonia emersonii野生型纤维二糖水解酶I和R.emersonii纤维二糖水解酶I PC1-146变体的纯化

将发酵液通过具有0.22μm截留的PES瓶顶过滤器进行过滤。向过滤的发酵液中添加硫酸铵至浓度为1.8M。通过HIC/亲和色谱、随后是IEX/亲和色谱纯化发酵液。

在HIC/亲和色谱步骤中，将发酵液施加至用1.8M硫酸铵、25mM HEPES(pH 7.0)平衡的200ml苯基6Fast Flow柱(高分辨率)上。施加样品后，将该柱用2个柱体积的1.8M硫酸铵，随后是1个柱体积的0.54M硫酸铵洗涤。将结合的蛋白用25mM HEPES(pH7.0)分批洗脱。

在280nm下监测蛋白的洗脱。使用12孔4％-12％Bis-Tris凝胶通过SDS-PAGE分析具有280nm高吸光度的级分的纤维二糖水解酶含量。将具有高含量的蛋白的级分合并并收集，用于进一步纯化。将合并的级分在用25mM MES(pH 6.0)平衡的SEPHADEX^TMG-25(中)柱上脱盐。在280nm下监测蛋白的洗脱并且选择在280nm下具有高吸光度的级分用于第二色谱步骤。

将合并的级分施加至用25mM MES(pH 6.0)平衡的60ml RESOURCE^TM 15Q柱上，并且用1.5个柱体积的线性100-200mM氯化钠梯度、随后是1.5个柱体积的300mM氯化钠并且随后是1.5个柱体积的1M氯化钠洗脱结合的蛋白。在280nm下监测蛋白的洗脱并且在SDS-PAGE上分析在280nm下具有高吸光度的级分。合并具有高含量的纤维二糖水解酶I的级分。

实例26：在微晶纤维素上测量Rasamsonia emersonii纤维二糖水解酶I PC1-146变体的活性

使用洗涤的微晶纤维素(PH101；西格玛-奥德里奇，圣路易斯，密苏里州，美国)作为底物，将纯化的R.emersonii纤维二糖水解酶I PC1-146变体的活性与纯化的里氏木霉野生型纤维二糖水解酶I进行比较。

将纯化的纤维二糖水解酶变体在50mM乙酸钠、2mM CaCl₂(pH 5)中稀释至浓度为0.4μM。然后，将50μl的稀释的纤维二糖水解酶I变体添加至微量滴定板的每个孔中，随后以90g/升向每个孔中添加200μl的洗涤的微晶纤维素。将微量滴定板迅速转移至恒温混匀仪中并在1100rpm和50℃下孵育1小时。通过使用3s-r离心机在5℃下以3500rpm离心3分钟而终止反应。将五十μl的上清液转移至PCR样品管(0.2ml无裙边96孔PCR板)中。将PAHBAH(4-羟基-苯甲酰肼)溶解于缓冲液(0.18M酒石酸钾钠和0.5MNaOH)中，以制备15mg/ml溶液。将七十五μl的PAHBAH溶液添加至PCR样品管中的上清液中。

将PCR样品管放于帕尔帖热循环仪中并在95℃下孵育10分钟并且在20℃下孵育5分钟。孵育后，将100μl转移至96孔微量滴定板中并在410nm下测量吸光度。对于每个运行都包括一个标准品。使用的标准品是在50mM乙酸钠、2mM CaCl₂(pH 5)中稀释至浓度为0.008、0.016、0.0312、0.0625、0.125、0.25、0.5以及1mM的纤维二糖。除标准品之外，每个运行还包括一个空白(不具有纤维二糖水解酶)。对于所有测量值，减去空白测量值。使用这些标准品将吸光度数据标准化为纤维二糖浓度。

如示于图6中的结果证明，与R.emersonii野生型纤维二糖水解酶I相比，R.emersonii纤维二糖水解酶I PC1-146变体对微晶纤维素的活性增加大约17％。

实例27：通过差示扫描量热法测定Rasamsonia emersonii纤维二糖水解酶I PC1-146变体的Td。

如实例12所述，使用VP-毛细管差示扫描量热仪通过差示扫描量热法(DSC)测定R.emersonii纤维二糖水解酶I PC1-146变体的热稳定性。

结果证明，与其R.emersonii纤维二糖水解酶I PC1-146变体的78℃相比，R.emersonii野生型纤维二糖水解酶I的Td为78℃。

实例28：Rasamsonia emersonii纤维二糖水解酶I PC1-146变体和Rasamsoniaemersonii野生型纤维二糖水解酶I对纤维素酶组合物水解未洗涤的PCS的影响的比较

使用未碾磨的未洗涤PCS作为底物，在25℃下，向不具有纤维二糖水解酶I的纤维素分解酶组合物#2(实例19)中添加R.emersonii纤维二糖水解酶I PC1-146变体和R.emersonii野生型纤维二糖水解酶I。对于处于8％总固形物的水解而言，单独地以2.22mg酶蛋白/g纤维素向不具有纤维二糖水解酶I的纤维素酶组合物#2的3.78mg酶蛋白/g纤维素中添加每种纤维二糖水解酶I。对于处于20％总固形物的水解而言，单独地以4.44mg酶蛋白/g纤维素向不具有纤维二糖水解酶I的纤维素酶组合物#2的7.56mg酶蛋白/g纤维素中添加每种纤维二糖水解酶I。

如在实例18中所描述进行该测定。将具有未碾磨的未洗涤的PCS(8％和20％总固形物)的反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠(pH 5.0)缓冲液中进行24、48和72小时。一式四份地进行所有反应并且贯穿整个水解在200rpm下进行振荡。

示于图7(8％总固形物)和图8(20％总固形物)中的结果证明，在第24、48和72小时，包括R.emersonii纤维二糖水解酶I PC1-146变体的纤维素酶组合物具有显著高于包括R.emersonii野生型纤维二糖水解酶I的纤维素酶组合物的纤维素转化。

实例29：水解过程中Rasamsonia emersonii纤维二糖水解酶I PC1-146变体与Rasamsonia emersonii野生型纤维二糖水解酶I的比较

在20％TS的未碾磨的未洗涤的PCS上对R.emersonii纤维二糖水解酶I PC1-146变体和R.emersonii野生型纤维二糖水解酶I进行评估。酶基质设计示于下表1中。HTec3获得自诺维信公司，巴格斯瓦尔德，丹麦。在32℃下进行酶水解3天和5天。通过HPLC(1200系列LC系统，安捷伦科技公司(Agilent Technologies Inc.)，帕洛阿尔托，加州，美国)分析释放的糖，该HPLC配备有一个Rezex ROA-有机酸H⁺柱(8％)(7.8x 300mm)(菲罗门公司(Phenomenex Inc.)，托伦斯，加州，美国)、0.2mm线内过滤器、一个自动取样器、一个梯度泵以及一个屈光指数检测器。使用的流动相是处于0.9ml/min的流速的5mM硫酸。将不同浓度的葡萄糖用作标准品。

如示于图9中的结果证明，R.emersonii纤维二糖水解酶I PC1-146变体表现好于野生型R.emersonii纤维二糖水解酶I。

表1

实例30：同时糖化和发酵(SSF)过程中Rasamsonia emersonii纤维二糖水解酶IPC1-146变体与Rasamsonia emersonii野生型纤维二糖水解酶I的比较

实验设计与实例29所示相同，除了在水解开始时与酶一起添加1g/升的红星(RED)酵母和2g/升的尿素之外。使用描述于实例29中的系统通过HPLC分析乙醇释放。将不同浓度的乙醇用作标准品。

如示于图10中的结果证明，在SSF过程中，R.emersonii纤维二糖水解酶I PC1-146变体表现好于野生型R.emersonii纤维二糖水解酶I。

实例31：用来自里氏木霉纤维二糖水解酶I的接头和碳水化合物结合模块构建Rasamsonia emersonii融合纤维二糖水解酶I

编码里氏木霉(红褐肉座菌)纤维二糖水解酶I的密码子优化的合成基因描述于实例1中。

编码R.emersonii纤维二糖水解酶I的密码子优化的合成基因描述于实例20中。

为了用来自里氏木霉纤维二糖水解酶I的接头和碳水化合物结合模块(CBM)产生编码R.emersonii融合纤维二糖水解酶I的基因(SEQ ID NO:72用于融合蛋白DNA序列；并且SEQ ID NO:73用于融合蛋白)，使用剪接重叠延伸(SOE)PCR将编码里氏木霉纤维二糖水解酶I接头和CBM的DNA片段装配到编码R.emersonii纤维二糖水解酶I的基因的3’-端。

使用下示引物F-SOE和引物R-pDau109扩增编码里氏木霉纤维二糖水解酶I接头和CBM的DNA片段。

引物F-SOE

5’-

GGTCCCATCAACTCGACATTCACAGCCTCGGGTGGAAACCCTCCTGGCGGAAACCCTC-3’SE(Q IDNO:74)

引物R-pDau109

5’-ATCCTCAATTCCGTCGGTCGA-3’(SEQ ID NO:31)

引物F-pDau109

5’-CCACACTTCTCTTCCTTCCTCAATCCTC-3’(SEQ ID NO:69)

使用高保真PCR试剂盒扩增编码里氏木霉纤维二糖水解酶1接头和CBM的DNA片段。PCR溶液由10μl的5X HF缓冲液、1μl的dNTP(10mM)、0.5μl的DNA聚合酶(0.2单位/μl)、0.25μl的引物F-SOE(100μM)、0.25μl的引物R-pDau109(100μM)、10μl的模板DNA(pDAu222-里氏木霉纤维二糖水解酶I，1ng/μl)以及28μl的去离子水构成，总体积为50μl。使用PCR系统9700进行PCR，编程为1个循环，在98℃下持续30秒；和30个循环，每个循环在98℃下持续10秒，在55℃下持续30秒，以及在72℃下持续1分钟。然后将PCR溶液保持在8℃，直至从PCR仪中移出。

使用TAE缓冲液使PCR溶液经受1％琼脂糖凝胶电泳，其中从凝胶上切下编码里氏木霉接头和CBM的405bp PCR片段并使用MinElute凝胶提取试剂盒(凯杰公司，巴伦西亚，加州，美国)进行纯化。

使用以上引物F-pDau109和引物R-pDau109扩增编码R.emersonii纤维二糖水解酶I的DNA片段。

使用高保真PCR试剂盒扩增编码R.emersonii野生型纤维二糖水解酶1的DNA片段。PCR溶液由10μl的5X HF缓冲液、1μl的dNTP(10mM)、0.5μl的DNA聚合酶(0.2单位/μl)、0.25μl的引物F-pDAu109(100μM)、0.25μl的引物R-pDau109(100μM)、10μl的模板DNA(pDAu222-R.emersonii纤维二糖水解酶I，1ng/μl)以及28μl的去离子水构成，总体积为50μl。使用PCR系统9700进行PCR，编程为1个循环，在98℃下持续30秒；和30个循环，每个循环在98℃下持续10秒，在55℃下持续30秒，以及在72℃下持续1分钟。然后将PCR溶液保持在8℃，直至从PCR仪中移出。

使用TAE缓冲液使PCR溶液经受1％琼脂糖凝胶电泳，其中从凝胶上切下编码R.emersonii野生型纤维二糖水解酶I的1600bp片段并使用MinElute凝胶提取试剂盒进行纯化。

使用SOE PCR和高保真PCR试剂盒装配两个纯化的DNA片段。PCR溶液由10μl的5X HF缓冲液、1μl的dNTP(10mM)、0.5μl的DNA聚合酶(0.2单位/μl)、0.25μl的引物F-pDAu109(100μM)、10μl的编码里氏木霉纤维二糖水解酶1接头和CBM的凝胶纯化的片段、2μl的编码R.emersonii纤维二糖水解酶I的DNA片段以及26μl的去离子水构成，总体积为50μl。使用PCR系统9700进行PCR，编程为1个循环，在98℃下持续30秒；和30个循环，每个循环在98℃下持续20秒，在55℃下持续30秒，以及在72℃下持续1分钟。然后将PCR溶液保持在8℃，直至从PCR仪中移出。

然后，如下用Bam HI(新英格兰生物实验室，伊普斯威奇，马萨诸塞州，美国)和Hind III(新英格兰生物实验室，伊普斯威奇，马萨诸塞州，美国)消化PCR产生的DNA片段。将四十μl的PCR产物与5μl缓冲液2(新英格兰生物实验室，伊普斯威奇，马萨诸塞州，美国)、1μl的Bam HI和1μl的Hind III混合并在37℃下孵育4小时。使用TAE缓冲液，使所得PCR产物经受1％琼脂糖凝胶电泳。从凝胶切下大约1567bp的带并使用MinElute凝胶提取试剂盒进行纯化。

使用T4 DNA连接酶将编码具有来自里氏木霉纤维二糖水解酶I的接头和碳水化合物结合模块(CBM)的R.emersonii纤维二糖水解酶I的纯化的1567bp片段克隆进用Bam HI和Hind III消化的pDAu109中。将Bam HI-Hind III消化的pDau109和包含具有来自里氏木霉纤维二糖水解酶I编码序列的接头和碳水化合物结合模块(CBM)的R.emersonii纤维二糖水解酶I的Bam HI/Hind III片段以1:3的摩尔比混合(即，等体积的凝胶纯化的产物)并且在具有1mM ATP的1X T4 DNA连接酶缓冲液中用50单位的T4 DNA连接酶连接并在22℃下孵育10分钟。

根据厂商的方案，将连接混合物转化进ONETOP10F′化学感受态大肠杆菌细胞中，并且将其分散在补充有0.1mg氨比西林/ml的LB板上。在37℃下孵育过夜后，观察到转化体在LB氨比西林板上在选择下生长。将两个转化体在补充有0.15mg氨比西林/ml的LB培养基中进行培养并且使用Spin Miniprep试剂盒分离质粒。

通过测序验证编码具有来自里氏木霉纤维二糖水解酶I的接头和碳水化合物结合模块(CBM)的R.emersonii纤维二糖水解酶I的DNA片段***pDAu109中。使用应用生物系统3730xl DNA分析仪，用载体引物F-pDau109和R-pDau109对分离的质粒测序，以便确定不含PCR错误并且含有正确***的代表性质粒。

选择一个不含PCR错误并且含有编码具有来自里氏木霉纤维二糖水解酶I的接头和碳水化合物结合模块(CBM)的R.emersonii纤维二糖水解酶I的DNA片段的质粒克隆并将其指定为质粒pE147。在此将该融合纤维二糖水解酶I指定为PC1-147。

实例32：Rasamsonia emersonii PC1-147融合纤维二糖水解酶I的定点诱变

将编码R.emersonii PC1-147融合纤维二糖水解酶I的融合蛋白基因提供于pE147中。

为了产生R.emersonii PC1-147融合纤维二糖水解酶I的变体(SEQ ID NO:75用于突变体DNA序列；并且SEQ ID NO:76用于变体)，将编码R.emersonii PC1-147融合纤维二糖水解酶I的基因中的AAC密码子(N194)替换为GCA密码子(194A)并且将AAC密码子(N197)替换为GCA密码子(197A)。

使用SOE引物设计工具，如下所示，为定点诱变设计两个合成引物。引入的定点突变将AAC密码子(N194)变为GCA密码子(194A)并且将AAC密码子(N197)变为GCA密码子(197A)。

引物F-N194A N197A：

5’-AAGGATGGCAGCCCTCGTCCGCAAACGCGGCAACTGGCATCGGTGATCAC-3’(SEQ ID NO:67)

引物R-N194A N197A：

5’-GGACGAGGGCTGCCATCCTTCCACGTTCGC-3’(SEQ ID NO:68)

通过含有R.emersonii PC1-147融合纤维二糖水解酶I基因的pDau109载体的PCR扩增帮助R.emersonii PC1-147融合纤维二糖水解酶I基因的定点诱变。先前将R.emersonii PC1-147融合纤维二糖水解酶I基因克隆进Bam HI-Hind III消化的pDau109中，导致R.emersonii PC1-147融合纤维二糖水解酶I基因在NA2-tpi双启动子的控制下进行转录。

使用高保真PCR试剂盒通过PCR引入突变。PCR溶液由10μl的5X HF缓冲液、1μl的dNTP(10mM)、0.5μl的DNA聚合酶(0.2单位/μl)、0.25μl的引物F-N194A N197A(100μM)、0.25μl的引物R-N194A N197A(100μM)、10μl的质粒pE147DNA(1ng/μl)以及28μl的去离子水构成，总体积为50μl。使用PCR系统9700进行PCR，编程为1个循环，在98℃下持续30秒；和19个循环，每个循环在98℃下持续30秒，在55℃下持续1分钟，以及在72℃下持续4分钟。然后将PCR溶液保持在8℃，直至从PCR仪中移出。

PCR后，将10个单位的Dpn I直接添加至PCR溶液中并在37℃下孵育1小时。然后，根据厂商的方案将1μl的Dpn I处理的PCR溶液转化进ONETOP10F′化学感受态大肠杆菌细胞中，并且将其分散在补充有0.15mg氨比西林/ml的LB板上。在37℃下孵育过夜后，观察到转化体在LB氨比西林板上在选择下生长。将四个转化体在补充有0.15mg氨比西林/ml的LB培养基中进行培养并且使用Spin Miniprep试剂盒分离质粒。

使用应用生物系统3730xl DNA分析仪，用引物F-pDau109、F-Central1、R-Central2以及R-pDau109对分离的质粒测序，以便确定不含PCR错误并且含有所希望的突变的代表性质粒。

引物F-pDau109

5’-CCACACTTCTCTTCCTTCCTCAATCCTC-3’(SEQ ID NO:69)

引物F-Central1

5’-GTGAGGCGAACGTGGAAGGATG-3’(SEQ ID NO:70)

引物R-Central2

5’-gtacctgtgtccgtgccgtcatctg-3’(SEQ ID NO:71)

引物R-pDau109

5’-ATCCTCAATTCCGTCGGTCGA-3’(SEQ ID NO:31)

选择一个不含PCR错误并且含有AAC(N194)至GCA(194A)突变和AAC(N197)至GCA(197A)突变的质粒克隆并且将其指定为质粒pE378。在此将该变体指定为PC1-378。

实例33：Rasamsonia emersonii PC1-147融合纤维二糖水解酶I和R.emersonii纤维二糖水解酶I PC1-378变体的表达

根据克里斯滕森(Christensen)等人，1988，见上文和WO 2004/032648，将表达质粒pE147和pE378转化进米曲霉MT3568原生质体中。根据EP 0238023B1，第14-15页的方法制备米曲霉MT3568原生质体。

在不具有CsCl的COVE蔗糖板上通过单一的分生孢子纯化转化体。将转化体的孢子接种进包含0.50ml YP+2％麦芽糖+0.5％葡萄糖培养基的96深孔板中并且在34℃下静止孵育6天。从96深孔培养的培养上清液分析转化体的R.emersonii PC1-147融合纤维二糖水解酶I和R.emersonii纤维二糖水解酶I PC1-378变体的产生。根据描述于实例24中的程序，通过测量由微晶纤维素的水解释放的还原糖而验证表达。

基于微晶纤维素的水解程度，为R.emersonii PC1-147融合纤维二糖水解酶I和R.emersonii纤维二糖水解酶I PC1-378变体选择一个转化体并将其分别指定为米曲霉PC1-147和米曲霉PC1-378。

对于较大规模的生产，将米曲霉PC1-147或米曲霉PC1-378孢子分散到COVE蔗糖斜面上并且在37℃下孵育五天。用5ml的G2-Gly培养基将融合的孢子斜面洗涤两次。然后，使用孢子悬浮液接种包含150ml的G2-Gly培养基的500ml烧瓶。将预培养物在30℃下进行孵育，同时以150rpm进行恒定振荡。一天后，使用每种预培养物接种四个包含150ml的DAP-4C培养基的500ml烧瓶。在接种后第四天，经由瓶盖MF75 Supor MachV 0.2μm PES过滤器通过过滤收集培养液。

实例34：Rasamsonia emersonii PC1-147融合纤维二糖水解酶I和R.emersonii纤维二糖水解酶I PC1-378变体的纯化

将发酵液通过具有0.22μm截留的PES瓶顶过滤器进行过滤。向过滤的发酵液中添加硫酸铵至浓度为1.8M。

通过HIC/亲和色谱、随后是IEX/亲和色谱纯化发酵液。

在HIC/亲和色谱步骤中，将发酵液施加至已经用1.8M硫酸铵、25mM HEPES(pH7.0)预平衡的200ml苯基6Fast Flow柱(高分辨率)上。施加样品后，将该柱用2个柱体积的1.8M硫酸铵，随后是1个柱体积的0.54M硫酸铵洗涤。将结合的蛋白用25mMHEPES(pH 7.0)分批洗脱。

在280nm下监测蛋白的洗脱。使用12孔4％-12％Bis-Tris凝胶在SDS-PAGE上分析具有280nm高吸光度的级分的纤维二糖水解酶I含量。将具有高含量的此蛋白的级分合并并收集，用于进一步纯化。将合并的级分在用25mM MES(pH 6.0)平衡的SEPHADEX^TMG-25(中)柱上脱盐。在280nm下监测蛋白的洗脱并且选择在280nm下具有高吸光度的级分用于第二色谱步骤。

将合并的级分施加至用25mM MES(pH 6.0)平衡的60ml RESOURCE^TM 15Q柱上，并且用1.5柱体积的线性100-200mM氯化钠梯度、随后是1.5柱体积的300mM氯化钠，随后是1.5柱体积的1M氯化钠洗脱结合的蛋白。在280nm下监测蛋白的洗脱并且在SDS-PAGE上分析在280nm下具有高吸光度的级分。

合并具有高含量的纤维二糖水解酶I的级分。

实例35：在微晶纤维素上测量Rasamsonia emersonii PC1-147融合纤维二糖水解酶I和R.emersonii纤维二糖水解酶I PC1-378变体的活性

根据实例26，将洗涤的微晶纤维素用作底物，将纯化的R.emersonii PC1-147融合纤维二糖水解酶I和R.emersonii纤维二糖水解酶I PC1-378变体(实例34)的活性与纯化的野生型R.emersonii纤维二糖水解酶I(实例25)进行比较。将值以相对活性示出，其中100％被设置为R.emersonii野生型纤维二糖水解酶I的活性。测定条件为在pH 5、50℃和1100rpm下孵育24小时。

如示于图11中的结果证明，与R.emersonii野生型纤维二糖水解酶I相比，R.emersonii PC1-147融合纤维二糖水解酶I和R.emersonii纤维二糖水解酶I PC1-378变体对微晶纤维素的活性分别增加大约22％和44％。

通过以下编号的段落进一步描述本发明：

[1]一种纤维二糖水解酶变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置197、198、199及200的一个或多个位置处包括一个改变，其中对应于位置197、198和200的一个或多个位置处的改变是一个取代并且对应于位置199的位置处的改变是一个缺失，其中该变体具有纤维二糖水解酶活性，并且其中该变体与亲本纤维二糖水解酶的成熟多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％序列一致性。

[2]如段落1所述的变体，其中该亲本纤维二糖水解酶选自下组，该组由以下各项组成：(a)一种与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22的成熟多肽具有至少60％序列一致性的多肽；(b)一种由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严格条件下与SEQID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交；(c)一种由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21的成熟多肽编码序列具有至少60％一致性；以及(d)SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22的成熟多肽的一个片段，该片段具有纤维二糖水解酶活性。

[3]如段落2所述的变体，其中该亲本纤维二糖水解酶与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、或SEQ ID NO:22的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。

[4]如段落2或3所述的变体，其中该亲本纤维二糖水解酶由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、或SEQ ID NO:21的成熟多肽编码序列；或其全长互补体杂交。

[5]如段落2-4中任一项所述的变体，其中该亲本纤维二糖水解酶由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、或SEQ ID NO:21的成熟多肽编码序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。

[6]如段落2-5中任一项所述的变体，其中该亲本纤维二糖水解酶包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、或SEQ ID NO:22的成熟多肽或由其组成。

[7]如段落2-6中任一项所述的变体，其中该亲本纤维二糖水解酶是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、或SEQ ID NO:22的成熟多肽的一个片段，其中该片段具有纤维二糖水解酶活性。

[8]如段落1-7中任一项所述的变体，该变体与该亲本纤维二糖水解酶或其成熟多肽的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％序列一致性。

[9]如段落1-8中任一项所述的变体，其中这些改变的数目是1-4个，例如，1、2、3以及4个改变。

[10]如段落1-9中任一项所述的变体，该变体在对应于位置197的位置处包括一个取代。

[11]如段落10所述的变体，其中该取代是用Ala进行的。

[12]如段落1-11中任一项所述的变体，该变体在对应于位置198的位置处包括一个取代。

[13]如段落12所述的变体，其中该取代是用Ala进行的。

[14]如段落1-13中任一项所述的变体，该变体在对应于位置200的位置处包括一个取代。

[15]如段落14所述的变体，其中该取代是用Ala、Gly或Trp进行的。

[16]如段落1-15中任一项所述的变体，该变体在对应于位置197的位置处包括一个缺失。

[17]如段落1-16中任一项所述的变体，该变体在对应于位置197、198、199及200的任意位置的两个位置处包括一个改变。

[18]如段落1-16中任一项所述的变体，该变体在对应于位置197、198、199及200的任意位置的三个位置处包括一个改变。

[19]如段落1-16中任一项所述的变体，该变体在对应于位置197、198、199及200的每个位置处都包括一个改变。

[20]如段落1-19中任一项所述的变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置处包括选自下组的一个或多个改变，该组由以下各项组成：N197A、N198A、A199*以及N200A,G,W。

[21]如段落1-19中任一项所述的变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置处包括改变N197A+N198A。

[22]如段落1-19中任一项所述的变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置处包括改变N197A+A199*。

[23]如段落1-19中任一项所述的变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置处包括改变N197A+N200A,G,W。

[24]如段落1-19中任一项所述的变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置处包括改变N198A+A199*。

[25]如段落1-19中任一项所述的变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置处包括改变N198A+N200A,G,W。

[26]如段落1-19中任一项所述的变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置处包括改变A199*+N200A,G,W。

[27]如段落1-19中任一项所述的变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置处包括改变N197A+N198A+A199*。

[28]如段落1-19中任一项所述的变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置处包括改变N197A+N198A+N200A,G,W。

[29]如段落1-19中任一项所述的变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置处包括改变N197A+A199*+N200A,G,W。

[30]如段落1-19中任一项所述的变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置处包括改变N198A+A199*+N200A,G,W。

[31]如段落1-19中任一项所述的变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置处包括改变N197A+N198A+A199*+N200A,G,W。

[32]如段落1-31中任一项所述的变体，该变体包括SEQ ID NO:6或其成熟多肽或由其组成。

[33]如段落1-31中任一项所述的变体，该变体包括SEQ ID NO:45或其成熟多肽或由其组成。

[34]如段落1-31中任一项所述的变体，该变体包括SEQ ID NO:47或其成熟多肽或由其组成。

[35]如段落1-31中任一项所述的变体，该变体包括SEQ ID NO:49或其成熟多肽或由其组成。

[36]如段落1-31中任一项所述的变体，该变体包括SEQ ID NO:51或其成熟多肽或由其组成。

[37]如段落1-31中任一项所述的变体，该变体包括SEQ ID NO:66或其成熟多肽或由其组成。

[38]如段落1-31中任一项所述的变体，其中该亲本是一种杂合或嵌合多肽，其中该亲本的碳水化合物结合结构域被一个不同的碳水化合物结合结构域替换。

[39]如段落1-31中任一项所述的变体，该变体是一种杂合或嵌合多肽，其中该变体的碳水化合物结合结构域被一个不同的碳水化合物结合结构域替换。

[40]如段落1-31中任一项所述的变体，其中该亲本是一种融合蛋白，其中将一个异源碳水化合物结合结构域融合至该亲本。

[41]如段落40所述的变体，其中该碳水化合物结合结构域融合至该亲本的N-末端或C-末端。

[42]如段落40或41所述的变体，其中该融合蛋白包括SEQ ID NO:73或其成熟多肽或由其组成。

[43]如段落1-31中任一项所述的变体，该变体是一种融合蛋白，其中将一个异源碳水化合物结合结构域融合至该变体。

[44]如段落43所述的变体，其中该碳水化合物结合结构域融合至该变体的N-末端或C-末端。

[45]如段落43或44所述的变体，该变体包括SEQ ID NO:76或其成熟多肽或由其组成。

[46]如段落1-45中任一项所述的变体，该变体相对于该亲本具有增加的比性能。

[47]一种编码如段落1-46中任一项所述的变体的分离的多核苷酸。

[48]一种包含如段落47所述的多核苷酸的核酸构建体或表达载体。

[49]一种包含如段落47所述的多核苷酸的宿主细胞。

[50]一种产生纤维二糖水解酶变体的方法，该方法包括：在适合于该变体表达的条件下培养如段落49所述的宿主细胞。

[51]如段落50所述的方法，进一步包括回收该变体。

[52]一种用如段落47所述的多核苷酸转化的转基因植物、植物部分或植物细胞。

[53]一种产生如段落1-46中任一项所述的变体的方法，该方法包括：在有助于该变体产生的条件下培养包括编码该变体的多核苷酸的转基因植物或植物细胞。

[54]如段落53所述的方法，进一步包括回收该变体。

[55]一种用于获得纤维二糖水解酶变体的方法，该方法包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置197、198、199及200的一个或多个位置处向一种亲本纤维二糖水解酶中引入一个改变，其中对应于位置197、198和200的一个或多个位置处的改变是一个取代并且对应于位置199的位置处的改变是一个缺失，并且其中该变体具有纤维二糖水解酶活性。

[56]如段落55所述的方法，进一步包括回收该变体。

[57]一种包含如段落1-46中任一项所述的变体的组合物。

[58]一种包含如段落1-46中任一项所述的变体的全培养液配制品或细胞培养物组合物。

[59]一种用于降解纤维素材料的方法，该方法包括：在如段落1-46中任一项所述的变体的存在下，用一种酶组合物处理该纤维素材料。

[60]如段落59所述的方法，其中对该纤维素材料进行了预处理。

[61]如段落59或60所述的方法，其中该酶组合物包括选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、过氧化氢酶、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶以及膨胀蛋白。

[62]如段落61所述的方法，其中该纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。

[63]如段落61所述的方法，其中该半纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、***呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。

[64]如段落59-63中任一项所述的方法，进一步包括回收该降解的纤维素材料。

[65]如段落64所述的方法，其中该降解的纤维素材料是一种糖。

[66]如段落65所述的方法，其中该糖选自下组，该组由以下各项组成：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、以及***糖。

[67]一种用于产生发酵产物的方法，该方法包括：(a)在如段落1-46中任一项所述的变体的存在下，用一种酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵该糖化的纤维素材料，以产生该发酵产物；并且(c)从发酵中回收该发酵产物。

[68]如段落67所述的方法，其中对该纤维素材料进行了预处理。

[69]如段落67或68所述的方法，其中该酶组合物包括选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、过氧化氢酶、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶以及膨胀蛋白。

[70]如段落69所述的方法，其中该纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。

[71]如段落69所述的方法，其中该半纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、***呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。

[72]如段落67-71中任一项所述的方法，其中步骤(a)和(b)是在同时糖化和发酵中同时执行。

[73]如段落67-72中任一项所述的方法，其中该发酵产物是醇、烷烃、环烷烃、烯烃、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸、或聚酮化合物。

[74]一种发酵纤维素材料的方法，该方法包括：用一种或多种发酵微生物发酵该纤维素材料，其中在如段落1-46中任一项所述的变体的存在下，用一种酶组合物糖化该纤维素材料。

[75]如段落74所述的方法，其中发酵该纤维素材料产生一种发酵产物。

[76]如段落75所述的方法，进一步包括从发酵中回收该发酵产物。

[77]如段落75或76所述的方法，其中该发酵产物是醇、烷烃、环烷烃、烯烃、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸、或聚酮化合物。

[78]如段落74-77中任一项所述的方法，其中在糖化之前，对该纤维素材料进行预处理。

[79]如段落74-78中任一项所述的方法，其中该酶组合物包括选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、过氧化氢酶、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶以及膨胀蛋白。

[80]如段落79所述的方法，其中该纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。

[81]如段落80所述的方法，其中该半纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、***呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。

在此描述并且要求的这些发明不限于在此披露的具体方面的范围，因为这些方面旨在作为这些发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于这些发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，对于本领域普通技术人员而言这些发明的不同修改将从前述描述变得清楚。这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。