阅读说明：本技术 检测血液中奥氮平的方法 (Method for detecting olanzapine in blood ) 是由 雒琴 贾永娟 倪君君 于 2019-11-12 设计创作，主要内容包括：本发明的检测血液中奥氮平的方法包括：制备奥氮平标准储备液、制备奥氮平的标准中间液、制备内标工作液、制备标准溶液和利用液相色谱-质谱联用仪检测标准溶液,拟合得到奥氮平对应的标准曲线方程为：y<Sub>1</Sub>＝a*x<Sub>1</Sub>+b；对待测血液进行处理,利用液相色谱-质谱联用仪检测待测血液,计算出待测血液中的奥氮平浓度。在本发明中,对待测血液样品的处理方法以及内标物的选择,使得奥氮平的识别更为准确,分析时间短、干扰小,内标定量适宜特异性强、灵敏度高,同时,回收率,检测限和精密度等各项技术指标均符合要求,从而提高检测结果的准确度,消除系统误差。(The method for detecting olanzapine in blood comprises the following steps: preparing olanzapine standard stock solution, preparing olanzapine standard intermediate solution, preparing internal standard working solution, preparing standard solution, detecting the standard solution by using a liquid chromatography-mass spectrometer, and fitting to obtain a standard curve equation corresponding to olanzapine as follows: y is 1 ＝a*x 1 + b; and (3) processing the blood to be detected, detecting the blood to be detected by using a liquid chromatography-mass spectrometer, and calculating the concentration of olanzapine in the blood to be detected. In the present inventionThe method for processing the blood sample to be detected and the selection of the internal standard substance enable the identification of olanzapine to be more accurate, the analysis time to be short, the interference to be small, the internal standard quantification to be suitable, the specificity to be strong, the sensitivity to be high, meanwhile, all technical indexes such as the recovery rate, the detection limit and the precision to be in line with the requirements, thereby improving the accuracy of the detection result and eliminating the system error.)

检测血液中奥氮平的方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种检测血液中奥氮平的方法。

背景技术

奥氮平是一种新的非典型神经安定药，属第二代抗精神病药，临床广泛用于精神***症和其它有严重阳性症状(例如：妄想、幻觉、思维障碍和猜疑)或阴性症状(例如：情感淡漠和言语贫乏)的精神病的急性期和维持治疗，故对奥氮平的监测具有重要的临床意义。

目前，检测服用奥氮平的患者的血液样本时，通常采用高效液相色谱法进行测试。

但是，通过上述方法检测血液样本中的奥氮平含量时，需要对血液样本进行前处理，例如，萃取。由于萃取处理的时间通常较长，从而使得检测时间长，导致血液样本的检测效率低。

发明内容

本申请的发明目的是提供了一种检测血液中奥氮平的方法，能够提高血液样本的检测效率。

本发明的一种检测血液中奥氮平的方法，其中：它包括以下步骤：

(一)标准溶液的标定

(a)制备奥氮平标准储备液

精确称取奥氮平标准品5.0mg置于2mL冻存管，用含水量为0％-30％的甲醇溶液进行溶解，并定容于1mL，得到奥氮平标准储备液，在-80℃条件下保存；

(b)制备奥氮平的标准中间液

用含水量为10％～80％甲醇稀释液稀释上述奥氮平标准储备液，制成含有浓度为7.5ng/mL-2400ng/mL的奥氮平的至少三种奥氮平的标准中间液，并在-80℃条件下保存；

(c)制备内标工作液

用含水量为10％～80％甲醇稀释液稀释奥氮平-d8储备液，得到一种含有10～1000ng/mL奥氮平-d8的内标工作液，并在-80℃条件下保存；

(d)制备标准溶液

分别移取5μL上述至少三种浓度的奥氮平标准中间液，在上述每一种奥氮平标准中间液中分别加入10μL的内标工作液和90μL含水量为10％～80％甲醇稀释液，并在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，再加入300μL沉淀蛋白试剂乙腈，在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，制成至少三种不同浓度的标准溶液，其中，每一种浓度的标准溶液中包含的内标物的浓度相同；

(e)拟合标准曲线方程

利用液相色谱-质谱联用仪检测上述每一种浓度的标准溶液，得到至少三种不同浓度的标准溶液的奥氮平和奥氮平-d8的图谱；从上述每种浓度的标准溶液的图谱中分别得到奥氮平的色谱峰峰面积和奥氮平-d8的色谱峰峰面积，分别以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的奥氮平的色谱峰峰面积与奥氮平-d8的色谱峰峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y₁，以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的奥氮平的浓度与奥氮平-d8的浓度的比值作为标准曲线的横坐标x₁，将上述检测所得的至少三种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到奥氮平对应的标准曲线方程为：y₁＝a*x₁+b，并且得到权重系数a和b；

(二)待测血液样本的处理

取待测血液至少2mL，在离心速度3500rpm下离心10min，提取待测血液的上清液，并在-20℃条件下保存；

移取步骤(c)的奥氮平-d8的内标工作液10μL于1.5mL离心管中，再加入上述待测血液的上清液100μL，在1500rpm的转速下涡旋震荡混合1min，然后再在上述离心管中加入300μL沉淀蛋白试剂乙腈，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合1min后，再在12000rpm的转速下高速离心10min，得到上清液即为待测血液样本；

(三)待测血液样本的检测

利用液相色谱-质谱联用仪检测上述待测血液样本，得到待测血液样本中的奥氮平的色谱峰峰面积和奥氮平-d8的色谱峰峰面积；将待测血液样本中的奥氮平的色谱峰峰面积与奥氮平-d8的色谱峰峰面积的比值作为y₁，代入步骤(e)得到的y₁＝a*x₁+b公式中，计算得到待测血液样本中的奥氮平的浓度与奥氮平-d8的浓度的比值x₁，由于上述待测血液样本中，奥氮平-d8的浓度为已知，由此计算出待测血液样本中的奥氮平浓度。

本发明的一种检测血液中奥氮平的方法，其中：在步骤(b)中，制备七种含有不同浓度奥氮平的标准中间液，它们分别是含有7.5、30、120、300、600、1200、2400ng/mL奥氮平浓度的标准中间液。

本发明的一种检测血液中奥氮平的方法，其中：在步骤(b)和步骤(d)中，所述甲醇稀释液为含水量50％甲醇溶液，在步骤(a)中，用纯甲醇溶解奥氮平标准品。在步骤(c)中，用纯乙腈溶解奥氮平-d8标准品。

本发明的一种检测血液中奥氮平的方法，其中：在步骤(c)中，用含水量为50％甲醇稀释液稀释奥氮平-d8储备液，得到一种含有500ng/mL奥氮平-d8的内标工作液。

本发明的一种检测血液中奥氮平的方法，其中：所述液相色谱-质谱联用仪的色谱条件包括：C18反向色谱柱；柱温为30℃；流动相为：水以及甲醇溶液，甲醇溶液为含0.1％甲酸和10mM乙酸铵的甲醇溶液，所述水与所述甲醇溶液的体积比为45：55，所述水与所述甲醇溶液的等度洗脱时间不小于2.0min；流动相的流速为0.2～0.5mL/min。

本发明的一种检测血液中奥氮平的方法，其中：所述液相色谱-质谱联用仪的质谱条件包括：液相色谱-质谱联用仪的质谱检测器为ESI(+)模式；离子源参数：气流量为8～50L/min，喷雾量为20～50L/min，气体温度为300～400℃，毛细管电压为3000～5000V。

本发明的一种检测血液中奥氮平的方法，其中：所述C18反向色谱柱为WatersXbridge C18。

本发明的一种检测血液中奥氮平的方法，其中：所述液相色谱-质谱联用仪的在线过滤器为SSI COL PRE-FILTER WATER 1/160.5M。

本发明各个实施例至少具有如下有益效果：

1、在本发明中，利用液相色谱-质谱联用仪分别检测至少三种浓度的标准溶液，其中，标准溶液为具有内标物的奥氮平的标准溶液，且至少三种浓度标准溶液中内标物浓度一致；根据至少三种浓度标准溶液的检测结果，分别拟合奥氮平的标准曲线方程；对待检测血液进行高速离心处理，并向离心后的上清液中加入与标准溶液中相同量的内标物工作液，在高转速下涡旋振荡混合，再加入沉淀蛋白试剂，并再次进行高速涡旋振荡混合以及高速离心处理，以使溶液混合均匀获得去除干扰物后的上清液。利用液相色谱-质谱联用仪检测该上清液，基于奥氮平的第一检测结果和奥氮平的标准曲线方程，得到待测血液样本中奥氮平的浓度，实现了检测血液中的奥氮平，有效地缩短了检测时间。

2、在本发明中，对待测血液样品的处理方法以及内标物的选择，使得奥氮平的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、灵敏度高，同时，回收率，检测限和精密度等各项技术指标均符合要求，同时，该检测血液中奥氮平的方法，重现性良好，且加样回收率良好，从而提高检测结果的准确度，消除系统误差。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1是本发明提供的奥氮平OLZ的化学结构式；

图2是本发明提供的标准溶液中奥氮平和奥氮平-d8的色谱图；

图3是本发明提供的标准溶液中奥氮平和奥氮平-d8的质谱图；

图4是本发明提供的待测血液样本中的奥氮平和奥氮平-d8的色谱图；

图5是本发明提供的待测血液样本中的奥氮平和奥氮平-d8的质谱图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

本发明的检测血液中奥氮平的方法包括以下步骤：

(一)标准溶液的标定

(a)制备奥氮平标准储备液

精确称取奥氮平标准品5.0mg置于2mL冻存管，用纯甲醇溶液进行溶解，并定容于1mL，得到奥氮平标准储备液，在-80℃条件下保存；

(b)制备奥氮平的标准中间液

用含水量为50％甲醇稀释液稀释上述奥氮平标准储备液，制成含有浓度为7.5ng/mL-2400ng/mL的七种奥氮平的标准中间液，它们分别是含有7.5、30、120、300、600、1200、2400ng/mL奥氮平浓度的标准中间液，并在-80℃条件下保存；

(c)制备内标工作液

用含水量为50％甲醇稀释液稀释奥氮平-d8储备液，得到一种含有500ng/mL奥氮平-d8的内标工作液，并在-80℃条件下保存；

(d)制备标准溶液

分别移取5μL上述七种浓度的奥氮平标准中间液，在上述每一种奥氮平标准中间液中分别加入10μL的内标工作液和90μL含水量为50％甲醇稀释液，并在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，再加入300μL沉淀蛋白试剂乙腈，在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，制成七种不同浓度的标准溶液，其中，每一种浓度的标准溶液中包含的内标物的浓度相同；

(e)拟合标准曲线方程

利用液相色谱-质谱联用仪检测上述每一种浓度的标准溶液，得到至少三种不同浓度的标准溶液的奥氮平和奥氮平-d8的图谱；从上述每种浓度的标准溶液的图谱中分别得到奥氮平的色谱峰峰面积和奥氮平-d8的色谱峰峰面积，分别以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的奥氮平的色谱峰峰面积与奥氮平-d8的色谱峰峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y₁，以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的奥氮平的浓度与奥氮平-d8的浓度的比值作为标准曲线的横坐标x₁，将上述检测所得的至少三种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到奥氮平对应的标准曲线方程为：y₁＝a*x₁+b，并且得到权重系数a和b；

(二)待测血液样本的处理

取待测血液至少2mL，在离心速度3500rpm下离心10min，提取待测血液的上清液，并在-20℃条件下保存；

移取步骤(c)的奥氮平-d8的内标工作液10μL于1.5mL离心管中，再加入上述待测血液的上清液100μL，在1500rpm的转速下涡旋震荡混合1min，然后再在上述离心管中加入300μL沉淀蛋白试剂乙腈，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合1min后，再在12000rpm的转速下高速离心10min，得到上清液即为待测血液样本；

(三)待测血液样本的检测

利用液相色谱-质谱联用仪检测上述待测血液样本，得到待测血液样本中的奥氮平的色谱峰峰面积和奥氮平-d8的色谱峰峰面积；将待测血液样本中的奥氮平的色谱峰峰面积与奥氮平-d8的色谱峰峰面积的比值作为y₁，代入步骤(e)得到的y₁＝a*x₁+b公式中，计算得到待测血液样本中的奥氮平的浓度与奥氮平-d8的浓度的比值x₁，由于上述待测血液样本中，奥氮平-d8的浓度为已知，由此计算出待测血液样本中的奥氮平浓度。

所述液相色谱-质谱联用仪的色谱条件包括：C18为Waters Xbridge C18反向色谱柱；柱温为30℃；流动相为：水以及甲醇溶液，甲醇溶液为含0.1％甲酸和10mM乙酸铵的甲醇溶液，所述水与所述甲醇溶液的体积比为45∶55，所述水与所述甲醇溶液的等度洗脱时间不小于2.0min；流动相的流速为0.2～0.5mL/min。

所述液相色谱-质谱联用仪的质谱条件包括：液相色谱-质谱联用仪的质谱检测器为ESI(+)模式；离子源参数：气流量为10L/min，喷雾量为30L/min，气体温度为350℃，毛细管电压为4000V。液相色谱-质谱联用仪的在线过滤器为SSI COL PRE-FILTER WATER 1/160.5M。

可以理解的是，进样量可以是0.1μL到30μL范围内的任一体积，比如，0.1μL，0.2μL，0.5μL，1μL，5μL，10μL，15μL，20μL，25μL以及30μL。

针对柱温来说，20～40℃是指在20℃到40℃的任一温度，比如，20℃，21℃，22.5℃，23℃，24℃，25℃，27.5℃，29℃，30.5℃，33℃，34℃，35℃，37℃，38.5℃，39℃以及40℃等，在该范围内任一温度下，检测出来的结果大体一致。

针对检测待检测血液中奥氮平所使用的液相色谱-质谱联用仪来说，质谱条件，包括：液相色谱-质谱联用仪的质谱检测器为ESI(+)模式；所述离子源参数，包括：气流量为8～50L/min，喷雾量为20～50L/min，气体温度为300～400℃，毛细管电压为3000～5000V。

针对气流量来说，8～50L/min是指在8L/min到50L/min的任一流速，比如，8L/min，8.5L/min，9L/min，11L/min，14L/min，19L/min，24L/min，28.5L/min，35L/min，38.5L/min，42L/min，44L/min，47.5L/min，49L/min以及50L/min等。

针对喷雾量来说，20～50L/min是指在20L/min到50L/min的任一流速，比如，20L/min，22.5L/min，26L/min，30L/min，32L/min，35.5L/min，36L/min，40L/min，43L/min，46.5L/min以及50L/min等。

针对气体温度来说，300～400℃是指300℃到400℃的任一温度，比如，300℃，320℃，350℃，380℃以及400℃等。

针对毛细管电压来说，3000～5000V是指3000V到5000V的任一电压，比如，3000V，3100V，3300V，3500V，3900V，4000V，4200V，4300V，4500V，4700V，4900V以及5000V等。

进一步地，液相色谱-质谱联用仪的质谱参数可进一步如下表1所示：

表1

物质名称	母离子	子离子	Dwell	Fragmentor	CE	CAV
							奥氮平	313.2	256.1	200	120	22	2
奥氮平-d8	321.2	260.1	200	120	22	2

上述表中，Dwell表征扫描时间，Fragmentor表征裂解电压，CE表征碰撞电压，CAV表征碰撞池加速电压。

本发明检测的奥氮平OLZ的化学结构式如图1所示。

本发明实施例所提及的血液可以为血液本身，也可以为血液的相关样品如全血、血清、血浆等。

上述实施例中一种浓度的标准溶液的奥氮平和奥氮平-d8的色谱图如图2所示，质谱图如图3所示；其中，图2中的数字标识1为标准溶液中奥氮平的色谱图，数字标识2为标准溶液中奥氮平-d8的色谱图；图3中的数字标识1为标准溶液中奥氮平的质谱图，数字标识2为标准溶液中奥氮平-d8的质谱图。标准溶液中的奥氮平和奥氮平-d8的保留时间分别为1.291min、1.163min。

进一步地，液相色谱-质谱联用仪所使用的在线过滤器为：SI COL PRE-FILTERWATER 1/160.5M。

上述实施例中待测血液样本中的奥氮平和奥氮平-d8的色谱图如图4所示，质谱图如图5所示；其中，图4中的数字标识1为待测血液样本中奥氮平的色谱图，数字标识2为待测血液样本中奥氮平-d8的色谱图；图5中的数字标识1为待测血液样本中奥氮平的质谱图，数字标识2为待测血液样本中奥氮平-d8的质谱图。待测血液样本中的奥氮平和奥氮平-d8的保留时间分别为1.191min、1.263min。

有图2、图3、图4和图5对比可见，待测血液样本中的奥氮平的保留时间与标注溶液中的奥氮平的保留时间已知，以奥氮平-d8为内标物，使得奥氮平的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确度和灵敏度高。

为了证明本申请溶液中含有一定浓度奥氮平所存在的线性关系，特作以下实验：将配制的各个浓度的奥氮平的标准工作液，加入10μL内标工作液，95μL含水量30％的甲醇稀释液，并加入乙腈300μL混匀进样，按本申请的处理及检测条件进行检测，以定量离子色谱峰峰面积与浓度作图，得到标准曲线，结果表明奥氮平的线性范围和定量限如下：

奥氮平

(1)检测线(LOD)：0.003ng/mL。

(2)定量限(LOQ)：0.0375ng/mL。

(3)线性范围：0.375ng/mL到120ng/mL范围内，线性良好，相关系数R2＞0.999。

检测血液中奥氮平的方法的回收率和精密度

分别取含奥氮平的标曲中间液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按本申请的处理方式和检测条件进行检测，重复分析测定3批次，奥氮平的回收率和精密度如下表2所示：

表2

由表2可知，奥氮平在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为99.1％～109.9％，相对标准偏差为1.3％～5.0％。

综合上述验证试验，本实施例的检测限、回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，方法检测血液中奥氮平浓度，重现性良好，加样回收率高，提高了检测结果的准确度。

最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。