阅读说明：本技术 双组氨酸/铁皮石斛多糖复合抗菌剂及制备方法和应用 (Double-histidine/dendrobium officinale polysaccharide composite antibacterial agent and preparation method and application thereof ) 是由 崔海英 张承慧 林琳 戴锦铭 于 2019-08-30 设计创作，主要内容包括：本发明属于食品安全领域,具体涉及一种双组氨酸/铁皮石斛多糖复合抗菌剂及制备方法和应用。铁皮石斛多糖是铁皮石斛中的主要活性成分,可有效清除自由基,且对部分细菌具有良好抗菌能力。双组氨酸是一种新型的生物自组装材料之一,合成成本较高。因此,本发明将双组氨酸和铁皮石斛多糖按一定比例制备了复合抗菌剂,且将其用于抑制磷酸缓冲液和模拟牛肉培养基中的大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus),结果显示均具有显著的抗菌效果。(The invention belongs to the field of food safety, and particularly relates to a double-histidine/dendrobium officinale polysaccharide composite antibacterial agent, and a preparation method and application thereof. The dendrobium officinale polysaccharide is a main active ingredient in dendrobium officinale, can effectively remove free radicals, and has good antibacterial capability on partial bacteria. The double-histidine is one of novel biological self-assembly materials, and the synthesis cost is high. Therefore, the composite antibacterial agent is prepared from the double histidine and the dendrobium officinale polysaccharide according to a certain proportion, and the composite antibacterial agent is used for inhibiting escherichia coli (E.coli) and staphylococcus aureus (S.aureus) in a phosphate buffer solution and a simulated beef culture medium, and the results show that the composite antibacterial agent has obvious antibacterial effect.)

双组氨酸/铁皮石斛多糖复合抗菌剂及制备方法和应用

技术领域

本发明属于食品安全领域，具体涉及一种双组氨酸/铁皮石斛多糖复合抗菌剂及制备方法和应用。

背景技术

复合抗菌剂由于可解决某种单一抗菌剂的抗菌性能缺陷，并能够结合其它抗菌剂抗菌性能方面的优点而具有更强的抗菌功能。它包括有机-无机、有机-有机、无机-无机等多种复配方式，最终得到成本低，抗菌性能好的抗菌剂。因此，复合抗菌剂的研究成为了关注点。

多糖是自然界广泛存在的一类生物大分子，是构成生命的四大基本物质之一。它不仅广泛参与各种生命活动，而且还具有抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、清除自由基，抗菌等作用。铁皮石斛是兰科石斛属多年生附生草本植物，是我国名贵中草药之一。它具有益胃生津、滋阴清热的功效。其化学成分主要是多糖、生物碱、菲类、糖苷类以及氨基酸等。已有研究表明铁皮石斛中主要的生物活性物质是多糖类化合物且含量较高。铁皮石斛多糖在抗菌，抗氧化功能以及产品开发方面的价值是当前研究的热点。

双组氨酸(dihistidine,His-His,HH)是由两个组氨酸脱水缩合而成的，含有两个苯环，一端是-NH₂，一端是-COOH，因此在等电点时以兼性离子形式存在，是制备生物功能性纳米材料的重要基元，其生物活性也具有研究价值。目前，其作为一种新型的生物自组装材料成为研究热点。

本发明将铁皮石斛多糖和双组氨酸按比例混合，制备复合抗菌剂，提高了法复合抗菌剂的抗菌活性，能够有效抑制食源性病原菌的生长繁殖，延长食品货架期。

发明内容

本发明的目的是提供一种双组氨酸/铁皮石斛多糖复合抗菌剂的制备方法及其在食品安全领域的应用。

本发明的制备方法是将铁皮石斛多糖溶液和双组氨酸溶液按一定比例混合，得到复合抗菌剂，拓展其在食品安全领域的应用。

所述铁皮石斛多糖溶液是将铁皮石斛多糖溶于无菌蒸馏水中，使铁皮石斛多糖质量分数为30-40％。

所述双组氨酸溶液的制备是先将双组氨酸溶解于***中，然后置于磁力搅拌器搅拌2min(300rpm)，最后加入无菌蒸馏水，使双组氨酸溶液质量分数为20-25％。

所述复合抗菌剂的制备是将铁皮石斛多糖溶液和双组氨酸溶液复配，按质量分数计算，双组氨酸溶液0.5％-10.0％，铁皮石斛多糖溶液1.0％-8.0％，余量为无菌蒸馏水，混合后磁力搅拌10min(200rpm)。

通过两者的协同作用得到具有高抗菌活性的复合抗菌剂，同时解决单独使用双组氨酸抗菌剂成本高及单独使用铁皮石斛多糖抗菌活性低的缺点。

附图说明

图1复合抗菌剂在磷酸缓冲液中对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌效果。

图2复合抗菌剂在牛肉肉汤中对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌结果。

具体实施方式

通过下面实例说明本发明的具体实施方式，但本发明的保护内容，不仅局限于此。

实施例1双组氨酸/铁皮石斛多糖复合抗菌剂的制备

1实验材料与设备

铁皮石斛多糖

双组氨酸 国肽生物科技有限公司

*** 国药集团化学试剂有限公司

磁力搅拌器 上海志威电器有限公司

2.试验方法

双组氨酸/铁皮石斛多糖复合抗菌剂的制备方法如下：

1)将双组氨酸溶于***后置于磁力搅拌器上室温搅拌，搅拌条件为：200rpm，1min。

2)加入蒸馏水使双组氨酸溶液质量分数为20％。

3)将铁皮石斛多糖溶于无菌蒸馏水中，使铁皮石斛多糖质量分数为35％。

4)将双组氨酸溶液和铁皮石斛多糖溶液按一定比例混合，按质量分数计算为：双组氨酸溶液4.0％，铁皮石斛多糖溶液6.0％，余量为无菌蒸馏水。混合后磁力搅拌，搅拌条件为200rpm，10min。

5)实施例2双组氨酸/铁皮石斛多糖复合抗菌剂抗菌能力评价

1实验材料与设备

2实验方法

1)将E.coli和S.aureus接种于营养肉汤液体培养基中，在37℃分别振荡(150rpm)培养24h和48h。

2)将对数生长期的E.coli和S.aureus加入到无菌磷酸缓冲液中，梯度稀释至10⁴-10⁵CFU/mL，然后添加抗菌剂(复合抗菌剂、双组氨酸溶液和铁皮石斛多糖溶液)，使E.coli菌悬液中抗菌剂质量分数为0.4％，S.aureus菌悬液中抗菌剂质量分数为0.3％。抗菌剂包括三类，它们之间做对比，因此要在菌悬液中保持相同浓度，故E.coli菌悬液中抗菌剂浓度统一为0.4％，S.aureus菌悬液中抗菌剂浓度统一为0.3％。

3)将添加了抗菌剂的细菌悬浮液在37℃条件下培养3d，然后利用平板计数法每隔1d测定残存菌数。不做任何处理的E.coli和S.aureus菌悬液作为空白组。

4)试验重复三次，取平均值。

3实验结果

由图1可以看出，铁皮石斛多糖、双组氨酸和复合抗菌剂对E.coli和S.aureus都起到了抑制效果，其中复合抗菌剂的抗菌效果最佳，且效果显著高于单一抗菌剂。用复合抗菌剂处理3d后对E.coli和S.aureus的杀菌率分别达到99.92％和99.98％。

实施例3双组氨酸/铁皮石斛多糖复合抗菌剂在模拟牛肉培养基中抗菌能力评价

1实验材料与设备

2实验方法

1)购买新鲜牛肉，洗净，切丁。将牛肉和磷酸缓冲液(PBS)以质量比1:9混合，然后转移至均质袋均质，纱布过滤后得到模拟牛肉培养基。

2)将模拟牛肉培养基等体积分装到试管中，121℃高压蒸汽灭菌30min备用。

3)向各试管分别接种E.coli和S.aureus，使试管中E.coli和S.aureus浓度大致为10³CFU/mL。

4)向E.coli和S.aureus菌悬液中添加抗菌剂(复合抗菌剂、双组氨酸溶液和枸杞多糖溶液)，使E.col菌悬液中抗菌剂的质量分数为0.55％，使S.aureus菌悬液中抗菌剂的质量分数为0.45％。不做任何处理的E.coli和S.aureus作为空白组。

5)将试管放入37℃的恒温培养箱中培养3天，每隔24h利用平板涂布计算其残存菌数。

6)试验重复三次，取平均值。

3.试验结果

如图2所示，不添加抗菌剂的牛肉肉汤中，E.coli和S.aureus的数量在1d内迅速增长至10⁷CFU/mL，说明模拟牛肉培养基内的营养物质促进了E.coli和S.aureus的生长增殖。经铁皮石斛多糖、双组氨酸处理后，均起到了抑制E.coli和S.aureus的作用。但经复合抗菌剂处理后，与空白组和单一抗菌剂组相较，E.coli和S.aureus数量显著降低，说明复合抗菌剂可用于牛肉保鲜，应用于食品安全领域。