阅读说明：本技术 检测血液中丙戊酸的方法 (Method for detecting valproic acid in blood ) 是由 雒琴 贾永娟 倪君君 于 2019-11-12 设计创作，主要内容包括：本发明的检测血液中丙戊酸的方法包括：制备丙戊酸标准储备液、制备丙戊酸的标准中间液、制备内标工作液、制备标准溶液和利用液相色谱-质谱联用仪检测标准溶液,拟合得到丙戊酸对应的标准曲线方程为：y<Sub>1</Sub>＝a*x<Sub>1</Sub>+b；对待测血液进行处理,利用液相色谱-质谱联用仪检测对待测血液,计算出待测血液中的丙戊酸浓度。在本发明中,对待测血液样品的处理方法以及内标物的选择,使得丙戊酸的识别更为准确,分析时间短、干扰小,内标定量适宜特异性强、灵敏度高,同时,回收率,检测限和精密度等各项技术指标均符合要求,从而提高检测结果的准确度,消除系统误差。(The method for detecting valproic acid in blood comprises the following steps: preparing a valproic acid standard stock solution, preparing a standard intermediate solution of valproic acid, preparing an internal standard working solution, preparing a standard solution, detecting the standard solution by using a liquid chromatography-mass spectrometer, and fitting to obtain a standard curve equation corresponding to the valproic acid as follows: y is 1 ＝a*x 1 + b; and treating the blood to be detected, detecting the blood to be detected by using a liquid chromatography-mass spectrometer, and calculating the concentration of valproic acid in the blood to be detected. In the inventionIn the method, the processing method of the blood sample to be detected and the selection of the internal standard substance enable the identification of the valproic acid to be more accurate, the analysis time to be short, the interference to be small, the internal standard quantification to be suitable, the specificity to be strong, the sensitivity to be high, meanwhile, all technical indexes such as the recovery rate, the detection limit and the precision to be in line with the requirements, thereby improving the accuracy of the detection result and eliminating the system error.)

检测血液中丙戊酸的方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种检测血液中丙戊酸的方法。

背景技术

丙戊酸化学结构式和药理作用独特，对人的各型癫痫如对各型小发作、肌阵挛性癫痫、局限性发作、大发作和混合型癫痫均有效。多用于其它抗癫痫药无效的各型癫痫病人，尤以小发作为最佳，故对丙戊酸的监测具有重要的临床意义。

目前，检测服用丙戊酸的患者的血液样本时，通常采用高效液相色谱法进行测试。

但是，通过上述方法检测血液样本中的丙戊酸含量时，需要对血液样本进行前处理，例如，萃取。由于萃取处理的时间通常较长，从而使得检测时间长，导致血液样本的检测效率低。

发明内容

本申请的发明目的是提供了一种检测血液中丙戊酸的方法，能够提高血液样本的检测效率。

本发明的检测血液中丙戊酸的方法，其中：它包括以下步骤：

(一)标准溶液的标定

(a)制备丙戊酸标准储备液

把购买的有证丙戊酸标准溶液转移至2mL冻存管中，得到1mg/mL的丙戊酸标准储备液，在-80℃条件下保存；

(b)制备丙戊酸的标准中间液

用含水量为10％～80％甲醇稀释液稀释上述丙戊酸标准储备液，制成含有浓度为2.5mg/L～160mg/L的丙戊酸的至少三种丙戊酸的标准中间液，并在-80℃条件下保存；

(c)制备内标工作液

用含水量为10％～80％甲醇稀释液稀释1mg/mL的丙戊酸-d6储备液，得到一种含有10～50mg/L丙戊酸-d6的内标工作液，并在-80℃条件下保存；

(d)制备标准溶液

分别移取10μL上述至少三种浓度的丙戊酸标准中间液，在上述每一种丙戊酸标准中间液中分别加入10μL的内标工作液和180μL含水量为70％甲醇稀释液，并在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，制成至少三种不同浓度的标准溶液，其中，每一种浓度的标准溶液中包含的内标物的浓度相同；

(e)拟合标准曲线方程

利用液相色谱-质谱联用仪检测上述每一种浓度的标准溶液，得到至少三种不同浓度的标准溶液的丙戊酸和丙戊酸-d6的图谱；从上述每种浓度的标准溶液的图谱中分别得到丙戊酸的色谱峰峰面积和丙戊酸-d6的色谱峰峰面积，分别以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的丙戊酸的色谱峰峰面积与丙戊酸-d6的色谱峰峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y₁，以上上述至少三种不同浓度的标准溶液中的丙戊酸的浓度与丙戊酸-d6的浓度的比值作为标准曲线的横坐标x₁，将上述检测所得的至少三种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到丙戊酸对应的标准曲线方程为：y₁＝a*x₁+b，并且得到权重系数a和b；

(二)待测血液样本的处理

取待测血液至少2mL，在离心速度3500rpm下离心10min，提取待测血液的上清液，并在-20℃条件下保存；

移取步骤(c)的丙戊酸-d6的内标工作液10μL于1.5mL离心管中，再加入上述待测血液的上清液10μL，在1500rpm的转速下涡旋震荡混合30s，然后再在上述离心管中加入80μL沉淀蛋白试剂，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合3min，以达到充分沉淀蛋白的目的，再在10000-15000rpm的转速下高速离心10min，得到上清液，取上清液50μL，加入含水量为70％的甲醇溶液50μL，得到待测血液样本；

(三)待测血液样本的检测

利用液相色谱-质谱联用仪检测上述待测血液样本，得到待测血液样本中的丙戊酸的色谱峰峰面积和丙戊酸-d6的色谱峰峰面积；将待测血液样本中的丙戊酸的色谱峰峰面积与丙戊酸-d6的色谱峰峰面积的比值作为y₁，代入步骤(e)得到的y₁＝a*x₁+b公式中，计算得到待测血液样本中的丙戊酸的浓度与丙戊酸-d6的浓度的比值x₁，由于上述待测血液样本中，丙戊酸-d6的浓度为已知，由此计算出待测血液样本中的丙戊酸浓度。

本发明的检测血液中丙戊酸的方法，其中：在步骤(b)中，制备七种含有不同浓度丙戊酸的标准中间液，它们分别是含有2.5、5、10、20、40、80、160mg/L丙戊酸浓度的标准中间液。

本发明的检测血液中丙戊酸的方法，其中：在步骤(b)中，所述甲醇稀释液为含水量70％甲醇溶液。

本发明的检测血液中丙戊酸的方法，其中：在步骤(二)中，所加入的沉淀蛋白试剂为乙腈。

本发明的检测血液中丙戊酸的方法，其中：在步骤(c)中，用含水量为70％甲醇稀释液稀释丙戊酸-d6储备液，得到一种含有20mg/L丙戊酸-d6的内标工作液。

本发明的检测血液中丙戊酸的方法，其中：所述液相色谱-质谱联用仪的色谱条件包括：C18反向色谱柱；柱温为20～40℃；流动相为：含8mM乙酸铵的水溶液和纯甲醇溶液，上述水溶液与上述纯甲醇溶液的梯度洗脱时间不小于6.0min；流动相的流速为0.2～0.5mL/min。

本发明的检测血液中丙戊酸的方法，其中：所述液相色谱-质谱联用仪的质谱条件包括：液相色谱-质谱联用仪的质谱检测器为ESI(+)模式；离子源参数包括：气流量为8～50L/min，喷雾量为20～50L/min，气体温度为300～400℃，毛细管电压为3000～5000V。

本发明的检测血液中丙戊酸的方法，其中：所述C18反向色谱柱为AgilentPoroshell120 EC-C18。

本发明的检测血液中丙戊酸的方法，其中：所述液相色谱-质谱联用仪的在线过滤器为SSI COL PRE-FILTER WATER 1/16 0.5M。

本发明具有如下有益效果：

1、在本发明中，利用液相色谱-质谱联用仪分别检测至少三种浓度的标准溶液，其中，标准溶液为具有内标物的丙戊酸的标准溶液，且至少三种浓度标准溶液中内标物浓度一致；根据至少三种浓度标准溶液的检测结果，分别拟合丙戊酸的标准曲线方程；对待检测血液进行高速离心处理，并向离心后的上清液中加入与标准溶液中相同量的内标物工作液，在高转速下涡旋振荡混合，再加入沉淀蛋白试剂，并再次进行高速涡旋振荡混合以及高速离心处理，以使溶液混合均匀获得去除干扰物后的上清液，并在上清液中加入一定量的稀释液。利用液相色谱-质谱联用仪检测该稀释后的溶液，基于丙戊酸的第一检测结果和丙戊酸的标准曲线方程，得到待测血液样本中丙戊酸的浓度，实现了检测血液中的丙戊酸，有效地缩短了检测时间。

2、在本发明中，对待测血液样品的处理方法以及内标物的选择，使得丙戊酸的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、灵敏度高，同时，回收率，检测限和精密度等各项技术指标均符合要求，同时，该检测血液中丙戊酸的方法，重现性良好，且加样回收率良好，从而提高检测结果的准确度，消除系统误差。

附图说明

图1是本发明一实施例提供的丙戊酸VPA的化学结构式；

图2是本发明一实施例提供的标准溶液中丙戊酸和丙戊酸-d6的色谱图；

图3是本发明一实施例提供的标准溶液中丙戊酸和丙戊酸-d6的质谱图；

图4是本发明一实施例提供的待测血液样本中的丙戊酸和丙戊酸-d6的色谱图；

图5是本发明一实施例提供的待测血液样本中的丙戊酸和丙戊酸-d6的质谱图。

具体实施方式

下面结合附图，将对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。

本发明检测血液中丙戊酸的方法包括以下步骤：

(一)标准溶液的标定

(a)制备丙戊酸标准储备液

把购买的有证丙戊酸标准溶液转移至2mL冻存管中，得到1mg/mL的丙戊酸标准储备液，在-80℃条件下保存；

(b)制备丙戊酸的标准中间液

用含水量为70％甲醇稀释液稀释上述丙戊酸标准储备液，制成含有浓度为2.5mg/L～160mg/L的丙戊酸的七种丙戊酸的标准中间液，它们分别是含有2.5、5、10、20、40、80、160mg/L丙戊酸浓度的标准中间液并在-80℃条件下保存；

(c)制备内标工作液

用含水量为70％甲醇稀释液稀释1mg/mL的丙戊酸-d6储备液，得到一种含有20mg/L丙戊酸-d6的内标工作液，并在-80℃条件下保存；

(d)制备标准溶液

分别移取10μL上述七种浓度的丙戊酸标准中间液，在上述每一种丙戊酸标准中间液中分别加入10μL的内标工作液和180μL含水量为70％甲醇稀释液，并在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，制成七种不同浓度的标准溶液，其中，每一种浓度的标准溶液中包含的内标物的浓度相同；

(e)拟合标准曲线方程

利用液相色谱-质谱联用仪检测上述每一种浓度的标准溶液，得到七种不同浓度的标准溶液的丙戊酸和丙戊酸-d6的图谱；从上述每种浓度的标准溶液的图谱中分别得到丙戊酸的色谱峰峰面积和丙戊酸-d6的色谱峰峰面积，分别以上述七种不同浓度的标准溶液中的丙戊酸的色谱峰峰面积与丙戊酸-d6的色谱峰峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y₁，以上述七种不同浓度的标准溶液中的丙戊酸的浓度与丙戊酸-d6的浓度的比值作为标准曲线的横坐标x₁，将上述检测所得的七种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到丙戊酸对应的标准曲线方程为：y₁＝a*x₁+b，并且得到权重系数a和b；

(二)待测血液样本的处理

取待测血液至少2mL，在离心速度3500rpm下离心10min，提取待测血液的上清液，并在-20℃条件下保存；

移取步骤(c)的丙戊酸-d6的内标工作液10μL于1.5mL离心管中，再加入上述待测血液的上清液10μL，在1500rpm的转速下涡旋震荡混合30s，然后再在上述离心管中加入80μL沉淀蛋白试剂乙腈，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合3min，以达到充分沉淀蛋白的目的，再在10000-15000rpm的转速下高速离心10min，得到上清液，取上清液50μL，加入含水量为70％的甲醇溶液50μL，得到待测血液样本；

(三)待测血液样本的检测

利用液相色谱-质谱联用仪检测上述待测血液样本，得到待测血液样本中的丙戊酸的色谱峰峰面积和丙戊酸-d6的色谱峰峰面积；将待测血液样本中的丙戊酸的色谱峰峰面积与丙戊酸-d6的色谱峰峰面积的比值作为y₁，代入步骤(e)得到的y₁＝a*x₁+b公式中，计算得到待测血液样本中的丙戊酸的浓度与丙戊酸-d6的浓度的比值x₁，由于上述待测血液样本中丙戊酸-d6的浓度为已知，由此计算出待测血液样本中的丙戊酸浓度。

液相色谱-质谱联用仪的色谱条件包括：C18反向色谱柱为Agilent Poroshell120 EC-C18的反向色谱柱；柱温为20～40℃；流动相为：含8mM乙酸铵的水溶液和纯甲醇溶液，其中，0.00min所述水溶液与所述纯甲醇溶液的体积比为45∶55，1.60min所述水溶液与所述纯甲醇溶液的体积比为45∶55，1.61min所述水溶液与所述纯甲醇溶液的体积比为20∶80，3.00min所述水溶液与所述纯甲醇溶液的体积比为20∶80，3.01min所述水溶液与所述纯甲醇溶液的体积比为45∶55，6.00min所述水溶液与所述纯甲醇溶液的体积比为45∶55，所述水溶液与所述甲醇溶液的梯度洗脱时间不小于6.0min；上述水溶液与上述纯甲醇溶液的梯度洗脱时间不小于6.0min；流动相的流速为0.2～0.5mL/min。

液相色谱-质谱联用仪的在线过滤器为SSI COL PRE-FILTER WATER1/16 0.5M。

可以理解的是，进样量可以是0.1μL到30μL范围内的任一体积，比如，0.1μL，0.2μL，0.5μL，1μL，5μL，10μL，15μL，20μL，25μL以及30μL。

针对柱温来说，20～40℃是指在20℃到40℃的任一温度，比如，20℃，21℃，22.5℃，23℃，24℃，25℃，27.5℃，29℃，30.5℃，33℃，34℃，35℃，37℃，38.5℃，39℃以及40℃等，在该范围内任一温度下，检测出来的结果大体一致。

针对检测待检测血液中丙戊酸所使用的液相色谱-质谱联用仪来说，质谱条件，包括：液相色谱-质谱联用仪的质谱检测器为ESI(-)模式；所述离子源参数，包括：气流量为8～50L/min，喷雾量为20～50L/min，气体温度为300～400℃，毛细管电压为-5000～-3000V。

针对气流量来说，8～50L/min是指在8L/min到50L/min的任一流速，比如，8L/min，8.5L/min，9L/min，11L/min，14L/min，19L/min，24L/min，28.5L/min，35L/min，38.5L/min，42L/min，44L/min，47.5L/min，49L/min以及50L/min等。

针对喷雾量来说，20～50L/min是指在20L/min到50L/min的任一流速，比如，20L/min，22.5L/min，26L/min，30L/min，32L/min，35.5L/min，36L/min，40L/min，43L/min，46.5L/min以及50L/min等。

针对气体温度来说，300～400℃是指300℃到400℃的任一温度，比如，300℃，320℃，350℃，380℃以及400℃等。

针对毛细管电压来说，-5000～-3000V是指-5000V到-3000V的任一电压，比如，-3000V，-3100V，-3300V，-3500V，-3900V，-4000V，-4200V，-4300V，-4500V，-4700V，-4900V以及-5000V等。

进一步地，液相色谱-质谱联用仪的质谱参数可进一步如下表1所示：

表1

物质名称	母离子	子离子	Dwell	Fragmentor	CE	CAV
							丙戊酸	143	143	200	100	0	7
丙戊酸-d6	149	149	200	100	0	7

上述表中，Dwell表征扫描时间，Fragmentor表征裂解电压，CE表征碰撞电压，CAV表征碰撞池加速电压。

上述实施例中的一种标准溶液中的丙戊酸和丙戊酸-d6的色谱图如图2所示，质谱图如图3所示；其中，图2中的数字标识1为标准溶液中丙戊酸的色谱图，数字标识2为标准溶液中丙戊酸-d6的色谱图；图3中的数字标识1为标准溶液中丙戊酸的质谱图，数字标识2为标准溶液中丙戊酸-d6的质谱图。标准溶液中的丙戊酸和丙戊酸-d6的保留时间分别为2.620min、2.634min。

上述实施例中的待测血液样本中的丙戊酸和丙戊酸-d6的色谱图如图4所示，质谱图如图5所示；其中，图4中的数字标识1为待测血液样本中丙戊酸的色谱图，数字标识2为待测血液样本中丙戊酸-d6的色谱图；图5中的数字标识1为待测血液样本中丙戊酸的质谱图，数字标识2为待测血液样本中丙戊酸-d6的质谱图。待测血液样本中的丙戊酸和丙戊酸-d6的保留时间分别为2.690min、2.734min。

从图2、图3、图4和图5对比可见，待测血液样本中的丙戊酸的保留时间与标注溶液中的丙戊酸的保留时间已知，以丙戊酸-d6为内标物，使得丙戊酸的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确度和灵敏度高。

为了证明本申请溶液中含有一定浓度丙戊酸所存在的线性关系，特作以下实验：

将上述配制的各个浓度的丙戊酸的标准工作液，加入10μL内标工作液，并加入180μL含水量为70％甲醇稀释液混匀进样，按照的上述处理方法及检测条件进行检测，以定量离子色谱峰峰面积与浓度作图，得到标准曲线，结果表明丙戊酸的线性范围和定量限如下：

丙戊酸

(1)检测线(LOD)：0.167mg/L。

(2)定量限(LOQ)：0.5mg/L。

(3)线性范围：2.5mg/L到160mg/L范围内，线性良好，相关系数R2＞0.998。

分别取含丙戊酸的标曲混合中间液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按照的上述处理方法及检测条件进行检测，重复分析测定3批次，丙戊酸的回收率和精密度如下表2所示：

表2

加标量	5mg/L	20mg/L	80mg/L
				平均回收率	100.96％	100.84％	100.50％
精密度RSD	1.69％	0.86％	0.58％

由表2可知，丙戊酸在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为100.50％～100.96％，相对标准偏差为0.58％～1.69％。

综合上述验证试验，本实施例的检测限、回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，方法检测血液中丙戊酸浓度，重现性良好，加样回收率高，提高了检测结果的准确度。

最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。