一种手性多肽类药物非对映异构体杂质的检测方法
阅读说明：本技术 一种手性多肽类药物非对映异构体杂质的检测方法 (Method for detecting chiral polypeptide drug diastereoisomer impurities ) 是由 黄秀坤 胡沙 袁瑜 刘宏 付晓平 于 2021-08-23 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种手性多肽类药物非对映异构体杂质的检测方法,包括以下步骤：S1)多肽药物样品溶解后过滤制得检测样品溶液；S2)采用反相色谱法,以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相,无机盐水溶液为A相,甲醇或乙腈为B相,对检测样品溶液进行梯度洗脱,实现非对映异构体杂质与主成分的分离。该反相色谱分析方法主要解决了常规分析方法无法有效检测出非对映异构体杂质,无法准确进行该药物的定性定量检测,为有效控制产品有关物质,监测产品质量水平提供了检测手段保障。(The invention provides a method for detecting chiral polypeptide drug diastereoisomer impurities, which comprises the following steps: s1) dissolving the polypeptide drug sample and filtering to prepare a detection sample solution; s2) adopting a reversed phase chromatography, taking octadecylsilane chemically bonded silica as a stationary phase, taking an inorganic salt water solution as an A phase and taking methanol or acetonitrile as a B phase, and carrying out gradient elution on the detection sample solution to realize the separation of diastereoisomer impurities and main components. The reversed phase chromatographic analysis method mainly solves the problems that the conventional analysis method cannot effectively detect the diastereoisomer impurities and accurately perform qualitative and quantitative detection on the medicine, and provides a detection means guarantee for effectively controlling related substances of the product and monitoring the quality level of the product.)
技术领域
本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种手性多肽类药物非对映异构体杂质的检测方法。
背景技术
阿片样物质受体是一类主要的G蛋白偶联受体，是内源性阿片肽以及阿片类药物结合靶点，广泛存在于中枢神经系统和外周神经系统。阿片受体激活后对神经系统免疫以及内分泌系统具有调节作用，是目前最强且常用的中枢镇痛药。内源性阿片肽是哺乳动物体内天然生成的阿片样活性物质，目前已知的内源性阿片肽大致分为脑啡肽、内啡肽、强啡肽和新啡肽几类。中枢神经系统中存在其相应的阿片受体，即μ、δ和κ受体。μ受体镇痛活性最强，成瘾性也最强，是产生副作用的主要原因。δ受体成瘾性小，镇痛作用也不明显。κ受体(KOR)镇痛活性介于前两者之间。多肽类KOR激动剂能在不进入中枢的情况下在外周发挥镇痛作用，不会导致呼吸抑制和便秘等毒副作用，且成瘾性更低，因此具有药物成瘾治疗的潜力。
专利CN111233974B报道了一系列具有优异的激动活性的新型KOR激动剂，包括结构如式I-1所示的化合物(化学名：[(S)-1-(D-苯丙氨酰-D-苯丙氨酰-D-亮氨酰-D-赖氨酰)吡咯烷-3-基]硼酸盐酸盐)。化合物I-1的粗品中含有多种工艺杂质、降解杂质以及最难分离的手性异构体杂质(式I-2，化学名：[(R)-1-(D-苯丙氨酰-D-苯丙氨酰-D-亮氨酰-D-赖氨酰)吡咯烷-3-基]硼酸盐酸盐)，这些异构体杂质与主成分的极性差异特别小，理化性质极其类似，在HPLC检测中极难被有效分离，给检测分析带来了极大的挑战，无法有效监测并指导生产获得符合临床所需的样品。因此，开发一种简便、重现性好，稳定可靠的分析方法，监测这些杂质特别是手性非对映异构体杂质的问题，以确保药物开发过程中的质量可控性问题，是目前亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种手性多肽类药物非对映异构体杂质的检测方法，通过色谱条件的合理优化，能使常规检测条件无法检测的非对映异构体杂质被有效检出，从而为保障多肽类药物的质量水平提供了有效监测手段。
为达到上述目的，本发明提供了一种手性多肽类药物非对映异构体杂质的检测方法，包括以下步骤：
S1)多肽药物样品溶解后过滤制得检测样品溶液；
S2)采用反相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，无机盐水溶液为A相，甲醇或乙腈为B相，对检测样品溶液进行梯度洗脱，实现非对映异构体杂质与主成分的分离。
本发明采用HPLC反相色谱法检测该非对映异构体杂质，提供了有效的监测手段，可以准确的进行该药物的定性定量分析，有效保障了该手性多肽类药物的质量。
本发明中，所述多肽药物为[(S)-1-(D-苯丙氨酰-D-苯丙氨酰-D-亮氨酰-D-赖氨酰)吡咯烷-3-基]硼酸盐酸盐粗品(如上式I-1所示)，其中含有[(R)-1-(D-苯丙氨酰-D-苯丙氨酰-D-亮氨酰-D-赖氨酰)吡咯烷-3-基]硼酸盐酸盐杂质(如上式I-2所示)。
本发明所述多肽药物为通过固相或液相合成法获得的多肽化合物。
本发明优选的，所述多肽药物样品溶解的溶剂为极性亲水溶剂。进一步优选为水、甲醇、乙醇、乙腈中的一种或多种。更优选为甲醇、水或者二者的混合液。
所述多肽药物样品在上述极性亲水溶剂中的溶解性为溶解至极易溶解。
本发明优选的，所述检测样品溶液的浓度为≤5mg/ml。更优选为0.5～1mg/ml。
本发明采用反相色谱法，对检测样品溶液进行梯度洗脱，实现非对映异构体杂质与主成分的分离。
所述反相色谱法的反相色谱柱优选为反相C18液相色谱柱或其他柱效相当的色谱柱。更优选为YMC-Pack ODS-AQ或AerisTM PEPTIDE XB-C18色谱柱。进一步优选为YMC-PackODS-AQ，4.6*150mm，3μm或AerisTM PEPTIDE XB-C18液相色谱柱(4.6×250mm，3.6μm)。
本发明优选的，所述A相为硫酸铵水溶液。
所述硫酸铵水溶液的浓度优选为5mM～20mM；进一步优选为5mM。
所述硫酸铵水溶液的pH值优选为1.5～2.5，进一步优选为2.0～2.5。
本发明优选采用硫酸调节硫酸铵水溶液的pH值。
本发明优选的，所述B相为甲醇或乙腈，进一步优选为甲醇。
本发明优选的，所述反相色谱法的条件为：
流速为0.8～1.2ml/min；柱温30～45℃；检测波长220nm；进样量10～100μl。
所述流速进一步优选为0.8、1.0或1.2ml/min；最优选为1.0ml/min。
所述柱温进一步优选为35～45℃，最优选为45℃。
所述检测波长优选为220nm。
所述进样量进一步优选为10～20μl。
在本发明的一些具体实施例中，所述色谱条件如表1所示：
表1本发明色谱条件示例
本发明优选的，所述梯度洗脱具体为：
A相0-10min维持75％，10.01～25min间A相由75％降低至70％，25.01min～35min间A相由70％降低至68％，35.01min～55min间A相由68％降至50％并维持至65min，65.01min～75min流动相A恢复75％进行色谱柱平衡。
本发明通过大量的实验摸索开发了一种独属于手性多肽类药物的非对映异构体的检测方法。实验结果表明，按照上述检测方法获得的检测图谱中，所述的非对映异构体杂质位于主成分药物之前，其相对手性多肽药物的保留时间(RRT)约为0.96。
与现有技术相比，本发明提供了一种手性多肽类药物非对映异构体杂质的检测方法，包括以下步骤：S1)多肽药物样品溶解后过滤制得检测样品溶液；S2)采用反相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，无机盐水溶液为A相，甲醇或乙腈为B相，对检测样品溶液进行梯度洗脱，实现非对映异构体杂质与主成分的分离。该反相色谱分析方法主要解决了常规分析方法无法有效检测出非对映异构体杂质，无法准确进行该药物的定性定量检测，为有效控制产品有关物质，监测产品质量水平提供了检测手段保障。
附图说明
图1为多肽药物粗品的常规HPLC图谱；
图2为实施例1的HPLC分析检测图谱；
图3为实施例2的HPLC分析检测图谱；
图4为比较例1的HPLC分析检测图谱；
图5为比较例2的HPLC分析检测图谱。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的手性多肽类药物非对映异构体杂质的检测方法进行详细描述。
以下实施例中手性多肽药物粗品按照专利CN111233974B实施例2公开的方法制备得到。
实施例1
一种检测手性多肽类药物非对映异构体的方法，包括：
(1)供试品溶液：取手性多肽药物粗品50mg，加水溶解并稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液，摇匀，再用0.22um的有机系滤膜过滤，得到粗品滤液待用。
(2)色谱条件：使用YMC-Pack ODS-AQ，4.6*150mm，3μm色谱柱；以硫酸铵缓冲液(5mmol/L硫酸铵，用硫酸调节pH至2.5)为流动相A，甲醇为流动相B，按下表进行梯度洗脱，流速为1.0ml/min；柱温45℃；检测波长220nm；进样量20μl。
(3)检测，按下表2梯度运行：
表2实施例1梯度洗脱条件
图1为多肽药物粗品常规HPLC图谱，可以看出，手性非对映异构体和主峰重叠。
本实施例的HPLC分析检测图谱见附图2，主成分保留时间104.273min，手性非对映异构体杂质保留时间98.000min。经过计算：本实施例的非对映异构体杂质与主成分能够有效分离，分离度为1.46。
实施例2
一种检测手性多肽类药物非对映异构体的方法，包括：
(1)供试品溶液：取手性多肽药物粗品50mg，加水溶解并稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液，摇匀，再用0.22um的有机系滤膜过滤，得到粗品滤液待用。
(2)色谱条件：使用AerisTM PEPTIDE XB-C18液相色谱柱(4.6×250mm，3.6μm)；以硫酸铵缓冲液(5mmol/L硫酸铵，用硫酸调节pH至2.2)为流动相A，甲醇为流动相B，按下表进行梯度洗脱，流速为1.0ml/min；柱温45℃；检测波长220nm；进样量20μl。
(3)检测，按下表3梯度运行：
表3实施例2梯度洗脱条件
经过计算：本实施例的非对映异构体杂质与主成分能够完全有效分离，分离度为1.45。
HPLC分析检测图谱见附图3。
比较例1
一种检测手性多肽类药物非对映异构体的方法，包括：
(1)供试品溶液：取手性多肽药物粗品50mg，加水溶解并稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液，摇匀，再用0.22um的有机系滤膜过滤，得到粗品滤液待用。
(2)色谱条件：使用AQ-C18液相色谱柱(4.6×250mm，5μm)；以氯化铵缓冲液(10mmol/L硫酸铵，用盐酸调节pH至2.5)为流动相A，甲醇为流动相B，按下表进行梯度洗脱，流速为1.0ml/min；柱温40℃；检测波长220nm；进样量10μl。
(3)检测，按下表4梯度运行：
表4比较例1梯度洗脱条件
经过计算：本比较例的检测方法能检出非对映异构体杂质，很显然在洗脱梯度没有变化，仅更换流动相，色谱柱等其他色谱条件的情况下，其与主成分不能够完全有效分离，分离度仅为1.0，不能实现准确积分与定量要求。
HPLC分析检测图谱见附图4。
比较例2
一种检测手性多肽类药物非对映异构体的方法，包括：
(1)供试品溶液：取手性多肽药物粗品50mg，加水溶解并稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液，摇匀，再用0.22um的有机系滤膜过滤，得到粗品滤液待用。
(2)色谱条件：使用DAISOPAK SP-ODS-P(C18)液相色谱柱(4.6×250mm，5μm)；以硫酸铵缓冲液(5mmol/L硫酸铵，用硫酸调节pH至2.5)为流动相A，甲醇为流动相B，按下表进行梯度洗脱，流速为1.2ml/min；柱温30℃；检测波长220nm；进样量20μl。
(3)检测，按下表5梯度运行
表5比较例2梯度洗脱条件
经过计算：本实施例的检测方法能检出非对映异构体杂质，很显然在洗脱梯度、流动相没有变化，仅更换色谱柱、流速、柱温等其他色谱条件的情况下，其与主成分不能够完全有效分离，分离度仅为0.7，不能实现准确积分与定量要求。
HPLC分析检测图谱见附图5。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。