阅读说明：本技术 检测血液中苯妥英钠的方法 (Method for detecting phenytoin sodium in blood ) 是由 雒琴 贾永娟 倪君君 于 2019-11-12 设计创作，主要内容包括：本发明的检测血液中苯妥英钠的方法包括：制备苯妥英钠标准储备液、制备苯妥英钠的标准中间液、制备内标工作液、制备标准溶液和利用液相色谱-质谱联用仪检测标准溶液,拟合得到苯妥英钠对应的标准曲线方程为：y<Sub>1</Sub>＝a*x<Sub>1</Sub>+b；对待测血液进行处理,利用液相色谱-质谱联用仪检测待测血液,计算出待测血液中的苯妥英钠浓度。在本发明中,对待测血液样品的处理方法以及内标物的选择,使得苯妥英钠的识别更为准确,分析时间短、干扰小,内标定量适宜特异性强、灵敏度高,同时,回收率,检测限和精密度等各项技术指标均符合要求,从而提高检测结果的准确度,消除系统误差。(The method for detecting the phenytoin sodium in the blood comprises the following steps: preparing a phenytoin sodium standard stock solution, preparing a standard intermediate solution of phenytoin sodium, preparing an internal standard working solution, preparing a standard solution, detecting the standard solution by using a liquid chromatography-mass spectrometer, and fitting to obtain a standard curve equation corresponding to the phenytoin sodium, wherein the standard curve equation is as follows: y is 1 ＝a*x 1 + b; treating the blood to be detected, detecting the blood to be detected by using a liquid chromatogram-mass spectrum combined instrument, and calculating the sodium phenytoin concentration in the blood to be detected. In the invention, the processing method of the blood sample to be detected and the selection of the internal standard substance enable the identification of the phenytoin sodium to be more accurate, the analysis time is short, the interference is small, the internal standard quantification is suitable, the specificity is strong, the sensitivity is high, and meanwhile, all technical indexes such as the recovery rate, the detection limit and the precision meet the requirements, thereby improving the accuracy of the detection result and eliminating the system error.)

检测血液中苯妥英钠的方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种检测血液中苯妥英钠的方法。

背景技术

苯妥英钠临床广泛用于治疗全身强直-阵孪性发作、复杂部分性发作(精神运动性发作、颞叶癫痫)、单纯部分性发作(局限性发作)和癫痫持续状态。也可用于治疗三叉神经痛，隐性营养不良性大疱性表皮松解(recessive dystrophic epidermolysisbullosa)，发作性舞蹈手足徐动症，发作性控制障碍(包括发怒、焦虑和失眠的兴奋过度等的行为障碍疾患)，肌强直症及三环类抗抑郁药过量时心脏传导障碍等。也适用于洋地黄中毒所致的室性及室上性心律失常，对其他各种原因引起的心律失常疗效较差。故对苯妥英钠的监测具有重要的临床意义。

目前，检测服用苯妥英钠的患者的血液样本时，通常采用高效液相色谱法进行测试。

但是，通过上述方法检测血液样本中的苯妥英钠含量时，需要对血液样本进行前处理，例如，沉淀蛋白。由于沉淀蛋白处理不能较好的去除杂质，从而使得检测时间长，导致血液样本的检测效率低。

发明内容

本申请的发明目的是提供了一种检测血液中苯妥英钠的方法，能够提高血液样本的检测效率。

为了完成本申请的发明目的，本申请采用以下技术方案：

本发明的检测血液中苯妥英钠的方法，其中：它包括以下步骤：

(一)标准溶液的标定

(a)制备苯妥英钠标准储备液

精确称取苯妥英钠标准品10.0mg置于5mL容量瓶，用含水量为0％-30％的甲醇溶液进行溶解，并定容于5mL，得到苯妥英钠标准储备液，在-80℃条件下保存；

(b)制备苯妥英钠的标准中间液

用含水量为0％～30％甲醇稀释液稀释上述苯妥英钠标准储备液，制成含有浓度为12.5mg/L-400mg/L的苯妥英钠的至少三种苯妥英钠的标准中间液，并在-80℃条件下保存；

(c)制备内标工作液

用含水量为0％～30％甲醇稀释液稀释环庚米特储备液，得到一种含有10～50mg/L环庚米特的内标工作液，并在-80℃条件下保存；

(d)制备标准溶液

分别移取10μL上述至少三种浓度的苯妥英钠标准中间液，在上述每一种苯妥英钠标准中间液中分别加入10μL的内标工作液和1090μL甲醇，并在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，取上清液100μL，并加入400μL甲醇，在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，制成至少三种不同浓度的标准溶液，其中，每一种浓度的标准溶液中包含的内标物的浓度相同；

(e)拟合标准曲线方程

利用液相色谱-质谱联用仪检测上述每一种浓度的标准溶液，得到至少三种不同浓度的标准溶液的苯妥英钠和环庚米特的图谱；从上述每种浓度的标准溶液的图谱中分别得到苯妥英钠的色谱峰峰面积和环庚米特的色谱峰峰面积，分别以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的苯妥英钠的色谱峰峰面积与环庚米特的色谱峰峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y₁，以上上述至少三种不同浓度的标准溶液中的苯妥英钠的浓度与环庚米特的浓度的比值作为标准曲线的横坐标x₁，将上述检测所得的至少三种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到苯妥英钠对应的标准曲线方程为：y₁＝a*x₁+b，并且得到权重系数a和b；

(二)待测血液样本的处理

取待测血液至少2mL，在离心速度3500rpm下离心10min，提取待测血液的上清液，并在-20℃条件下保存；

移取步骤(c)的环庚米特的内标工作液10μL于1.5mL离心管中，再加入上述待测血液的上清液100μL，在1500-2500rpm的转速下涡旋震荡混合30s-1min，然后再在上述离心管中加入萃取液1000μL，在1200-2000rpm的转速下涡旋震荡混合5-10min后，再在1000-150000rpm的转速下高速离心5-10min，取上清液后用氮气缓慢吹干，再加入复溶液500μL，在1500-2500rpm的转速下涡旋震荡混合1-3min，得到上清液即为待测血液样本；

(三)待测血液样本的检测

利用液相色谱-质谱联用仪检测上述待测血液样本，得到待测血液样本中的苯妥英钠的色谱峰峰面积和环庚米特的色谱峰峰面积；将待测血液样本中的苯妥英钠的色谱峰峰面积与环庚米特的色谱峰峰面积的比值作为y₁，代入步骤(e)得到的y₁＝a*x₁+b公式中，计算得到待测血液样本中的苯妥英钠的浓度与环庚米特的浓度的比值x₁，由于上述待测血液样本中，环庚米特的浓度为已知，由此计算出待测血液样本中的苯妥英钠浓度。

本发明的检测血液中苯妥英钠的方法，其中：在步骤(b)中，制备七种含有不同浓度苯妥英钠的标准中间液，它们分别是含有12.5、25、50、100、150、200、400mg/L苯妥英钠浓度的标准中间液。

本发明的检测血液中苯妥英钠的方法，其中：在步骤(b)和步骤(d)中，所述甲醇稀释液为纯甲醇溶液，在步骤(a)中，用纯甲醇溶解苯妥英钠标准品。

本发明的检测血液中苯妥英钠的方法，其中：在步骤(二)中，萃取液为乙酸乙酯；复溶液为纯甲醇溶液。

本发明的检测血液中苯妥英钠的方法，其中：在步骤(c)中，用纯甲醇稀释液稀释环庚米特储备液，得到一种含有10mg/L环庚米特的内标工作液。

本发明的检测血液中苯妥英钠的方法，其中：所述液相色谱-质谱联用仪的色谱条件包括：C8反向色谱柱；柱温为20～40℃；流动相为：含0.1％甲酸的水溶液和纯甲醇溶液，其中，所述水溶液与所述纯甲醇溶液的体积比为45∶55，所述水溶液与所述甲醇溶液的等度洗脱时间不小于2.5min；流动相的流速为0.2～0.8mL/min。

本发明的检测血液中苯妥英钠的方法，其中：所述液相色谱-质谱联用仪的质谱条件包括：液相色谱-质谱联用仪的质谱检测器为ESI(+)模式；离子源参数包括：气流量为8～50L/min，喷雾量为20～50L/min，气体温度为300～400℃，毛细管电压为3000～5000V。

本发明的检测血液中苯妥英钠的方法，其中：所述C8反向色谱柱为AgilentZorbax XDB-C8。

本发明的检测血液中苯妥英钠的方法，其中：所述液相色谱-质谱联用仪的在线过滤器为SSI COL PRE-FILTER WATER 1/16 0.5M。

本发明具有如下有益效果：

1.在本发明中，利用液相色谱-质谱联用仪分别检测至少三种浓度的标准溶液，其中，标准溶液为具有内标物的苯妥英钠的标准溶液，且至少三种浓度标准溶液中内标物浓度一致；根据至少三种浓度标准溶液的检测结果，分别拟合苯妥英钠的标准曲线方程；对待检测血液进行高速离心处理，并向离心后的上清液中加入与标准溶液中相同量的内标物工作液，在高转速下涡旋振荡混合，再加入萃取剂，并再次进行高速涡旋振荡混合以及高速离心处理，取上清液氮气缓慢吹干，再加入复溶液进行高速涡旋振荡混合以及高速离心处理，以使溶液混合均匀获得去除干扰物后的上清液。利用液相色谱-质谱联用仪检测该上清液，基于苯妥英钠的第一检测结果和苯妥英钠的标准曲线方程，得到待测血液样本中苯妥英钠的浓度，实现了检测血液中的苯妥英钠，有效地缩短了检测时间。

2、在本发明中，对待测血液样品的处理方法以及内标物的选择，使得苯妥英钠的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、灵敏度高，同时，回收率，检测限和精密度等各项技术指标均符合要求，同时，该检测血液中苯妥英钠的方法，重现性良好，且加样回收率良好，从而提高检测结果的准确度，消除系统误差。

附图说明

图1是本发明提供的苯妥英钠PhT的化学结构式；

图2是本发明提供的标准溶液中苯妥英钠和环庚米特的色谱图；

图3是本发明提供的标准溶液中苯妥英钠和环庚米特的质谱图；

图4是本发明提供的待测血液样本中的苯妥英钠和环庚米特的色谱图；

图5是本发明提供的待测血液样本中的苯妥英钠和环庚米特的质谱图。

具体实施方式

为使本发明发明目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细说明。

本发明的检测血液中苯妥英钠的方法包括以下步骤：

(一)标准溶液的标定

(a)制备苯妥英钠标准储备液

精确称取苯妥英钠标准品10.0mg置于5mL容量瓶，用纯甲醇溶液进行溶解，并定容于5mL，得到苯妥英钠标准储备液，在-80℃条件下保存；

(b)制备苯妥英钠的标准中间液

用含水量为30％甲醇稀释液稀释上述苯妥英钠标准储备液，制成含有浓度为12.5mg/L-400mg/L的苯妥英钠的七种苯妥英钠的标准中间液，它们分别是含有12.5、25、50、100、150、200、400mg/L苯妥英钠浓度的标准中间液，并在-80℃条件下保存；

(c)制备内标工作液

用纯甲醇稀释液稀释环庚米特储备液，得到一种含有10mg/L环庚米特的内标工作液，并在-80℃条件下保存；

(d)制备标准溶液

分别移取10μL上述七种浓度的苯妥英钠标准中间液，在上述每一种苯妥英钠标准中间液中分别加入10μL的内标工作液和1090μL甲醇，并在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，取上清液100μL，并加入400μL甲醇，在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，制成至少三种不同浓度的标准溶液，其中，每一种浓度的标准溶液中包含的内标物的浓度相同；

(e)拟合标准曲线方程

利用液相色谱-质谱联用仪检测上述每一种浓度的标准溶液，得到至少三种不同浓度的标准溶液的苯妥英钠和环庚米特的图谱；从上述每种浓度的标准溶液的图谱中分别得到苯妥英钠的色谱峰峰面积和环庚米特的色谱峰峰面积，分别以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的苯妥英钠的色谱峰峰面积与环庚米特的色谱峰峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y₁，以上上述至少三种不同浓度的标准溶液中的苯妥英钠的浓度与环庚米特的浓度的比值作为标准曲线的横坐标x₁，将上述检测所得的至少三种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到苯妥英钠对应的标准曲线方程为：y₁＝a*x₁+b，并且得到权重系数a和b；

(二)待测血液样本的处理

取待测血液至少2mL，在离心速度3500rpm下离心10min，提取待测血液的上清液，并在-20℃条件下保存；

移取步骤(c)的环庚米特的内标工作液10μL于1.5mL离心管中，再加入上述待测血液的上清液100μL，在1500-2500rpm的转速下涡旋震荡混合30s-1min，然后再在上述离心管中加入乙酸乙酯萃取液1000μL，在1200-2000rpm的转速下涡旋震荡混合5-10min后，再在1000-150000rpm的转速下高速离心5-10min，取上清液后用氮气缓慢吹干，再加入纯甲醇溶液复溶液100μL，在1500-2500rpm的转速下涡旋震荡混合1-3min，得到上清液即为待测血液样本；

(三)待测血液样本的检测

利用液相色谱-质谱联用仪检测上述待测血液样本，得到待测血液样本中的苯妥英钠的色谱峰峰面积和环庚米特的色谱峰峰面积；将待测血液样本中的苯妥英钠的色谱峰峰面积与环庚米特的色谱峰峰面积的比值作为y₁，代入步骤(e)得到的y₁＝a*x₁+b公式中，计算得到待测血液样本中的苯妥英钠的浓度与环庚米特的浓度的比值x₁，由于上述待测血液样本中，环庚米特的浓度为已知，由此计算出待测血液样本中的苯妥英钠浓度。

液相色谱-质谱联用仪的色谱条件包括：C8反向色谱柱为Agilent Zorbax XDB-C8反向色谱柱；柱温为20～40℃；流动相为：含0.1％甲酸的水溶液和纯甲醇溶液，其中，水溶液与所述纯甲醇溶液的体积比为45∶55，水溶液与所述甲醇溶液的等度洗脱时间不小于2.5min；流动相的流速为0.2～0.8mL/min。

液相色谱-质谱联用仪的质谱条件包括：液相色谱-质谱联用仪的质谱检测器为ESI(+)模式；离子源参数包括：气流量为11L/min，喷雾量为30L/min，气体温度为350℃，毛细管电压为3000V。

液相色谱-质谱联用仪的在线过滤器为SSI COL PRE-FILTER WATER 1/16 0.5M。

可以理解的是，进样量可以是0.1μL到30μL范围内的任一体积，比如，0.1μL，0.2μL，0.5μL，1μL，5μL，10μL，15μL，20μL，25μL以及30μL。

针对柱温来说，20～40℃是指在20℃到40℃的任一温度，比如，20℃，21℃，22.5℃，23℃，24℃，25℃，27.5℃，29℃，30.5℃，33℃，34℃，35℃，37℃，38.5℃，39℃以及40℃等，在该范围内任一温度下，检测出来的结果大体一致。

针对检测待检测血液中苯妥英钠所使用的液相色谱-质谱联用仪来说，质谱条件，包括：液相色谱-质谱联用仪的质谱检测器为ESI(+)模式；所述离子源参数，包括：气流量为8～50L/min，喷雾量为20～50L/min，气体温度为300～400℃，毛细管电压为3000～5000V。

针对气流量来说，8～50L/min是指在8L/min到50L/min的任一流速，比如，8L/min，8.5L/min，9L/min，11L/min，14L/min，19L/min，24L/min，28.5L/min，35L/min，38.5L/min，42L/min，44L/min，47.5L/min，49L/min以及50L/min等。

针对喷雾量来说，20～50L/min是指在20L/min到50L/min的任一流速，比如，20L/min，22.5L/min，26L/min，30L/min，32L/min，35.5L/min，36L/min，40L/min，43L/min，46.5L/min以及50L/min等。

针对气体温度来说，300～400℃是指300℃到400℃的任一温度，比如，300℃，320℃，350℃，380℃以及400℃等。

针对毛细管电压来说，3000～5000V是指3000V到5000V的任一电压，比如，3000V，3100V，3300V，3500V，3900V，4000V，4200V，4300V，4500V，4700V，4900V以及5000V等。

进一步地，液相色谱-质谱联用仪的质谱参数可进一步如下表1所示：

表1

物质名称	母离子	子离子	Dwell	Fragmentor	CE	CAV
							苯妥英钠	253.1	182.1	200	115	15	7
苯妥英钠	253.1	225.1	200	115	7	7
							环庚米特	238.1	193.1	200	115	17	3
环庚米特	238.1	115.1	200	115	35	5

上述表中，Dwell表征扫描时间，Fragmentor表征裂解电压，CE表征碰撞电压，CAV表征碰撞池加速电压。苯妥英钠253.1-182.1离子对作为定量使用，253.1-225.1离子对作为定性使用。环庚米特238.1-193.1离子对作为定量使用，238.1-115.1离子对作为定性使用。图2显示了一种浓度的标准溶液中苯妥英钠和环庚米特的色谱图，图3显示了一种浓度的标准溶液中苯妥英钠和环庚米特的质谱图。其中，图2中的数字标识1从上到下依次为标准溶液中苯妥英钠253.1-182.1定量离子对和253.1-225.1定性离子对的色谱图，数字标识2从上到下依次为标准溶液中环庚米特238.1-115.1定性离子对和238.1-193.1定量离子对的色谱图；图3中的数字标识1从上到下依次为标准溶液中苯妥英钠253.1-182.1定量离子对和253.1-225.1定性离子对的质谱图，数字标识2从上到下依次为标准溶液中环庚米特238.1-115.1定性离子对和238.1-193.1定量离子对的质谱图。标准溶液中的苯妥英钠和环庚米特的保留时间分别为0.978min、1.487min。

上述实施例中的待测血液样本中的苯妥英钠和环庚米特的色谱图如图4所示，质谱图如图5所示；图4中的数字标识1从上到下依次为待测血液样本中苯妥英钠253.1-182.1定量离子对和253.1-225.1定性离子对的色谱图，数字标识2为待测血液样本中环庚米特238.1-115.1定性离子对和238.1-193.1定量离子对的色谱图；图5中的数字标识1从上到下依次为待测血液样本中苯妥英钠253.1-182.1定量离子对和253.1-225.1定性离子对的质谱图，数字标识2为待测血液样本中环庚米特238.1-115.1定性离子对和238.1-193.1定量离子对的质谱图。待测血液样本中的苯妥英钠和环庚米特的保留时间分别为1.093min、1.507min。

从图2、图3、图4和图5对比可见，待测血液样本中的苯妥英钠的保留时间与标注溶液中的苯妥英钠的保留时间已知，以环庚米特为内标物，使得苯妥英钠的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确度和灵敏度高。

为了证明本申请溶液中含有一定浓度苯妥英钠所存在的线性关系，特作以下实验：将上述配制的各个浓度的苯妥英钠的标准工作液，加入10μL内标工作液，并加入甲醇1090μL混匀进样，按照上述方法进行处理及检测条件进行检测，以定量离子色谱峰峰面积与浓度作图，得到标准曲线，结果表明苯妥英钠的线性范围和定量限如下：

苯妥英钠

(1)检测线(LOD)：0.25ng/mL。

(2)定量限(LOQ)：1.25ng/mL。

(3)线性范围：1250ng/mL到40000ng/mL范围内，线性良好，相关系数R2＞0.999。

实施例6：检测血液中苯妥英钠的方法的回收率和精密度

分别取含苯妥英钠的标曲中间液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按照上述处理方式和检测条件进行检测，重复分析测定3批次，苯妥英钠的回收率和精密度如下表2所示：

表2

加标量	2500ng/mL	10000ng/mL	20000ng/mL
				平均回收率	101.72％	95.27％	94.31％
精密度RSD	3.39％	1.94％	1.95％

由表2可知，苯妥英钠在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为94.31％～101.72％，相对标准偏差为1.94％～3.39％。

综合上述验证试验，本实施例的检测限、回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，方法检测血液中苯妥英钠浓度，重现性良好，加样回收率高，提高了检测结果的准确度。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。