阅读说明：本技术 一种测定细胞基质中尿囊素浓度的衍生化结合lc-ms方法 (derivatization combined LC-MS method for determining allantoin concentration in cell matrix ) 是由 吴凌云 於江华 王晓霞 彭帅 于 2019-10-26 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种测定细胞基质中尿囊素浓度的衍生化结合LC-MS方法,该方法利用尿囊素碱水解和酸水解后生成的乙醛酸与2,4-二硝基苯肼发生缩合反应,形成稳定衍生物乙醛酸-2,4-二硝基苯腙,该衍生物具有较高的质谱电喷雾离子化效率,利用5-硝基吲哚-2-甲酸作为内标物,能够对细胞样品中的尿囊素进行定量化的分析。(The invention provides a derivatization combined LC-MS method for determining the concentration of allantoin in a cell matrix, which utilizes glyoxylic acid generated after the alkali hydrolysis and acid hydrolysis of the allantoin to perform condensation reaction with 2, 4-dinitrophenylhydrazine to form a stable derivative glyoxylic acid-2, 4-dinitrophenylhydrazone, wherein the derivative has higher mass spectrum electrospray ionization efficiency, and 5-nitroindole-2-formic acid is used as an internal standard substance to quantitatively analyze the allantoin in a cell sample.)

一种测定细胞基质中尿囊素浓度的衍生化结合LC-MS方法

技术领域

本发明属于分析化学方法领域,具体涉及一种利用衍生化结合LC-MS技术测定细胞中尿囊素浓度的方法。

技术背景

尿囊素铝，别名二羟基尿囊素铝；尿羟铝；胃肠宁；为制酸及胃黏膜保护药，上市剂型片剂：100mg，含尿囊素55mg、氢氧化化铝45mg。尿囊素铝的药理作用：能加速损伤部位正常肉芽组织的生长及促进黏膜上皮细胞的再生。尿囊素铝的适应证：消化道黏膜保护药。用于胃溃疡、十二指肠球部溃疡、慢性胃炎。尿囊素铝中，尿囊素的结构式如下：尿囊素是尿素的衍生物，农业和轻化工领域。尿囊素广泛存在于自然界，如胎儿的尿以及除人和类人猿以外的其他所有哺乳动物的尿囊液中都含有尿囊素。在一些植物体中，如烟草籽、麦种、甜菜、药用倒提壶草、紫藤花及紫草科中的雏菊根中也含有尿囊素。

现有尿囊素的检测方法还有有液相色谱串联三重四级杆质谱法，这种方法往往会使用13C1,15N1-尿囊素作为同位素内标，其中有的为增加尿囊素在色谱柱上的保留会使用正相色谱柱，这种方法对仪器和内标的都有较高的要求，成本较高。另一种方法则是衍生化结合HPLC法，可在360nm处进行定量检测，但是这种方法的灵敏度较低，无法检测微量的内源性物质。如《中南药学》2008年02期公开了一种衍生化法测定糖尿乐胶囊中尿囊素的含量.《中国新药杂志》2004年第5期435-438,柱前衍生高效液相色谱法测定人血浆中尿囊素浓度,公开了建立血浆中尿囊素的浓度测定方法，尿囊素与2,4-二硝基苯肼(DNPH)反应生成2,4-二硝基苯腙,内标为加替沙星，结果:在此色谱条件下,尿囊素衍生物与血浆中其他成分的分离完全，可用于人体血浆中尿囊素浓度的测定。

本发明提供一种衍生化结合LC-MS方法，该方法能够精确测定细胞样品中由外源性尿囊素水解产生的乙醛酸和细胞基质中的内源性乙醛酸，从而计算出尿囊素的真实含量。乙醛酸是一种基本有机化工原料，广泛应用于医药和日用化学品领域。内源性乙醛酸是植物体中光呼吸的中间产物，也有文献报道动物的血浆和尿液中也含有内源性的乙醛酸。乙醛酸的结构式如下：

本发明的方法实现了对细胞基质中的极性小分子尿囊素进行准确的定量分析，避免了由生物样品中较多内源性极性小分子产生的较强的基质效应以及含盐样品使用正相柱分析对色谱柱及仪器产生的损害，突破了液相色谱串联三重四级杆质谱(LC-MS/MS)结合¹³C₁,¹⁵N₁-尿囊素作为同位素内标的方法对仪器和内标具有较高要求的限制，弥补了衍生化结合HPLC法灵敏度较差，无法准确定量微量尿囊素的不足。

发明内容

本发明的目的是，采用衍生化结合液质联用(HPLC-MS、LC-MS)技术，又叫液相色谱-质谱联用技术测定细胞中的尿囊素浓度,以避免直接测定极性小分子时易受到基质中其他内源性极性小分子物质干扰而造成基质效应过强的问题。

为了实现本发明的上述目的,本发明提供了如下技术方案：

一种测定细胞基质中尿囊素浓度的衍生化结合LC-MS方法，精确测定细胞中内/外源性乙醛酸浓度,该方法利用尿囊素水解生成乙醛酸，乙醛酸与2,4-二硝基苯肼发生反应，生成稳定的衍生产物乙醛酸-2,4-二硝基苯腙。衍生物具有较高的质谱电喷雾离子化效率，同时利用与衍生产物结构和分子量相似的内标物5-硝基吲哚-2-甲酸，结合液质联用技术，对细胞中的尿囊素进行定量化的分析。

为此，本发明提供一种测定细胞基质中尿囊素浓度的衍生化结合LC-MS方法，所述方法，步骤如下：

步骤1，待测样品检测溶液的制备：

取10μL转运样品液，加入90μL空白细胞基质，20μL 0.3mol/L NaOH于85℃水浴锅中反应60min,再加入40μL 0.25mmol/L DNPH于85℃水浴锅中反应20min得反应产物GLX-DNPH(液态)；

步骤2，标准品溶液的制备：

取100μL尿囊素液(见说明书【0012】)，加入20μL0.3mol/L NaOH于85℃水浴锅中反应60min,再加入40μL 2.5mmol/L DNPH于85℃水浴锅中反应20min得反应产物GLX-DNPH(液态)；取反应产物16μL，于冰盒上加入84μL空白细胞基质，再加入20μL0.6mol/L NaOH、40μL2mol/L HCl；

步骤3，内标溶液的制备：

称取10.31mg 5-硝基吲哚-2-甲酸于50ml量瓶中，用甲醇定容至刻度线，即得1000μmol/L的母液，用超纯水稀释至1.5μmol/L备用；

步骤4，检测：

分别向160μL待测样品检测溶液和标准品溶液中加入40μL 1.5μmol/L的内标溶液和200μL乙腈沉淀蛋白，过滤，得待测样品的细胞转运实验样品溶液，和标准曲线制备样品溶液，将标准曲线制备样品溶液配制成浓度为0.08，0.16，0.31，0.63，1.25，2.5，3.75，5μmol/L的样品，样品各自混匀后，12000rpm，4℃，离心10min,取上清液130μL进样于LC-MS，得到色谱图，根据标准曲线制备样品色谱图绘制标准曲线，根据待测样品色谱图和标准曲线，计算待测样品尿囊素浓度；

其中：色谱条件如下：

色谱柱VP-ODS column(2.0mm i.d.×150mm,4.6μm,Shimadzu,Kyoto,Japan)，5mM甲酸铵为A相，90％乙腈为B相，流动相的流速为0.3ml/min，进样量为5μL，梯度洗脱程序为0.01-4.50min:22％B，4.50-10.00:22％B-35％B，10.00-12.00min:35％-90％B，12.00-15.00:90％B，15.00-17.00min:90％-22％B，17.00-22.00min:22％B；质谱采集时间为22min；接口电压为-3.5kv；雾化气流速为1.5L/min；干燥气流速为15L/min；。

其中，

转运样品液：Caco-2细胞转运实验得到的细胞样品；称为转运样品液或质控样品工作液，Caco-2细胞转运实验见实施例2。

标准品的来源：尿囊素标准品(中国食品药品检定研究院)

内标的来源：5-硝基吲哚-2-甲酸(纯度≥98％，源叶生物)；

空白细胞基质：细胞温孵2h的HBSS缓冲液。

细胞内/外源性乙醛酸：细胞内源性乙醛酸——Caco-2细胞自身含有的乙醛酸；

细胞外源性乙醛酸——外加的尿囊素在Caco-2细胞转运实验中水解产生的乙醛酸。

尿囊素在碱性(如氢氧化钠)条件下水解生成乙醛酸的过程：

乙醛酸与2,4-二硝基苯肼发生反应，生成稳定的衍生产物乙醛酸-2,4-二硝基苯腙的过程：

衍生物乙醛酸-2,4-二硝基苯腙的定量下限可达到0.08μmol/L，远远高于直接检测细胞基质中的尿囊素。

根据所述的一种测定细胞基质中尿囊素浓度的衍生化结合LC-MS方法，该方法利用衍生化反应实现用反相色谱分析极性分子，提高质谱离子化效率，降低基质效应，且降低实验所用仪器及试剂的成本。

本发明实验方法是经过筛选获得的，筛选过程如下。

使用试剂：尿囊素原料药(无锡济民可信山禾药业有限公司提供，纯度＞99％)；2,4-二硝基苯肼(纯度≥99％，Adamas-beta)；5-硝基吲哚-2-甲酸(纯度≥98％，源叶生物)；乙腈、甲醇(色谱纯，美国Tedia公司)。

分别配制尿囊素、内标物及衍生物母液。精密称取15.81mg尿囊素于100ml量瓶中，用超纯水定容至刻度线，即1000μmol/L的母液；用超纯水稀释得标准曲线工作液：0.8，1.6，3.1，6.3，12.5，25，37.5，5μmol/L；质控样品工作液：0.8，2.35，12.5，37.5μmol/L。精密称取10.31mg 5-硝基吲哚-2-甲酸于50ml量瓶中，用甲醇定容至刻度线，即得1000μmol/L的母液，用超纯水稀释至1.5μmol/L备用。精密称取24.77mg 2,4-二硝基苯肼于25ml量瓶中，用2mol/L的HCl定容至刻度线，即得5mmol/L的母液，用2mol/L的HCl稀释至0.5mmol/L备用。

衍生化反应:尿囊素在85℃下碱水解60min，然后继续在85℃下与衍生试剂2,4-二硝基苯肼反应20min，最后加入内标5-硝基吲哚-2-甲酸和乙腈(用于沉淀蛋白)，低温高速离心后放入液相小瓶中进行液质分析。

所述衍生化反应的条件为：尿囊素在85℃下碱水解60min，然后在85℃下与衍生试剂反应20min，最后加入内标和乙腈，离心后进行液质分析。

本发明中制备不含内源性乙醛酸干扰的标准曲线及测定空白基质中的内源性乙醛酸浓度和质控样品中真实的尿囊素浓度，具体样品制备方法见实施例1。

根据所述一种测定细胞基质中尿囊素浓度的衍生化结合LC-MS方法，测定细胞样品中尿囊素浓度的方法，同上述校正标样。

本发明所述待测样品取自Caco-2细胞转运实验。具体样品制备方法见实施例2。

与现有技术相比，该发明方法具有高灵敏度，对尿囊素具有高特异性，且基质效应小，其优点在于:

(1)能够精确测定细胞样品中由外源性尿囊素水解产生的乙醛酸和细胞基质中的内源性乙醛酸，从而计算出外源性尿囊素的真实含量。

(2)能够使用反相色谱对细胞基质中的极性小分子尿囊素进行准确的定量分析。

(3)可以避免由生物样品中较多内源性极性小分子产生的较强的基质效应以及含盐样品使用正相柱分析对色谱柱及仪器产生的损害。

(4)相比于液相色谱串联三重四级杆质谱(LC-MS/MS)结合¹³C₁,¹⁵N₁-尿囊素作为同位素内标的方法，大大降低了对仪器和内标的较高要求，同时也弥补了衍生化结合HPLC法灵敏度较差，无法准确定量微量尿囊素的不足。

本发明方法利用衍生化反应实现用反相色谱分析极性分子，提高质谱离子化效率，降低基质效应，且降低实验所用仪器及试剂的成本。

本发明方法和现有技术中的如《中国新药杂志》2004年第5期435-438,柱前衍生高效液相色谱法测定人血浆中尿囊素浓度,的方法相比，差别在于：

本方法与《中国新药杂志》2004年第5期435-438使用的方法，所用的检测器不一样，本方法使用质谱检测器，而之前的方法使用的是PDA检测器。优点在于：使用质谱检测器使得灵敏度大大提升，不仅能测得微量的尿囊素浓度，甚至可以检测细胞基质中的内源性乙醛酸的含量。

附图说明

图1尿囊素衍生化反应原理图

图2LC-MS方法学专属性色谱图(A.不含内源性乙醛酸的真正空白基质B.LLOQ C.空白基质D.渗透性实验样品)

图3不同浓度尿囊素铝的AP→BL侧和BL→AP侧的表观渗透系数(P_app)图

具体实施方式

下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容,但并不以此来限定本发明。

本发明实施例的数据采集和处理按以下方法进行:

该发明所涉及的所有的液质联用实验均在Shimadzu LC-MS202上进行。使用SHIMADZU色谱柱(2.0mm i.d.×150mm,4.6μm)及Shimadzu保护柱((2.0mm i.d.×5mm,4.6μm)用于尿囊素衍生物的分离，采用5mM的甲酸铵(A)和90％乙睛(B)为流动相，进行梯度洗脱。

质谱离子源为电喷雾离子源(ESI),采用负离子SIM模式采集数据，产物乙醛酸-2,4二硝基苯腙在负离子模式(m/z 253)下有强响应，内标5-硝基吲哚-2-甲酸在负离子模式(m/z 205)下有强响应。

实施例1：

为了证实利用衍生化结合LC-MS方法测定细胞中尿囊素浓度的准确性,本发明首先制备了一系列用于标准曲线的校正样品和质控样品,考察该发明方法是否满足分析方法学的要求，并测定细胞基质中内源性乙醛酸的含量。

使用试剂：尿囊素标准品(中国食品药品检定研究院，纯度＞99％)；2,4-二硝基苯肼(纯度≥99％，Adamas-beta)；5-硝基吲哚-2-甲酸(纯度≥98％，源叶生物)；乙腈、甲醇(色谱纯，美国Tedia公司)。

分别配制尿囊素、内标、衍生试剂溶液：

尿囊素标准曲线工作液和质控样品工作液：精密称取15.81mg尿囊素于100ml量瓶中，用超纯水定容至刻度线，即得1000μmol/L的母液。用超纯水稀释得标准曲线工作液：0.8，1.6，3.1，6.3，12.5，25，37.5，50μmol/L；质控样品工作液：0.8，2.35，12.5，37.5μmol/L。

内标溶液：精密称取10.31mg 5-硝基吲哚-2-甲酸于50ml量瓶中，用甲醇定容至刻度线，即得1000μmol/L的母液，用超纯水稀释至1.5μmol/L备用。

衍生化试剂溶液：精密称取24.77mg 2,4-二硝基苯肼于50ml量瓶中，用2mol/L的HCl定容至刻度线，即得2.5mmol/L的母液，用2mol/L的HCl稀释至0.25mmol/L备用。

标准曲线样品衍生化：取100μL标准曲线工作液，加入20μL 0.3mol/L NaOH于85℃水浴锅中反应60min,再加入40μL 2.5mmol/L DNPH于85℃水浴锅中反应20min得反应产物GLX-DNPH；取反应产物16μL，于冰盒上(避免内源性乙醛酸与DNPH反应)及加入84μL空白细胞基质(细胞温孵2h的空白HBSS缓冲液)20μL 0.6mol/L NaOH、40μL 2mol/L HCl。

质控样品衍生化：取10μL质控样品工作液，加入90μL空白细胞基质(或直接取100μL空白基质)，20μL 0.3mol/L NaOH于85℃水浴锅中反应60min,再加入40μL 0.25mmol/LDNPH于85℃水浴锅中反应20min得反应产物GLX-DNPH。

衍生化后处理：向衍生化反应后的标准曲线样品和质控样品(160μL)中加入40μL1.5μmol/L的5-硝基吲哚-2-甲酸(内标)和200μL乙腈沉淀蛋白，即得标准曲线样品(0.08，0.16，0.31，0.63，1.25，2.5，3.75，5μmol/L)和质控样品(0.08，0.235，1.25，3.75)。涡旋混匀，12000rpm，4℃，离心10min,取上清液130μL进样于LC-MS。

结果表明，该方法专属性、精密度、准确度、回收率和稳定性均满足生物样品定量分析方法验证指导原则要求(专属性见图2)。细胞基质中内源性乙醛酸浓度为0.442±0.057μM。

实施例2:

通过建立Caco-2细胞模型测定尿囊素铝转运实验中的表观渗透系数(P_app)。

尿囊素铝溶于水中后分解为尿囊素和氢氧化铝，故以尿囊素为测定对象。其用于治疗胃及十二指肠溃疡、慢性胃炎、胃窦炎和药物性胃炎等；也可制成外用制剂用于治疗溃疡、创伤等，可促使其愈合。尿囊素铝的结构式如下：

使用试剂：尿囊素铝原料药(无锡济民可信山禾药业有限公司提供，纯度＞99％)；尿囊素原料药(中国食品药品检定研究院，纯度＞99％)；

2,4-二硝基苯肼(纯度≥98％，Adamas-beta)；5-硝基吲哚-2-甲酸(纯度≥98％，源叶生物)。

DMEM高糖培养基(Gibco)；高灭活胎牛血清(Gibco)；青霉素/链霉素(江苏凯基生物技术股份有限公司)；0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液(江苏凯基生物技术股份有限公司)；HBSS溶液(Gibco，不含钙镁及酚红)；NAOH(国药集团化学试剂有限公司)；HCl(优级纯，永华化学科技有限公司)；乙腈、甲醇(色谱纯，美国Tedia公司)。

使用材料：24孔Transwell板(膜面积0.33cm²,CorningIncorporated)。

配制尿囊素铝HBSS给药溶液：精密称取10.91mg尿囊素铝于50ml量瓶中，用HBSS缓冲液定容至刻度线，即得1000μmol/L的母液。母液过0.22μm微孔滤膜后用HBSS缓冲液稀释得尿囊素铝HBSS给药溶液：62.5，125，187.5，250μmol/L。

转运实验：正式实验前两小时更换新的培养基，将培养21d的细胞用PH7.4的HBSS缓冲溶液在37℃培养20min后，测TEER值选取大于500Ωcm²且细胞生长形态完好的Transwell小室，HBSS清洗3遍，洗去细胞单层表面的杂质。分别考察浓度、时间对尿囊素铝细胞转运的影响。当转运方向为Apical(肠腔侧，AP)→Basolateral(基底侧，BL)时，在AP侧加入200μL PH7.4的尿囊素铝药物溶液作为供给液，在BL侧加入600μL PH7.4的空白HBSS作为接收液，将Transwell板放置于37℃恒温摇床中，分别在30、60、90、120min时吸取100μLBL侧的接收液，并补加100μL空白HBSS。当转运方向为BL→AP时，在BL侧加入600μL PH7.4的尿囊素铝药物溶液作为供给液，在AP侧加入200μL PH7.4的空白HBSS作为接收液，在120min时吸取100μL AP侧的接收液。

转运样品衍生化及衍生化后处理：取100μL转运样品，20μL 0.3mol/L NaOH于85℃水浴锅中反应60min,再加入40μL 0.25mmol/L DNPH于85℃水浴锅中反应20min得反应产物GLX-DNPH。向衍生化反应后的转运样品(160μL)中加入40μL 1.5μmol/L的5-硝基吲哚-2-甲酸(内标)和200μL乙腈沉淀蛋白。涡旋混匀，12000rpm，4℃，离心10min，取上清液130μL进样于LC-MS。

结果表明：P_app(AP→BL)均值为4.74×10^-6cm/s，P_app(BL→AP)均值为3.59×10^{- 6}cm/s，P_app(BL→AP)与P_app(AP→BL)的比值R为0.76，说明尿囊素铝为中等程度吸收，且吸收过程中可能没有外排转运体的参与。