可溶性肾素(原)受体用于治疗代谢紊乱及相关疾患的用途
阅读说明：本技术 可溶性肾素(原)受体用于治疗代谢紊乱及相关疾患的用途 (Soluble feritin (original) receptor is used to treat the purposes of metabolic disorder and related disorders ) 是由 T·杨 于 2018-03-14 设计创作，主要内容包括：公开了治疗肥胖症或肥胖症相关疾患的方法,所述方法包括向肥胖或患有肥胖症相关疾患的受试者施用有效量的可溶性肾素(原)受体(sPRR)。在一些情况下,肥胖症相关疾患可以是但不限于脂肪变性、高血糖症、胰岛素抵抗、慢性肾病。公开了减轻体重的方法,所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的sPRR。公开了治疗受试者的脂肪肝的方法,所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的sPRR。公开了治疗体液和电解质紊乱的方法,所述方法包括向诊断为患有体液和电解质紊乱的受试者施用有效量的sPRR。(The method for the treatment of obesity or obesity related disorders is disclosed, the method includes to obesity or a effective amount of soluble feritin (original) receptor (sPRR) of the application of the subject with obesity related disorders.In some cases, obesity related disorders can be but not limited to steatosis, hyperglycemia, insulin resistance, chronic kidney disease.The method to lose weight is disclosed, the method includes applying a effective amount of sPRR to subject in need.The method of the fatty liver for the treatment of subject is disclosed, the method includes applying a effective amount of sPRR to subject in need.The method for the treatment of body fluid and electrolyte disturbance is disclosed, the method includes applying a effective amount of sPRR to the subject for being diagnosed as suffering from body fluid and electrolyte disturbance.)
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年3月14日提交的美国临时申请No.62/471,140的权益，所述临时申请以引用的方式整体并入本文。
关于联邦政府资助研究的声明
本发明是在美国国立卫生研究院授予的DK094956和DK104072的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
背景技术
在过去的二十年中，超重和肥胖者的患病率急剧上升。目前，美国有65％的成年人超重，有31％的成年人肥胖。肥胖症是2型糖尿病、脂肪变性、慢性肾病和其他慢性疾病的主要危险因素。因此，有1800万美国人患有糖尿病，每分钟都有另一名美国人被诊断出患有这种疾病。可用的疗法或对肥胖症和肥胖症相关疾患的控制是有限的。特别地，这些疗法大多数针对代谢综合征的各个组成部分。迫切需要开发一种靶向这种疾病的全部或大多数关键组成部分的新颖疗法。噻唑烷二酮(TZD)，例如罗格列酮和吡格列酮，是合成的PPARγ活化剂，它们由于其胰岛素敏化作用而对控制高血糖症非常有效，但其对脂质谱的有益作用有限，且甚至会使肥胖症恶化。TZD与诸如水肿、体重增加和慢性心力衰竭的发生率增加等主要副作用相关联。在干预措施中需要广泛涉及代谢综合症的多个组成部分，包括肥胖症、高血糖症、脂肪变性和慢性肾病。
发明内容
全长肾素(原)受体(PRR)是肾素原和肾素的具有350个氨基酸的跨膜受体，可使其经受蛋白酶介导的裂解，产生由N端胞外结构域、可溶性肾素(原)受体(sPRR)和8.9kDa C端胞内结构域(称为“M8.9”)组成的28kDa蛋白。本文描述了基于sPRR的干预措施，广泛涉及代谢综合症的多个组成部分，包括肥胖症、高血糖症、脂肪变性和慢性肾病。
本文公开了治疗肥胖症或肥胖症相关疾患的方法，所述方法包括向肥胖或患有肥胖症相关疾患的受试者施用有效量的可溶性肾素(原)受体(sPRR)。在一些情况下，肥胖症相关疾患可以是但不限于脂肪变性、高血糖症、胰岛素抵抗、慢性肾病。
本文公开了减轻体重的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的sPRR。
本文公开了治疗受试者的脂肪肝的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的sPRR。
本文公开了治疗体液和电解质紊乱的方法，所述方法包括向诊断为患有体液和电解质紊乱的受试者施用有效量的sPRR。
本文公开了治疗代谢紊乱的方法，所述包括向诊断为患有代谢紊乱的受试者施用有效量的sPRR。
在一些情况下，sPRR可以是融合蛋白。在一些情况下，sPRR可以是野生型sPRR。在一些情况下，sPRR与野生型sPRR 70％-99％相同。
所公开的方法和组合物的另外的优点将在下面的描述中部分地阐述，并且从所述部分中将会部分地理解，或者可以通过实践所公开的方法和组合物而获知。所公开的方法和组合物的优点将通过所附权利要求中特别指出的要素和组合来实现和获得。应当理解，前面的一般性描述和随后的详细描述都只是示例性和说明性的，而不是对所要求保护的本发明的限制。
附图说明
并入本说明书并构成本说明书一部分的附图示出了所公开的方法和组合物的几个实施方案，并且与说明书一起用于解释所公开的方法和组合物的原理。
图1A-图1M示出了针对PRR的不同结构域的抗体的不同标记。(A-C)在连续大鼠肾脏切片上进行免疫染色，使用识别PRR的N端结构域(例如sPRR序列)的抗PRR-N抗体(放大率：A中为200×；B中为400×)，和识别PRR的C端结构域的抗PRR-C抗体(C；放大率：400倍)。(D-F)将PRR抗体与抗AQP2抗体一起共孵育。(G-I)合并图像。B和E中的箭头表示主细胞；C和F中的箭头表示夹层细胞。抗PRR-N抗体标记主要定位于主细胞的顶端膜，相比之下抗PRR-C抗体标记主要定位于夹层细胞。(J-M)为验证标记的特异性，使用与表达的sPRR(J)、sPRR-His(K)或其免疫肽(L)或未与一抗(M)预孵育的抗PRR-N抗体进行免疫染色。所示图像代表每组三至六只动物。
图2A-2E示出了对sPRR功能的表征。重组PRR即sPRR-His在哺乳动物细胞表达系统中表达为融合蛋白，所述融合蛋白包含sPRR、C端的组氨酸标签和N端的分泌信号肽。(A)从培养基中纯化出sPRR-His，其在12％SDS/PAGE凝胶中显示为单个29.6kDa条带。E1-E4是洗脱出的顺序级份。(B和C)将在Transwell中生长的原代大鼠IMCD细胞暴露于10nM sPRR-His持续24小时，并通过定量RT-PCR和免疫印迹分析AQP2表达(每组n＝5)。(D)在单独的实验中，将培养的CD细胞用AQP2-荧光素酶构建体转染，使其生长至汇合，接着用媒介物或10nMsPRR-His处理24小时，并测定荧光素酶活性(每组n＝5)。(E)STRING是用于预测蛋白质-蛋白质结构的基于模板的算法。使用STRING鉴定与sPRR相互作用的蛋白质。该分析揭示了10个命中结果：CTSG(组织蛋白酶G)、ACE2(血管紧张素1转化酶2)、CMA1(糜酶1)、MME(膜金属肽链内切酶)、ACE(血管紧张素1转化酶1)、CTSZ(组织蛋白酶Z)、ENPEP(谷氨酰氨基肽酶)、FZD8(卷曲家族受体8)、WNT3A(无翅型MMTV整合3A)和LRP6(低密度脂蛋白受体相关蛋白6)。CTR，对照物。
图3A-3D示出了肾FZD8表达及其与sPRR的相互作用。(A)对sPRR与FZD8之间的相互作用的共免疫沉淀分析。用抗PRR-N抗体免疫沉淀大鼠肾髓质的膜级份，并用抗FZD8抗体检测，反之亦然。(B)低放大率下大鼠肾脏中的FZD8的免疫标记。(C)高放大倍率下髓质外层中的FDZ8、AQP2和NKCC2的免疫标记。在同一切片上进行对AQP2的共标记，在连续的切片上进行对NKCC2的标记。CD，集合管；PT，近端小管；TL，升支粗段。(D)大鼠髓质内层中的FDZ8和PRR的免疫标记。用抗FZD8抗体和抗PRR-N抗体对连续切片染色。用抗AQP2抗体共标记同一切片。所示图像代表每组三至六只动物。
图4A-4E示出了对Wnt/β-连环蛋白途径在响应于sPRR-His处理而调节AQP2表达中的体外作用的分析。(A)siRNA所致的FZD8敲低的验证(每组n＝3)。用或不用FZD8 siRNA转染原代大鼠IMCD细胞。通过免疫印迹评估FZD8蛋白表达。(B)在存在或不存在FZD8siRNA的情况下，sPRR-His对Wnt响应荧光素酶活性的影响(每组n＝12)。用或不用FZD8 siRNA转染IMCD细胞，之后用10nM的sPRR-His处理24小时。使用Cignal报告系统评估Wnt/β-连环蛋白途径的活性，数据以相对响应比表示。(C-E)用FZD8 siRNA转染大鼠IMCD细胞，用OMP或XAV-939预处理1小时，并用10nM sPRR处理24小时。通过免疫印迹分析确定AQP2蛋白表达。密度计量值显示在印迹下方。(C)FZD8敲低对sPRR诱导的AQP2蛋白表达的影响(每组n＝6)。(D)OMP对sPRR-His诱导的AQP2蛋白表达的影响(每组n＝6)。(E)XAV对sPRR-His诱导的AQP2表达的影响(每组n＝6)。数据显示为平均值±SE；相较于对照物，*P＜0.05；相较于sPRR-His，#P＜0.05。
图5A-5F示出了Wnt/β-连环蛋白途径在原代大鼠IMCD细胞中对AVP的急性和慢性响应中的独特作用。将IMCD细胞用XAV预处理1小时，并用10nM AVP处理30分钟或24小时。(A)在AVP处理30分钟时，使用ELISA测定培养基中的cAMP(每组n＝6)。(B和C)对膜级份(每组n＝6)(B)和胞质级份(每组n＝6)(C)进行AQP2免疫印迹分析。(D-F)在24小时时，测定培养基cAMP(每组n＝6)(D)，对全细胞裂解液进行AQP2免疫印迹分析(每组n＝6)(E)，对总RNA进行AQP2mRNA定量RT-PCR分析(每组n＝4)(F)。数据显示为平均值±SE；相较于对照物，*P＜0.05；相较于单独AVP，#P＜0.05。
图6A-6H示出了Wnt/β-连环蛋白途径在大鼠的尿液浓缩能力中的作用。向SD大鼠施用媒介物、OMP或XAV，并置于代谢笼中以评定基础状况下(A-C)或WD 24小时(D-H)后的水代谢状态(每组n＝5只大鼠)。在基础状况下，测定摄水量(A)、尿量(B)和尿渗透压(C)。(D-F)在24小时WD期间，监测尿量(D)、尿渗透压(E)和体重(BW)变化(F)。(G和H)在实验结束时，测量血浆渗透压(G)和Hct(H)。相较于对照物，*P＜0.05；相较于仅WD，#P＜0.05。
图7A-7F示出了Wnt/β-连环蛋白途径在大鼠中在抗利尿过程中在调节肾AQP2表达中的体内作用。(A和B)为了评定WD对肾β-连环蛋白的激活作用，对来自对照组和脱水大鼠的肾皮质(每组n＝4只大鼠)(A)和髓质内层(每组n＝4只大鼠)(B)的核级份进行β-连环蛋白免疫印迹分析。(C-F)对用媒介物或WD加OMP(C)或不加OMP(D)或加XAV(E)或不加XAV(F)处理的大鼠的肾皮质和髓质内层进行AQP2表达免疫印迹分析(每组n＝5只大鼠)。数据显示为平均值±SE；相较于对照物，*P＜0.05；相较于WD，#P＜0.05。CO，皮质；IM，髓质内层。
图8A-图8E示出了sPRR-His在小鼠NDI模型中的抗利尿作用。经由植入颈静脉的导管将sPRR-His注入雄性C57/BL6小鼠持续7天，然后口服施用媒介物或V2R拮抗剂OPC31260(OPC)持续3天。将小鼠置于代谢笼中，以评定每日摄水量和尿排出量。(A)每日摄水量(每组n＝4只小鼠)。(B)每日尿排出量(每组n＝4只小鼠)。(C)尿渗透压(每组n＝4只小鼠)。(D)尿sPRR***量(每组n＝4只小鼠)。数据显示为平均值±SE。在A-C中，相较于单独的OPC，#P＜0.05；D，相较于对照物，*P＜0.05。(E)sPRR作用机制的示意图。在远端肾单位内腔中，sPRR与主细胞顶端膜上的受体复合物中的FZD8结合，导致β-连环蛋白激活，从而促进cAMP积累，最终导致AQP2转录增加和尿液浓缩增强。
图9A-9I示出了TO901317在体内和体外的利尿作用和PRR抑制作用的初始特征。向雄性C57/BL7小鼠口服施用TO901317，i.v.输注不输注sPRR-His，持续7天。接受媒介物处理的小鼠作为对照组。在实验结束时，进行24小时尿液收集，之后通过ELISA分析尿sPRR***，并通过免疫印迹分析肾PRR表达。(A)尿排出量(每组n＝30只小鼠)。(B)尿渗透压(每组n＝15只小鼠)。(C)肾PRR表达的免疫印迹分析(每组n＝15只小鼠)。(D)对C中的免疫印迹的密度计量分析。(E)对尿sPRR的ELISA分析(每组n＝8只小鼠)。(F-I)TO901317对培养的CD细胞中的PRR表达的影响。将mpkCCD细胞暴露于媒介物或10μM TO901317持续24小时。对细胞裂解液进行PRR蛋白表达免疫印迹分析，并使用ELISA测定培养基中sPRR的浓度，并通过蛋白质含量进行标准化。在单独的实验中，将细胞用PRR-荧光素酶构建体转染，使其生长至汇合，接着用媒介物或10μM TO901317处理24小时。(F)对PRR的免疫印迹分析(每组n＝15)。(G)对A中的免疫印迹的密度计量分析。(H)对培养基sPRR的ELISA分析(每组n＝10)。(I)荧光素酶测定(每组n＝5)。
图10A-10E示出了sPRR-His对小鼠中TO901317诱导的DI的影响。单独用媒介物或TO901317或与sPRR-His联合处理雄性C57/BL6小鼠，持续7天。(A)尿排出量(每组n＝8只小鼠)。(B)摄水量(每组n＝8只小鼠)。(C)水余量(每组n＝8只小鼠)。(D)尿渗透压(每组n＝8只小鼠)。(E)Hct(每组n＝8只小鼠)。
图11A-11E示出了sPRR-His对TO901317处理的小鼠中肾AQP2表达和尿肾素的影响。单独用媒介物或TO901317或与sPRR-His联合处理雄性C57/BL6小鼠，持续7天。通过免疫印迹和免疫染色分析AQP2表达。通过测量AngI的产生来测定尿肾素活性，并通过ELISA来测定尿肾素原/肾素浓度。(A)对AQP2表达的免疫印迹分析(每组n＝15只小鼠)。(B)对A中的免疫印迹的密度计量分析。(C)尿肾素活性(每组n＝8只小鼠)。(D)尿肾素原/肾素***量(每组n＝8只小鼠)。(E)LXR激动剂TO091317(TO)抑制PRR转录并诱导DI的机制的示意图。与TO091317结合的LXR充当PRR基因的过渡阻遏物，导致PRR/sPRR水平降低，从而使得AQP2表达减少，最终导致DI。
图12示出了sPRR-His对饮食诱导的肥胖症中的雄性C57/BL6小鼠的体重的影响。从1个月大开始，将雄性C57/BL6置于高脂饮食中。在最后2周期间，将小鼠随机分组以接受媒介物或sPRR-His。示出了2周治疗期内的体重变化。每组N＝9。数据为平均值±SE。
图13示出了sPRR-His对DIO小鼠的肾周脂肪的影响。
图14A和图14B示出了sPRR-His对DOI小鼠的血浆葡萄糖(A)和胰岛素(B)的影响。通过使用葡萄糖仪测量血糖。通过使用EIA测定血浆胰岛素。每组N＝9。数据为平均值±SE。
图15A和图15B示出了葡萄糖耐量测试(GTT)和胰岛素耐量测试(ITT)。禁食6小时后，经由IP注射施用单剂量的葡萄糖或胰岛素(0.25U/kg体重)。之后进行一系列血液采集和血糖测量。每组N＝9。数据为平均值±SE。
图16A-图16C示出了sPRR-His对DIO小鼠的脂肪变性的影响。(A)肝脏的大体外观。示出的是代表性图像。(B)离心后肝脏匀浆中脂质层的外观。示出的是来自每组4只代表性动物的样品。(C)肝脏甘油三酸酯含量。每组N＝9。数据为平均值±SE。
图17示出了sPRR-His对DIO小鼠的血浆甘油三酸酯的影响。每组N＝9。数据为平均值±SE。
图18示出了sPRR-His对DIO小鼠的蛋白尿的影响。通过EIA测定尿白蛋白。每组N＝9。数据为平均值±SE。
图19A、图19B和图19C示出了sPRR-His对尿量和附睾脂肪量以及在锂处理的小鼠中的影响。尽管与sPRR-His共同施用未能影响Li诱导的多尿(图19A)，但出人意料地减少了脂肪量(图19B)。附睾脂肪的图像在图19C中示出。Li+sPRR-His组中的脂肪比其他两组中的脂肪更小，并且更“着褐色”。每组N＝4-5。数据为平均值±SE。
具体实施方式
通过参考以下对特定实施方案和其中所包括的实例的详细描述以及附图及其之前和之后的描述，可以更容易地理解所公开的方法和组合物。
应当理解，除非另外指明，否则所公开的方法和组合物不限于特定的合成方法、特定的分析技术或特定的试剂，因此所公开的方法和组合物可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并非旨在进行限制。
所公开的材料、组合物以及组分可用于所公开的方法和组合物，可与所公开的方法和组合物联合使用，可用来制备所公开的组合物，或者是所公开的方法和组合物的产品。本文公开了这些材料和其他材料，应当理解，如果公开了这些材料的组合、子集、相互作用、群组等，而没有明确地公开对各种个体和集体组合以及这些化合物的排列的具体提及，则每种情况均得到本文的明确涵盖和描述。如果公开了一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F并公开了分子A-D的组合的示例，则即使没有单独叙述每个组合，也单独地和集体地考虑了每个组合。因此，在该实例中，如果具体考虑了组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F中的每一个，则应当被视为公开了A、B和C；D、E和F；和示例组合A-D。同样，这些的任何子集或组合也得到具体考虑和公开。因此，例如，如果具体考虑了A-E、B-F和C-E的子组，则应当被视为公开了A、B和C；D、E和F；和示例组合A-D。该概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制备和使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果有多种附加步骤可进行，那么应当理解，这些附加步骤中的每一个均可与所公开方法的任何具体实施方案或实施方案的组合一起进行，并且每种这样的组合均得到具体考虑并应被视为得到公开。
A.定义
应当理解，所公开的方法和组合物不限于所描述的特定方法、方案和试剂，因为这些所公开的方法和组合物可以变化。还应理解的是，本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案，而非意图限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。
必须指出，除非上下文另外清楚指示，否则如本文中和所附权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物。因此，例如，提及“sPRR”包括多个这样的sPRR，提及“sPRR”是提及一个或多个sPRR及其为本领域技术人员所知的等效物，等等。
“任选的”或“任选地”表示随后描述的事件、情况或材料可能发生或存在或可能不发生或不存在，并且该描述包括所述事件、情况或材料发生或存在的实例以及所述事件、情况或材料不发生或不存在的实例。
如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指例如出于实验性、诊断性和/或治疗性目的，可向其施用本发明的组合物的任何生物体。典型的受试者包括动物(例如，哺乳动物诸如非人类灵长类动物和人类；禽类；家养动物或农场动物，诸如猫、狗、绵羊、山羊、牛、马和猪；实验室动物，诸如小鼠、大鼠和豚鼠；兔；鱼；爬行动物；动物园动物和野生动物)。通常，“受试者”是动物，包括哺乳动物诸如人和灵长类动物；等等。
如本文所用，术语“治疗”是指部分或完全缓解、改善、减轻、延迟特定疾病、病症和/或疾患的发作；抑制或减缓特定疾病、病症和/或疾患的进展；降低特定疾病、病症和/或疾患的严重程度；和/或降低特定疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状或特征的发生率。可以将治疗施用于不表现出疾病、病症和/或疾患的迹象的受试者和/或施用于仅表现出疾病、病症和/或疾患的早期迹象的受试者，以便降低发展与所述疾病、病症和/或疾患相关联的病状的风险。
术语“治疗性”是指可以治疗疾病或疾患或可以改善与疾病或疾患相关联的一种或多种症状的治疗、疗法或药物。
“有效量”是指足以在需要活性药剂的个体中实现所需生理结果的所述活性药剂的量。有效量可以根据待治疗的受试者的健康和身体状况、待治疗的受试者的分类学类别、sPRR的配制、对受试者医疗状况的评定以及其他相关因素而在受试者之间有所变化。
在本文中，范围可以表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表示这样一个范围时，除非上下文另外明确指出，否则还具体考虑和认为公开了从一个特定值和/或至另一个特定值的范围。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应当理解除非上下文另外明确指出，否则所述特定值形成另一具体考虑的实施方案，所述实施方案应被视为得到公开。还将理解的是，除非上下文另外明确指出，否则每个范围的端点相对于另一个端点都是重要的，并且与其他端点无关。最后，应当理解的是，除非上下文另外明确指出，否则在明确公开的范围内所包含的所有单个值和值的子范围也都被具体考虑，并且应被视为得到公开。不论是否在特定情况下明确公开了这些实施方案中的一些或全部，上述内容均适用。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的方法和组合物所属的领域的技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管在实施或测试本发明的方法和组合物时可使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但是现在描述的是特别有用的方法、装置和材料。本文所引用的出版物以及引用这些出版物所涉及到的材料特此以引用的方式明确并入。本文中的任何内容均不应被理解为承认本发明由于在先发明而无权居先于这种公开内容。不承认任何参考文献构成现有技术。参考文献的讨论陈述了其作者的主张，而申请人保留质疑所引用文献的准确性和相关性的权利。应当清楚地理解，尽管这里引用了许多出版物，但是这种引用并不意味着承认这些文献中的任何文献构成了本领域公知常识的一部分。
在本说明书的整个说明书和权利要求书中，单词“包括”及所述单词的变型诸如“包含”和“含有”表示“包括但不限于”，并且无意排除例如其他添加剂、组分、整数或步骤。特别地，在陈述为包括一个或多个步骤或操作的方法中，具体考虑的是每个步骤都包含所列出的内容(除非所述步骤包括一个限制性术语诸如“由...组成”)，这意味着每个步骤均无意排除例如未在所述步骤中列出的其他添加剂、组分、整数或步骤。
B.代谢紊乱及相关疾患的治疗方法
公开了治疗代谢紊乱的方法，所述包括向受试者施用有效量的sPRR。公开了治疗代谢紊乱的方法，所述包括向诊断为患有代谢紊乱的受试者施用有效量的sPRR。当体内异常的化学反应改变正常的代谢过程时，就会发生代谢紊乱。代谢紊乱的症状可包括嗜睡、腹痛、体重减轻、黄疸和癫痫。在一些情况下，代谢紊乱包括但不限于肥胖症和肥胖症相关疾患、体液和电解质紊乱、脂质紊乱、糖尿病、运动相关性低钠血症、代谢性肌病、胰腺炎、全身性脂肪组织炎(pansteatitis)、X连锁性低磷血症和溶酶体贮积症。
C.肥胖症或肥胖症相关疾患的治疗方法
公开了治疗肥胖症或肥胖症相关疾患的方法，所述方法包括向肥胖或患有肥胖症相关疾患的受试者施用有效量的可溶性肾素(原)受体(sPRR)。在一些情况下，肥胖症相关疾患可以是但不限于脂肪变性、高血糖症、胰岛素抵抗、慢性肾病。
公开了治疗肥胖症或肥胖症相关疾患的方法，所述方法包括向肥胖或患有肥胖症相关疾患的受试者施用有效量的可溶性肾素(原)受体(sPRR)，所述方法还包括在施用sPRR之前对所述受试者进行测试以确定所述受试者是否肥胖或患有肥胖症相关疾患的步骤。
公开了减轻体重的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的sPRR。在一些情况下，有需要的受试者是被诊断为需要减轻体重的任何受试者。
公开了治疗受试者的脂肪肝的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的sPRR。在一些情况下，有需要的受试者是已诊断出患有脂肪肝的任何受试者。在一些情况下，脂肪肝可以是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)或酒精性肝病(ALD)。
在一些情况下，施用有效量的sPRR包括施用携带有效量的sPRR的媒介物。在一些情况下，媒介物可以是纳米颗粒。例如，纳米颗粒可以是脂质体或聚合物。在一些情况下，媒介物可以具有靶向部分，其中所述靶向部分可以将sPRR靶向感兴趣的特定细胞或组织。
公开了治疗肥胖症或肥胖症相关疾患的方法，所述方法包括向肥胖或患有肥胖症相关疾患的受试者施用有效量的sPRR，所述方法还包括施用已知的治疗剂。在一些情况下，所述已知的治疗剂已知用于治疗肥胖症或肥胖症相关疾患。例如，用于治疗肥胖症或肥胖症相关疾患的已知治疗剂可以是但不限于GLP-1受体激动剂(例如Saxenda(r))。在一些情况下，sPRR和已知的治疗剂同时施用。在一些情况下，sPRR和已知的治疗剂相继施用。在一些情况下，sPRR和已知的治疗剂一起配制。在一些情况下，sPRR和已知的治疗剂分开配制。
公开了减轻体重的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的sPRR，所述方法还包括施用已知的治疗剂。在一些情况下，已知所述已知的治疗剂可减轻体重。例如，用于减轻体重的已知治疗剂可以是但不限于用于治疗肥胖症的相同治疗剂。在一些情况下，sPRR和已知的治疗剂同时施用。在一些情况下，sPRR和已知的治疗剂相继施用。在一些情况下，sPRR和已知的治疗剂一起配制。在一些情况下，sPRR和已知的治疗剂分开配制。
公开了治疗受试者的脂肪肝的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的sPRR，所述方法还包括施用已知的治疗剂。在一些情况下，所述已知的治疗剂已知用于治疗脂肪肝。例如，用于治疗脂肪肝的已知治疗剂可以是但不限于他汀类药物和噻唑烷二酮。在一些情况下，sPRR和已知的治疗剂同时施用。在一些情况下，sPRR和已知的治疗剂相继施用。在一些情况下，sPRR和已知的治疗剂一起配制。在一些情况下，sPRR和已知的治疗剂分开配制。
在一些情况下，sPRR可以是融合蛋白。例如，sPRR融合配偶体可以是但不限于组氨酸(His)标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签、c-Myc标签、血凝素(HA)标签或髓磷脂碱性蛋白(MBP)标签。
在一些情况下，sPRR可以是野生型sPRR。例如，野生型sPRR可以是SEQ ID NO：1的序列。ANEFSILRSPGSVVFRNGNWPIPGDRIPDVAALSMGFSVKEDLSWPGLAVGNLFHRPRATIMVTVKGVDKLALPTGSVISYPLENAVPFSLDSVANSIHSLFSEETPVVLQLAPSEERVYMVGKANSVFEDLSVTLRQLRNRLFQENSVLNSLPLNSLSRNNEVDLLFLSELQVLHDISSLLSRHKHLAKDHSPDLYSLELAGLDELGKRYGEDSEQFRDASRILVDALQKFADDMYSLYGGNAVVELVTVKSFDTSL(SEQ ID NO：1)
在一些情况下，sPRR与野生型sPRR 70％-99％相同。在一些情况下，取代的氨基酸可以是修饰的氨基酸、保守取代或非保守取代。
在一些情况下，可以以10-300μg/kg/天的量施用sPRR。在一些情况下，给药方案可包括单次施用sPRR。在一些情况下，给药方案可包括每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次或每周七次施用sPRR，持续1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周、21周、22周、23周、24周、26周、28周、30周、32周、34周、36周、38周、40周、42周、44周、46周、48周、50周或52周。
D.体液和电解质紊乱的治疗方法
公开了治疗体液和电解质紊乱的方法，所述方法包括向诊断为患有体液和电解质紊乱的受试者施用有效量的sPRR。在一些情况下，体液和电解质紊乱包括但不限于中枢性尿崩症(CDI)、肾原性尿崩症(NDI)、失血性休克、败血性休克和由于各种病因引起的血浆容量减缩(plasma volume contraction)。
公开了治疗体液和电解质紊乱的方法，所述方法包括向诊断为患有体液和电解质紊乱的受试者施用有效量的sPRR，所述方法还包括在施用sPRR之前对所述受试者进行测试以确定所述受试者是否患有体液和电解质紊乱的步骤。
在一些情况下，施用有效量的sPRR包括施用携带有效量的sPRR的媒介物。在一些情况下，媒介物可以是纳米颗粒。例如，纳米颗粒可以是脂质体或聚合物。在一些情况下，媒介物可以具有靶向部分，其中所述靶向部分可以将sPRR靶向感兴趣的特定细胞或组织。
公开了治疗体液和电解质紊乱的方法，所述方法包括向诊断为患有体液和电解质紊乱的受试者施用有效量的sPRR，所述方法还包括施用已知的治疗剂。在一些情况下，所述已知的治疗剂已知用于治疗体液和电解质紊乱。例如，用于治疗体液和电解质紊乱的已知疗法可以是但不限于噻唑烷二酮、胰岛素、二甲双胍、糖利尿剂(glycodiuretic)。在一些情况下，sPRR和已知的治疗剂同时施用。在一些情况下，sPRR和已知的治疗剂相继施用。在一些情况下，sPRR和已知的治疗剂一起配制。在一些情况下，sPRR和已知的治疗剂分开配制。
在一些情况下，sPRR可以是融合蛋白。例如，sPRR融合配偶体可以是但不限于组氨酸(His)标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签、c-Myc标签、血凝素(HA)标签或髓磷脂碱性蛋白(MBP)标签。
在一些情况下，sPRR可以是野生型sPRR。例如，野生型sPRR可以是SEQ ID NO：1的序列。
在一些情况下，sPRR与野生型sPRR 70％-99％相同。在一些情况下，取代的氨基酸可以是修饰的氨基酸、保守取代或非保守取代。
在一些情况下，可以以10-300μg/kg/天的量施用sPRR。在一些情况下，给药方案可包括单次施用sPRR。在一些情况下，给药方案可包括每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次或每周七次施用sPRR，持续1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周、21周、22周、23周、24周、26周、28周、30周、32周、34周、36周、38周、40周、42周、44周、46周、48周、50周或52周。
E.组合物和制剂
公开了包含含有sPRR的肽的组合物。
如本文所述，在一些情况下，sPRR可以是野生型sPRR。例如，野生型sPRR可以是SEQID NO：1的序列。在一些情况下，sPRR与野生型sPRR 70％-99％相同。在一些情况下，取代的氨基酸可以是修饰的氨基酸、保守取代或非保守取代。
在一些情况下，sPRR可以是融合蛋白。例如，sPRR融合配偶体可以是但不限于组氨酸(His)标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签、c-Myc标签、血凝素(HA)标签或髓磷脂碱性蛋白(MBP)标签。
在一些情况下，可以在药学上可接受的载剂中或与药学上可接受的载剂一起配制和/或施用sPRR。如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指无菌的水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于在即将使用前重构为无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。合适的水性和非水性载剂、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、羧甲基纤维素及其合适的混合物、植物油(橄榄油)，和可注射的有机酯诸如油酸乙酯。例如，通过使用涂层材料诸如卵磷脂，通过维持所需的粒度(就分散液而言)以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。这些组合物还可含有佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂诸如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等来确保防止微生物的作用。还可能需要包含等渗剂，诸如糖、氯化钠等。可以通过包含延迟吸收的剂诸如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。可以通过形成药物在可生物降解的聚合物诸如聚交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐)中的微胶囊基质来制成可注射的储库形式。根据药物与聚合物的比例和所用特定聚合物的性质，可以控制药物的释放速率。还可以通过将药物截留在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备储库型可注射制剂。可以例如通过经由细菌保留过滤器过滤或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂对可注射制剂进行灭菌，所述灭菌剂可在即将使用前溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中。合适的惰性载剂可包括糖诸如乳糖。理想地，至少95重量％的活性成分颗粒具有在0.01至10微米范围内的有效粒度。
因此，本文所公开的组合物可包含脂质诸如脂质体，诸如阳离子脂质体(例如，DOTMA、DOPE、DC-胆固醇)或阴离子脂质体。如果需要，脂质体还可包含蛋白质以便于靶向特定细胞。可以将包含肽和阳离子脂质体的组合物施用至血液，施用至靶器官，或吸入到呼吸道中以靶向呼吸道细胞。例如，可以将包含本文所述的肽或核酸序列和阳离子脂质体的组合物施用于受试者的肺细胞。关于脂质体，参见，例如，Brigham等人Am.J.Resp.Cell.Mol.Biol.1：95-100(1989)；Felgner等人Proc.Natl.Acad.Sci USA 84：7413-7417(1987)；美国专利No.4,897,355。此外，可以将化合物作为可靶向特定细胞类型诸如巨噬细胞的微胶囊的组分来施用，或者其中针对特定速率或剂量设计化合物的扩散或化合物从微胶囊的递送。
一方面，公开了药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的任何公开的肽或其药学上可接受的盐或溶剂合物，以及药学上可接受的载剂、稀释剂或稀释剂。在各个方面，药物组合物的肽被包封在递送媒介物中。在另一方面，递送媒介物是脂质体、微胶囊或纳米颗粒。在另一方面，递送媒介物是PEG化的。
在本文所述的方法中，可以经由多种机制将组合物递送至细胞。如上文所定义，本文公开了包含本文所述的肽、核酸、载体和/或抗体中的任何一种或多种的组合物，可用于产生组合物，所述组合物还可以包含载剂诸如药学上可接受的载剂。例如，公开了包含本文所公开的肽和药学上可接受的载剂的药物组合物。在一方面，公开了包含所公开的化合物的药物组合物。即，可以提供包含治疗有效量的至少一种所公开的化合物或由所公开的方法产生的至少一种产物和药学上可接受的载剂的药物组合物。
在某些方面，所公开的药物组合物包含作为活性成分的所公开的化合物(包括其药学上可接受的一种或多种盐)、药学上可接受的载剂和任选的其他治疗性成分或佐剂。本发明的组合物包括适于口服、直肠、局部和肠胃外(包括皮下、肌内和静脉内)施用的那些组合物，但是在任何给定情况下最合适的途径将取决于特定宿主、所施用活性成分所针对的疾患的性质和严重程度。药物组合物可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域公知的任何方法来制备。
在各个方面，公开了药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载剂或稀释剂以及作为活性成分的治疗有效量的所公开的化合物、由所公开的制备方法产生的产物、其药学上可接受的盐、溶剂合物或多晶型物、其水合物、其溶剂合物、其多晶型物或其立体化学异构体形式。在另一方面，所公开的化合物、由所公开的制备方法产生的产物、其药学上可接受的盐、溶剂合物或多晶型物、其水合物、其溶剂合物、其多晶型物或其立体化学异构体形式，或其任何亚组或组合可被配制成各种药物形式以用于施用目的。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指由药学上可接受的无毒碱或酸制备的盐。当本发明的化合物为酸性时，其相应的盐可以方便地由药学上可接受的无毒碱(包括无机碱和有机碱)来制备。衍生自此类无机碱的盐包括铝盐、铵盐、钙盐、铜(铜和亚铜)盐、铁盐、亚铁盐、锂盐、镁盐、锰(锰和亚锰)盐、钾盐、钠盐、锌盐等。特别优选的是铵盐、钙盐、镁盐、钾盐和钠盐。衍生自药学上可接受的有机无毒碱的盐包括伯胺、仲胺和叔胺，以及环胺和取代的胺诸如天然存在的和合成的取代的胺的盐。可以形成盐的其他药学上可接受的有机无毒碱包括离子交换树脂，诸如例如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N，N’-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、葡糖胺(glucamine)、氨基葡糖胺(glucosamine)、组氨酸、哈胺(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等。
如本文所用，术语“药学上可接受的无毒酸”包括无机酸、有机酸和由其制备的盐，例如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、伊西硫酸(isethionic)、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘液酸、硝酸、双羟萘酸(pamoic)、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸等。优选的是柠檬酸、氢溴酸、盐酸、马来酸、磷酸、硫酸和酒石酸。
对于治疗性用途，所公开的化合物的盐是其中平衡离子为药学上可接受的的那些盐。但是，由非药学上可接受的酸和碱形成的盐也可用于例如药学上可接受的化合物的制备或纯化中。所有盐，无论是否是药学上可接受的，都包括在本发明的范围内。
在上文或下文中提及的药学上可接受的酸和碱加成盐意指包括所公开的化合物能够形成的具有治疗活性的无毒酸和碱加成盐形式。药学上可接受的酸加成盐可以方便地通过用这种合适的酸处理碱形式而获得。适当的酸包括例如无机酸，诸如氢卤酸(例如盐酸或氢溴酸)、硫酸、硝酸、磷酸等；或有机酸，诸如例如乙酸、丙酸、羟基乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸(即乙二酸)、丙二酸、琥珀酸(即丁二酸)、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环拉酸(cyclamic)、水杨酸、对氨基水杨酸、双羟萘酸等。相反地，可以通过用适当的碱处理来将所述盐形式转化为游离碱形式。
所公开的含有酸性质子的化合物也可以通过用适当的有机碱和无机碱处理而转化为其无毒金属或胺加成盐形式。适当的碱盐形式包括：例如铵盐、碱金属盐和碱土金属盐，例如锂、钠、钾、镁、钙盐等；由有机碱形成的盐，例如伯、仲和叔脂族和芳族胺，诸如甲胺、乙胺、丙胺、异丙胺、四种丁胺异构体、二甲胺、二乙胺、二乙醇胺、二丙胺、二异丙胺、二正丁胺、吡咯烷、哌啶、吗啉、三甲胺、三乙胺、三丙胺、奎宁环、吡啶、喹啉和异喹啉、苄星青霉素、N-甲基-D-葡糖胺、哈胺盐；以及由诸如例如精氨酸、赖氨酸等氨基酸形成的盐。相反地，可以通过用酸处理来将盐形式转化为游离酸形式。
在实践中，本发明的本发明化合物或其药学上可接受的盐可以根据常规的药物配混技术作为活性成分与药物载剂紧密混合。载剂可以采取多种形式，这取决于施用所需的制剂形式，例如口服或肠胃外(包括静脉内)。因此，本发明的药物组合物可以作为诸如胶囊剂、扁囊剂或片剂的适于口服施用的离散单位存在，每个单位均含有预定量的活性成分。此外，组合物可以粉剂、颗粒剂、溶液、在水性液体中的悬浮液、非水性液体、水包油乳液或油包水液体乳液的形式存在。除了上面列出的普通剂型之外，本发明的化合物和/或其药学上可接受的一种或多种盐还可以通过控释部件和/或递送装置施用。所述组合物可以通过任何药学方法制备。通常，此类方法包括使活性成分与构成一种或多种必要成分的载剂结合的步骤。一般来讲，通过将活性成分与液体载剂或细分的固体载剂或两者均匀且紧密地混合来制备组合物。然后可以将产物方便地成型为所需的外观。
为了施用便利和剂量均匀，将前述药物组合物配制成单位剂型是特别有利的。如本文所用的单位剂型是指适合作为单位剂量的物理上离散的单位，每个单位含有经计算可与所需药物载剂联合产生所需治疗效果的预定量的活性成分。此类单位剂型的实例是片剂(包括刻痕或包衣的片剂)、胶囊剂、丸剂、粉剂小包、糯米纸囊剂(wafer)、栓剂、可注射溶液或悬浮液等，以及其分隔开的复合剂型(segregatedmultiples)。
因此，本发明的药物组合物可包含药学上可接受的载剂和本发明的化合物或化合物的药学上可接受的盐。如本领域技术人员所熟知的，“药学上可接受的”是指这样的材料或载剂，其将会被选择以使活性成分的任何降解最小化并使受试者中的任何不良副作用最小化。本发明的化合物或其药学上可接受的盐还可以与一种或多种其他治疗活性化合物组合地包含在药物组合物中。
所使用的药物载剂可以是例如固体、液体或气体。固体载剂的实例包括乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、***胶、硬脂酸镁和硬脂酸。液体载剂的实例是糖浆、花生油、橄榄油和水。气态载剂的实例包括二氧化碳和氮气。载剂的其他实例包括二肉豆蔻酰基磷脂酰(dimyristoylphosphatidyl，DMPC)、磷酸盐缓冲盐水或多囊脂质体。例如，PG：PC：胆固醇：肽或PC：肽可用作本发明中的载剂。其他合适的药学上可接受的载剂及其制剂描述于Remington：The Science and Practice of Pharmacy(第19版)编A.R.Gennaro，Mack Publishing Company，Easton，PA 1995。通常，在制剂中使用适当量的药学上可接受的盐以使制剂等渗。药学上可接受的载剂的其他实例包括但不限于盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。溶液的pH值可为约5至约8，或约7至约7.5。另外的载剂包括缓释制剂诸如含有所述组合物的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质为成形制品的形式，例如膜、支架(在血管成形术中植入血管中)、脂质体或微粒。对于本领域技术人员将显而易见的是，某些载剂可能是更优选的，这取决于例如施用途径和所施用组合物的浓度。这些中最典型的将是用于对人施用的标准载剂，包括诸如无菌水、盐水和生理pH值的缓冲溶液的溶液。
为了提高所公开的肽在药物组合物中的溶解度和/或稳定性，可能是有利的是采用α-、β-或γ-环糊精或其衍生物，特别是羟烷基取代的环糊精，例如2-羟丙基-β-环糊精或磺丁基-β-环糊精。诸如醇的助溶剂也可以改善根据本发明的化合物在药物组合物中的溶解度和/或稳定性。
药物组合物还可包含载剂、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂等，只要不损害本发明的多肽、肽、核酸、载体的预期活性即可。药物组合物还可包含一种或多种活性成分(除了本发明的组合物之外)，诸如抗微生物剂、抗炎剂、麻醉剂等。取决于是否需要局部或全身治疗以及取决于待治疗的区域，可以以多种方式施用药物组合物。
由于易于施用，口服施用是优选的，并且片剂和胶囊剂代表最有利的口服剂量单位形式，在这种情况下显然使用固体药物载剂。在制备口服剂型的组合物中，可以使用任何方便的药物介质。例如，水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂等可用于形成口服液体制剂诸如悬浮液、酏剂和溶液；而诸如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、制粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等的载剂可用于形成口服固体制剂诸如粉剂、胶囊剂和片剂。由于易于施用，片剂和胶囊剂是优选的口服剂量单位，由此使用固体药物载剂。任选地，片剂可以通过标准水性或非水性技术进行包衣。
用于口服施用的组合物包括粉剂或颗粒剂、在水或非水性介质中的悬浮液或溶液、胶囊剂、小药囊或片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是需要的。一些组合物可能以药学上可接受的酸或碱加成盐的形式施用，所述盐是通过与诸如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸的无机酸以及诸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和富马酸的有机酸反应而形成的；或是通过与诸如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾的无机碱以及诸如单、二、三烷基和芳基胺和取代的乙醇胺的有机碱反应而形成的。
含有本发明的组合物的片剂可通过压制或模制来制备，任选地加入一种或多种辅助成分或佐剂。压制片剂可以通过在合适的机器中压制诸如粉剂或颗粒剂的自由流动形式的活性成分，任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂混合来制备。模制片剂可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物来制备。
本发明的药物组合物包含作为活性成分的肽诸如sPRR(或其药学上可接受的盐)、药学上可接受的载剂和任选的一种或多种其他治疗剂或佐剂。本发明的组合物包括适于口服、直肠、局部和肠胃外(包括皮下、肌内和静脉内)施用的那些组合物，但是在任何给定情况下最合适的途径将取决于特定宿主、所施用活性成分所针对的疾患的性质和严重程度。药物组合物可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域公知的任何方法来制备。
适于肠胃外施用的本发明的药物组合物可以制备成活性化合物在水中的溶液或悬浮液。可以包含合适的表面活性剂，例如羟丙基纤维素。还可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中在油中制备分散液。此外，可以包含防腐剂以防止微生物的有害生长。
适于注射使用的本发明的药物组合物包括无菌水性溶液或分散液。此外，所述组合物可以呈无菌粉末的形式，用于临时制备这种无菌可注射溶液或分散液。在所有情况下，最终的可注射形式必须是无菌的，并且必须有效地流动以易于注射。药物组合物必须在制造和储存条件下保持稳定；因此，优选地进行防腐以防微生物诸如细菌和真菌的污染。载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、植物油以及它们的合适混合物的溶剂或分散介质。
例如，可以制备可注射溶液，其中载剂包括盐水溶液、葡萄糖溶液或盐水溶液和葡萄糖溶液的混合物。还可以制备可注射悬浮液，在这种情况下，可以使用适当的液体载剂、悬浮剂等。还包括意欲在即将使用前转化为液体形式制剂的固体形式制剂。
肠胃外施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油)和可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。水性载剂包括水、醇/水性溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发性油。静脉内媒介物包括体液和营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏右旋糖的那些)等。还可以存在防腐剂和其他添加剂，诸如例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
本发明的药物组合物可以呈适于局部使用的形式，诸如例如气雾剂、乳膏剂、软膏剂、洗剂、扑粉、漱口水、含漱剂等。此外，所述组合物可以呈适合用于透皮装置的形式。这些制剂可以经由常规的加工方法利用本发明的化合物或其药学上可接受的盐来制备。例如，通过将亲水性材料和水连同约5wt％至约10wt％的化合物混合以产生具有所需稠度的乳膏剂或软膏剂，来制备乳膏剂或软膏剂。
在适于经皮施用的组合物中，载剂任选地包含渗透增强剂和/或合适的润湿剂，任选地结合较小比例的任何性质的合适添加剂，所述添加剂不会对皮肤产生明显的有害作用。所述添加剂可以促进向皮肤的施用和/或可以有助于制备所需的组合物。这些组合物可以以各种方式施用，例如以透皮贴剂、点涂剂、软膏剂的形式施用。
本发明的药物组合物可以呈适于直肠施用的形式，其中载剂是固体。优选的是混合物形成单位剂量的栓剂。合适的载剂包括可可油和本领域通常使用的其他材料。通过首先将所述组合物与软化或熔融的载剂混合，然后在模具中冷却和成型，可以方便地形成栓剂。
用于局部施用的制剂可包括软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。常规药物载剂(水基、粉末基或油基)、增稠剂等可为必需的或需要的。
除前述载剂成分外，上述药物制剂还可视情况包括一种或多种另外的载剂成分，诸如稀释剂、缓冲剂、调味剂、粘合剂、表面活性剂、增稠剂、润滑剂、防腐剂(包括抗氧化剂)等。此外，可包含其他佐剂以使制剂与预期接受者的血液等渗。含有本发明的化合物和/或其药学上可接受的盐的组合物还可以以粉末或液体浓缩物形式制备。
如本领域技术人员所熟知的，确切的施用剂量和频率取决于具体公开的化合物、由所公开的制备方法形成的产物、其药学上可接受的盐、溶剂合物或多晶型物、其水合物、其溶剂合物、其多晶型物或其立体化学异构体形式；所治疗的特定疾患和所治疗的疾患的严重程度；特异于向其施用剂量的受试者的病史的各种因素，诸如年龄；特定受试者的体重、性别、病症程度和一般身体状况，以及该个体可能正在服用的其他药物。此外，很明显，所述有效日剂量可以根据所治疗的受试者的反应和/或根据开具本发明化合物的医师的评价而降低或增加。
取决于施用方式，药物组合物将包含0.05重量％至99重量％，优选0.1重量％至70重量％，更优选0.1重量％至50重量％的活性成分；以及1重量％至99.95重量％，优选30重量％至99.9重量％，更优选50重量％至99.9重量％的药学上可接受的载剂，所有百分比均基于组合物的总重量。
在需要正向变构调节代谢型谷氨酸受体活性的治疗条件中，合适的剂量水平通常为每天每kg患者体重约0.01至1000mg，并且可以以单剂量或多剂量施用。在各个方面，剂量水平将为约0.1至约500mg/kg/天、约0.1至250mg/kg/天或约0.5至100mg/kg/天。合适的剂量水平可以为约0.01至1000mg/kg/天、约0.01至500mg/kg/天、约0.01至250mg/kg/天、约0.05至100mg/kg/天或约0.1至50mg/kg/天。在该范围内，剂量可以是0.05至0.5、0.5至5.0，或5.0至50mg/kg/天。对于口服施用，优选以包含1.0至1000毫克活性成分，特别地1.0、5.0、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、750、800、900和1000毫克活性成分的片剂的形式提供所述组合物，以便对症调整待治疗的患者的剂量。可以每天1次至4次，优选每天一次或两次的方案施用所述化合物。可以调整此给药方案以提供最佳的治疗反应。
可以每天多次，例如每天2次、3次、4次、5次或6次施用上文和下文所述的此类单位剂量。在各个方面，此类单位剂量可以每天施用1次或2次，使得70kg成人的总剂量在每次施用每kg受试者体重0.001至约15mg的范围内。在另一方面，每次施用的剂量为每kg受试者体重0.01至约1.5mg，并且这种疗法可以持续数周或数月，并且在一些情况下为数年。但是，如本领域技术人员所熟知的，应当理解，任何特定患者的具体剂量水平将取决于多种因素，包括所采用的具体化合物的活性；被治疗者的个体的年龄、体重、一般健康情况、性别和饮食；施用的时间和途径；***率；先前已施用过的其他药物；以及正在治疗的特定疾病的严重程度。
典型的剂量可以是每天一次或每天多次服用的一次1mg至约100mg片剂或1mg至约300mg，或是每天一次且按比例含有更高的活性成分含量的一次释放胶囊或片剂。可以通过在不同pH值下溶解的胶囊材料，通过凭借渗透压缓慢释放的胶囊或通过任何其他已知的控释手段来获得延时释放的效果。
对本领域技术人员将显而易见的是，在一些情况下可能有必要使用这些范围以外的剂量。此外，应指出，临床医生或主治医师结合个体患者的反应，将知晓如何以及何时开始、中断、调整或终止疗法。
本发明还涉及一种制造用于调节哺乳动物(例如人)中的谷氨酸受体活性(例如，治疗与谷氨酸功能异常相关联的一种或多种神经和/或精神障碍)的药剂的方法，所述方法包括将一种或多种所公开的化合物、产物或组合物与药学上可接受的载剂或稀释剂混合。因此，在一方面，本发明涉及一种用于制造药剂的方法，所述方法包括将至少一种所公开的化合物或至少一种所公开的产物与药学上可接受的载剂或稀释剂混合。
所公开的药物组合物还可包含其他治疗活性化合物，这些治疗活性化合物通常用于治疗上述疾病、病症或疾患。
应当理解，所公开的组合物可以由所公开的化合物制备。还应理解，所公开的组合物可以用于所公开的使用方法中。
如已经提到的，本发明涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的所公开的化合物、由所公开的制备方法产生的产物、其药学上可接受的盐、溶剂合物或多晶型物、其水合物、其溶剂合物、其多晶型物，以及药学上可接受的载剂。另外，本发明涉及一种制备药物组合物的方法，其特征在于将药学上可接受的载剂与治疗有效量的根据本发明的化合物紧密混合。
如已经提到的，本发明还涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含所公开的肽、其药学上可接受的盐、溶剂合物或多晶型物，以及一种或多种其他药物，所述组合物用于治疗、预防、控制、改善所公开的化合物或所述其他药物可能对其有效的疾病或疾患或降低疾病或疾患风险；还涉及这种组合物用于制造药剂的用途。本发明还涉及所公开的肽、其药学上可接受的盐、溶剂合物或多晶型物与抗癌治疗剂的组合。在各个其他方面，本发明还涉及所公开的肽、其药学上可接受的盐、溶剂合物或多晶型物的组合。本发明还涉及用作药品的这种组合。这种组合或产物的不同药物可以与药学上可接受的载剂或稀释剂一起组合在单个制剂中，或者它们可以与药学上可接受的载剂或稀释剂存在于单独的制剂中。
在一些情况下，可以以10-300μg/kg/天的量施用sPRR。在一些情况下，给药方案可包括单次施用sPRR。在一些情况下，给药方案可包括每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次或每周七次施用sPRR，持续1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周、21周、22周、23周、24周、26周、28周、30周、32周、34周、36周、38周、40周、42周、44周、46周、48周、50周或52周。
F.施用
在本文所述的方法中，可以经由多种机制将sPRR或已知的治疗剂施用或递送至受试者。例如，可以将sPRR或已知的治疗剂配制成药物组合物。
取决于是否需要局部或全身治疗以及取决于待治疗的区域，可以以多种方式施用药物组合物。
肠胃外施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油)和可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。水性载剂包括水、醇/水性溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发性油。静脉内媒介物包括体液和营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏右旋糖的那些)等。还可以存在防腐剂和其他添加剂，诸如例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
用于局部施用的制剂可包括软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。常规药物载剂(水基、粉末基或油基)、增稠剂等可为必需的或需要的。
用于口服施用的组合物包括粉剂或颗粒剂、在水或非水性介质中的悬浮液或溶液、胶囊剂、小药囊或片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是需要的。一些组合物可以以药学上可接受的酸或碱加成盐的形式施用，所述盐是通过与诸如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸的无机酸以及诸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和富马酸的有机酸反应而形成的；或是通过与诸如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾的无机碱以及诸如单、二、三烷基和芳基胺和取代的乙醇胺的有机碱反应而形成的。
G.药盒
上面描述的材料以及其他材料可以以任何合适的组合包装在一起，成为用于执行或帮助执行所公开的方法的药盒。有益的是给定药盒中的药盒组分经过设计，适合在所公开的方法中一起使用。例如，公开了用于治疗肥胖症、肥胖症相关疾患以及体液和电解质紊乱的药盒，所述药盒包括sPRR和用于携带sPRR的媒介物。公开了用于治疗代谢紊乱的药盒，所述药盒包括sPRR和用于携带sPRR的媒介物。
实施例
A.作为肝X受体的靶标，可溶性肾素(原)受体经由β-连环蛋白增强尿液浓缩能力
肾素(原)受体(PRR)的胞外结构域被裂解，产生可溶性肾素(原)受体(sPRR)，其在生物体液中被检测到并在某些病理条件下升高。进行本研究是为了确定sPRR的抗利尿作用及其与肝X受体(LXR)的潜在相互作用，肝X受体是已知的尿液浓缩能力的调节剂。脱水持续增加小鼠和人类的尿sPRR***。基于模板的蛋白质-蛋白质相互作用算法可预测sPRR与frizzled-8(FZD8)之间的相互作用，所述相互作用随后通过共免疫沉淀法得到了证实。纳摩尔范围内的带组氨酸标签的重组sPRR(sPRR-His)导致原代大鼠髓质内层集合管细胞中肾水通道蛋白2(AQP2)蛋白的丰度显著增加。AQP2的上调依赖于FZD8依赖性β-连环蛋白信号传导和cAMP-PKA途径的顺序激活。在大鼠中对FZD8或端锚聚合酶的抑制作用可诱导多尿、多饮和高渗尿。施用sPRR-His缓解了小鼠中由加压素2受体拮抗作用诱导的尿崩症的症状。向C57/BL6小鼠施用LXR激动剂TO901317会诱导多尿并抑制与降低的肾PRR表达和尿sPRR***相关联的肾AQP2表达。施用sPRR-His可逆转TO901317的大部分效应。在培养的集合管细胞中，TO901317抑制PRR蛋白表达、sPRR释放和PRR转录活性。这项研究表明，sPRR通过FZD8依赖性AQP2表达刺激发挥抗利尿作用，并且该途径的抑制作用促成由LXR激动作用诱导的尿崩症的发病机理。
全长肾素(原)受体(PRR)是肾素原和肾素的具有350个氨基酸的跨膜受体，使其经受蛋白酶介导的裂解，产生由N端胞外结构域、可溶性肾素(原)受体(sPRR)和8.9kDa C端胞内结构域(称为“M8.9”)组成的28kDa蛋白。在于克隆系膜细胞中作为完整的39kDa膜蛋白克隆全长PRR之前，M8.9被鉴定为与来自牛染色质粒子的液泡H+-ATP酶(V-ATP酶)相关联的截短蛋白。裂解经由弗林蛋白酶或ADMA19在高尔基体中发生。已开发出一种sPRR ELISA试剂盒来检测血浆和尿液样品中的sPRR。通过此测定，已证明患有心力衰竭、肾病、高血压和先兆子痫的患者的血清sPRR水平升高。此外，在患有由高血压和2型糖尿病引起的慢性肾病的患者中，血清sPRR与血清肌酐、血尿素氮和尿蛋白呈正相关，与估计的肾小球滤过率呈负相关。但是，在健康受试者或患有糖尿病和高血压的患者中，血清sPRR与血清肾素、肾素原或醛固酮不相关。
在肾脏内，PRR在远侧肾单位中，特别是在集合管(CD)的夹层细胞中大量表达。PRR在调节肾水通道蛋白2(AQP2)表达和尿液浓缩能力中的功能作用已通过对肾单位和CD中发生PRR有条件缺失的小鼠进行分析而揭示。但是，CD PRR的抗利尿作用是否由sPRR赋予仍不清楚。
肝X受体(LXR)被氧化的胆固醇衍生物激活，且属于核受体家族，其与类视黄醇X受体形成异源二聚体，从而调节控制胆固醇、脂肪酸和葡萄糖代谢的靶基因的转录。LXR由两种同种型组成：LXRα，其在肝脏、小肠、肾脏、巨噬细胞和脂肪组织中大量表达；以及LXRβ，其更广泛地表达。LXR在胆固醇逆向转运中具有确定的作用，胆固醇逆向转运导致胆固醇从周围组织流出到肝脏。有趣的是，新出现的证据表明LXR在调节肾素-血管紧张素系统(RAS)和诸如Na-Pi转运蛋白、OAT1和上皮细胞Na+通道(ENaC)的肾转运蛋白中具有潜在作用。本研究定义了sPRR在调节体液稳态中的生物学功能和信号传导，并作为肾脏中LXR的靶标进一步测试了PRR/sPRR。
1.结果
i.sPRR的生物学功能
通过使用针对PRR不同结构域的抗体对大鼠肾脏进行免疫染色来指示sPRR的生物学功能。使用两种不同的抗体检查了大鼠肾PRR的细胞定位：针对PRR的C端结构域而产生的抗体(称为“抗PRR-C抗体”；Abcam)和针对sPRR序列中的N端结构域而产生的另一种抗体(称为“抗PRR-N抗体”)。裂解后，sPRR被抗PPR-N识别，但未被抗PRR-C识别。抗PRR-C抗体标记了AQP2-CD细胞，例如夹层细胞(图1C)。出乎意料的是，抗PRR-N的标记主要出现在CD主细胞的顶端膜上(图1A和B)，与AQP2重叠(图1D和E)，证实了在主细胞中定位，但未在夹层细胞中定位。将抗PRR抗体和抗AQP2抗体的共标记的图像合并(图1G-I)。进行竞争测定以验证抗PRR-N抗体的特异性。与重组sPRR蛋白sPRR-His(图1J和K)或免疫肽(图1L)预孵育后或省略一抗(图1M)后，来自此抗体的信号消失。
这些免疫染色结果提出了这样一种观念，即来源于夹层细胞或其他小管的sPRR可以作用于主细胞中尚未知的膜受体，从而调节肾小管的转运功能。为了测试这种可能性，使用哺乳动物细胞表达系统产生了重组大鼠sPRR。此蛋白质所含的sPRR在N端带有分泌信号，在C端带有八个组氨酸标签(称为“sPRR-His”)，并在12％SDS/PAGE凝胶上显示为单个29.6kDa条带(图2A)。在暴露于10nM sPRR-His的Transwell中对大鼠髓质内层集合管(IMCD)细胞进行原代培养24小时后，在mRNA和蛋白质水平上均显示AQP2表达显著增加(图2B和C)。在一个单独的实验中，通过荧光素酶报告构建体pGL3-AQP2瞬时转染了小鼠永生的皮质集合管(mpkCCD)细胞。用10nM sPRR-His或媒介物处理转染的细胞，持续24小时。sPRR-His处理使得萤光素酶活性为原来的5.5倍(图2D)。体外发现证实了sPRR-His对AQP2表达的直接刺激作用。
ii.CD中Wnt-β-连环蛋白途径的sPRR激活.
用于检索相互作用的基因和蛋白质的搜索工具(STRING)是用于蛋白质-蛋白质结构预测的基于模板的算法。使用STRING鉴定与sPRR相互作用的蛋白质。在10种候选蛋白质中，有三种与Wnt-β-连环蛋白途径有关：frizzled-8(FZD8)、低密度脂蛋白受体相关蛋白质6(LRP6)和Wnt-3a(图2E)。由于FZD8是Wnt-β-连环蛋白途径中的受体组分，因此后续研究集中于FZD8与sPRR之间的相互作用。使用从大鼠髓质内层制备的膜级份蛋白进行的共免疫沉淀实验表明，sPRR与FZD8结合(图3A)。免疫染色显示，在低放大率下(图3B)，FZD8标记主要出现于髓质外层和内层，而在皮质中则偶有标记。与AQP2(CD主细胞的标记物)的共标记，以及对连续切片中电中性钠、钾和氯化物共转运蛋白(NKCC2)(升支粗段细胞的标记物)的标记(图3C)，证实了在升支粗段和CD中的FZD8染色。在CD中，在主细胞和夹层细胞中均检测到FZD8染色。FZD8和PRR标记之间的比较是在髓质内层中进行的，其中两个信号大致共定位于CD。在主细胞中，尽管FZD8标记相对弥散(图3D)，但在顶端膜上同时检测到FZD8和PRR。
通过使用FZD8 siRNA和FZD8抑制剂OMP-54F03(OMP)评定了FZD8在介导原代大鼠IMCD细胞中的sPRR信号传导方面的功能作用。通过对FZD8蛋白表达的免疫印迹分析验证了FZD8 siRNA的功效(图4A)。如使用Cignal TCF/LEF报告测定试剂盒(Qiagen)所评定的那样，将大鼠IMCD细胞暴露于10nM sPRR-His持续24小时可诱导Wnt响应性荧光素酶活性的活跃，所述活性被FZD siRNA减弱(图4B)。与此结果相一致，sPRR-His处理显著诱导AQP2蛋白表达，所述AQP2蛋白表达被FZD8 siRNA(图4C)和OMP(图4D)以及端锚聚合酶抑制剂XAV939(XAV)(图4E)减弱(26)。端锚聚合酶属于聚(ADP-核糖)聚合酶家族，负责将ADP核糖从NAD+转移至受体蛋白，并通过稳定axin-β-连环蛋白复合物激活Wnt-β-连环蛋白途径。结果表明，sPRR信号经由FZD8激活Wnt/β-连环蛋白途径，从而导致AQP2表达增加。
众所周知，精氨酸加压素(AVP)通过增加AQP2的磷酸化并通过慢性(在数小时内)刺激AQP2转录(两者皆经由cAMP-PKA途径)来诱导AQP2运输至顶端膜。据发现，响应于30分钟AVP暴露的cAMP的快速升高和AQP2从胞质到膜的重新分布不受XAV处理的影响(图5A-C)；通过检查分级细胞样品中AQP2蛋白的丰度来评估运输事件。免疫印迹检测到AQP2蛋白为35-45kDa和29kDa的多个条带，这些条带分别反映了糖基化形式和非糖基化形式。相比之下，在24小时时，XAV处理有效地减弱了AQP2的cAMP水平(图5D)和总蛋白丰度(图5E)和mRNA表达(图5F)的增加。这些结果表明，Wnt-β-连环蛋白途径可通过与AVP处理后晚期而非早期的cAMP产生选择性偶联，特异性地靶向AQP2基因转录，但不靶向AQP2运输。
iii.β-连环蛋白信号传导在大鼠中在抗利尿过程中的体内作用.
为了探讨β-连环蛋白信号传导在体液稳态中的体内作用，在基础状况下和48小时脱水(WD)期间，向Sprague-Dawley(SD)大鼠施用OMP和XAV，并评估其对水余量的影响。在基础状况下，在48小时内施用OMP和XAV同样会诱导多尿、多饮和低渗尿(图6A-C)。在48小时WD内，这些处理会持续增加尿量并降低尿渗透压，并且这些影响伴随着体重急剧减轻(图6D-F)以及血浆渗透压和血细胞比容(Hct)的更大增加(图6G和H)。免疫印迹显示，在WD后，皮质和髓质内层的核级份中的β-连环蛋白蛋白的丰度均增加，这指示β-连环蛋白信号传导的激活(图7A和B)。WD后，肾皮质和髓质内层中AQP2蛋白的丰度显著增加；这种增加被OMP和XAV大大减弱(图7C-F)。
iv.sPRR-His在治疗肾原性尿崩症方面的治疗潜力.肾原性尿崩症
(NDI)通常是由加压素2受体(V2R)基因突变引起的；目前缺乏对这种疾病的特异疗法。在V2R拮抗剂OPC诱导的小鼠NDI模型中探索了sPRR-His的治疗潜力。通过由微型渗透泵驱动的置于颈静脉的导管慢性地注入sPRR-His。在sPRR-His输注7天后，通过管饲法以30mg·kg-1·d-1给予OPC 3天。施用V2R拮抗剂会导致NDI症状，包括多饮、多尿和低渗尿，所有这些都会通过sPRR-His治疗而减弱(图8A-C)。此结果支持sPRR在控制NDI症状方面的治疗潜力。在OPC处理的小鼠中，尿sPRR***被显著抑制(图8D)，为使用外源性sPRR治疗NDI提供了理论依据。此结果还表明，肾sPRR的产生可受AVP-V2R途径的直接控制。为了支持此观点，已经表明将CD细胞暴露于AVP会刺激sPRR的释放。图8E提供了sPRR在CD主细胞中的作用机制的示意图。数据表明，sPRR结合FDZ8，导致β-连环蛋白激活，从而促进慢性cAMP积累，最终增强AQP2转录。
v.LXR激动作用诱导尿崩症并抑制肾PRR.
除了公认的调节脂质和葡萄糖代谢的作用外，LXR还可能是RAS和体液平衡的调节剂。对LXR可能影响肾PRR表达和局部RAS并因此影响体液稳态的假说进行了测试。在最初的实验中，在小鼠中检查了LXR激动剂TO901317对体液稳态以及肾PRR和尿肾素水平的影响。用TO901317对C57BL6小鼠处理7天可减轻体重(32.36±0.63对28.61±0.36g，P＜0.05)并减少食物摄取(4.08±0.19对3.54±0.15g，P＜0.05)，但程度较轻。这种处理导致严重的多尿(图9A)和低渗尿(图9B)，指示尿液浓缩缺陷。分别通过免疫印迹和ELISA检查肾PRR蛋白的表达和尿sPRR的***。肾PRR表达(图9C和D)和尿sPRR***(图9E)均始终被TO901317抑制。该实验表明抑制的肾PRR水平可能与TO901317诱导的尿崩症(DI)有关。
进行细胞培养实验以检查TO901317对PRR表达的直接作用。将mpkCCD细胞暴露于TO901317或媒介物持续24小时，并通过免疫印迹测定PRR蛋白表达。TO901317处理使PRR蛋白表达降低85％(图9F和G)，使培养基sPRR降低60％(图9H)。在单独的实验中，通过pGL3-PRR构建体瞬时转染mpkCCD细胞。将转染的细胞用TO901317或媒介物处理24小时。TO901317处理将荧光素酶活性抑制了76％(图9I)。体外发现证实TO901317对PRR表达具有直接抑制作用。
vi.sPRR-His减弱小鼠的TO901317诱导的DI.
在后续实验中，对TO901317诱导的DI进行了更详细的分析，并在此现象中进一步研究了抑制肾PRR的原因。该实验包括三组：对照组、TO901317处理的小鼠和TO901317+sPRRHis处理的小鼠。TO901317处理的小鼠表现出多尿、多饮、水余量降低、低渗尿和血浆容量减缩(反映为Hct升高)，证实了尿液浓缩缺陷(图10)。在用TO901317+sPRR-His处理的小鼠中，所有这些参数均得到了显著改善(图10)。值得注意的是，水余量是通过从摄水量中减去尿量来确定的。AQP2是CD顶端膜上的主要水通道，其在确定尿液浓缩能力中起着关键作用。免疫印迹表明，TO901317显著降低了肾AQP2表达，这被sPRR-His部分恢复(图11A和B)。sPRR-His可以影响肾内RAS，这种作用可以通过尿肾素活性来反映。如通过测量血管紧张素I(AngI)的生成来评估的尿肾素活性被TO901317抑制，而该抑制作用被sPRR-His完全逆转(图11C)。还进行了ELISA以确定尿液中的肾素原/肾素浓度。虽然尿肾素原/肾素***被TO901317抑制，但不受sPRRHis影响(图11D)。此结果与sPRR主要在其活性水平上调节肾素的概念相符(3)。图11E提供了TO901317诱导DI的机制的示意图。与TO901317结合后，LXR充当转录阻遏物，以使PRR转录失活。降低的PRR/sPRR水平下调AQP2表达，进而导致DI。
2.讨论
sPRR通过在高尔基体中的蛋白酶介导的裂解而产生，并释放到血浆或尿液中。在各种病理状态下血清sPRR水平升高。使用药理学和条件基因敲除方法来证明CD PRR在确定肾AQP2表达和尿液浓缩能力方面具有重要作用。在本研究中，发现sPRR通过FZD8依赖性β-连环蛋白信号传导激活发挥作用，这导致AQP2表达增加，因此增强了尿液浓缩能力。另外，TO901317对LXR的激动作用可通过抑制肾PRR和肾内RAS诱导DI。
发现了sPRR-His对在Transwell中生长的培养大鼠IMCD细胞中的AQP2表达的刺激作用。在该实验中，sPRR-His的浓度为10nM，这可能是生理浓度。此外，检查了sPRR-His上调AQP2的信号传导机制，揭示了FZD8依赖性β-连环蛋白信号传导的参与。这表明sPRR和FZD8之间的相互作用是通过用于预测蛋白质-蛋白质结构的基于模板的算法而获得的。通过共免疫沉淀证实了大鼠髓质内层膜级份中两种蛋白质的物理相互作用。还在功能水平下证明了这种相互作用，因为siRNA对FZD8的抑制和药理学方法有效地减弱了sPRR-His对培养的CD细胞中的AQP2的刺激作用。通过使用FZD8抑制剂OMP在体内证实了FZD8在调节肾AQP2表达和尿液浓缩能力中的功能作用。通用Wnt/β-连环蛋白抑制剂XAV的相似作用支持FZD8的抗利尿功能。免疫染色表明FZD8定位于CD和升支粗段，这与PRR的肾单位分布型式一致。在CD中，在主细胞和夹层细胞中均发现了FZD8标记，这种型式与sPRR标记并不完全相同。FZD8可以提供与sPRR关联之外的功能。这些结果与先前的报告相一致，即在mpkCCDc14细胞中β-连环蛋白信号传导介导AVP诱导的AQP2表达。显然，β-连环蛋白信号传导通过与sPRR偶联而积极参与了体液稳态的生理调节。
大量证据表明，PRR作为Wnt受体复合物的组分，可在不存在RAS的低等脊椎动物中调节胚胎发生。显然，PRR在低等脊椎动物中以肾素非依赖性方式起作用。如具有全身性或组织特异性PRR缺失的小鼠中的致死表型所证实的那样，PRR似乎也参与了哺乳动物胚胎发生的调节。大量研究挑战了PRR的生理功能及其与RAS的关系)。RAS和发育性β-连环蛋白途径之间的内在联系是否在哺乳动物的发育或生理环境中发生是未知的。这些结果将肾素原/sPRR与体液稳态生理调节期间肾脏中的β-连环蛋白途径关联起来。
cAMP-PKA途径是AVP诱导的AQP2运输和转录的主要介质。关于在AVP诱导的信号传导期间Wnt-β-连环蛋白途径是否与cAMP-PKA途径相互作用，存在问题。Wnt-β-连环蛋白途径的抑制作用不影响AQP2运输至膜级份或由30分钟AVP暴露诱导的cAMP产生。相比之下，此操作确实阻断了由24小时AVP处理诱导的AQP2表达和cAMP产生。这些结果表明，在延长AVP处理以增加AQP2转录期间，Wnt-β-连环蛋白途径的激活可能主要参与维持cAMP的产生。似乎不需要此机制来调节AQP2运输，AQP2运输是对AVP的快速响应。关于cAMP-PKA途径在这种对AVP的急性响应中的作用存在大量的信息，但是对该途径在慢性AVP处理情况下的作用了解相对较少。本研究描述了β-连环蛋白信号传导在cAMP-PKA-AQP2轴的慢性而非急性调节中的独特作用。
本研究以及之前的多项研究一致证明，在CD内，通过使用针对PRR C端的抗体(抗PRR-C抗体)在夹层细胞中检测到PRR。关于来源于夹层细胞的PRR如何上调主细胞中的AQP2表达，存在问题。这种调节可以通过旁分泌机制进行，并且存在一个奇妙的可能性，那就是sPRR可以充当CD中两种细胞类型之间通信的介质。针对sPRR中表位的抗体，即抗PRR-N抗体，仅对主细胞染色，而不对夹层细胞或已知表达PRR的其他非CD小管染色。来自细胞培养实验的更直接证据表明，将大鼠IMCD细胞暴露于纳摩尔范围内的sPRR-His会使得AQP2表达显著增加，从而模仿了肾素原的作用。此结果表明sPRR具有生理功能。
目前对DI的治疗并不理想。尽管补充AVP对中枢性DI有效，但目前尚无针对肾原性DI的特异性疗法。本研究证明了sPRR-His在V2R拮抗作用诱导的肾原性DI小鼠模型中的治疗潜力。由于sPRR在V2R的下游起作用，因此对中枢性DI的治疗也应有效。
大量证据表明能量代谢与体液平衡之间存在联系。高能状态(诸如肥胖症)与电解质和体液平衡失衡和高血压有关，而低能状态(诸如禁食)会诱导钠尿和利尿。沿着这样的思路，PPARγ(葡萄糖代谢和脂肪生成的关键调节剂)的激活会导致体重增加和血浆容量增加。在本研究中，已确定针对TO901317的LXR在小鼠中发挥了深厚的利尿作用，表现为多尿、多饮、低渗尿和血浆容量减缩。CD顶端膜上的主要水通道AQP2被显著抑制，这可能赋予TO901317利尿作用。
鉴于sPRR是AQP2表达和尿液浓缩能力的关键调节剂，PRR/sPRR被认为是肾脏中LXR的分子靶标。体内数据显示，在TO901317处理的小鼠中，肾PRR表达和尿sPRR***显著减少，并且sPRR-His的施用完全挽救了TO901317诱导的DI。与该观察结果相一致，体外数据证明TO901317对培养的CD细胞中的PRR表达和PPR-荧光素酶活性具有直接抑制作用。这些结果证明，LXR可以充当PRR基因的转录阻遏物。有趣的是，LXRβ-/-小鼠表现出由AVP产生受损引起的中枢性DI(33)。这种表型表明LXRβ具有抗利尿作用，这与TO901317的利尿作用相反。TO901317的利尿作用可能主要由LXRα赋予。这种可能性需要在将来使用LXRα缺陷型小鼠的研究中进行验证。
已经显示，急性LXR激活诱导肾小球旁细胞中肾素转录的瞬时增加，但在异丙肾上腺素处理后其慢性激活显著抑制心脏和肾脏中肾素AT1R和血管紧张素1转化酶1(ACE)的表达。与LXR对局部RAS的抑制作用相一致，发现TO901317处理可抑制尿肾素(肾内RAS的指标)。尽管LXR在急性情况下可以充当肾小球旁器处肾素表达的负调节剂，但它们似乎主要抑制PRR和局部RAS而引起利尿响应。
总之，本研究报告了sPRR在调节体液稳态中的生物学功能。sPRR与FZD8缔合以激活β-连环蛋白，β-连环蛋白与cAMP-PKA途径相互作用，进而诱导AQP2表达并增强尿液浓缩能力。因为夹层细胞是sPRR的潜在来源，而主细胞是其作用的部位，所以sPRR介导CD中两种细胞类型之间的通讯似乎是合理的。最后，LXR激动剂TO901317的利尿作用，是通过抑制肾PRR/sPRR系统来实现的。
3.方法
i.动物
分别从Charles River Laboratories和Jackson Laboratory购买10至12周龄的雄性SD大鼠和C57BL6小鼠。所有动物的估计水平为50mg·kg体重-1·d-1。将所有小鼠置于代谢笼中，并在实验结束时记录并收集24小时的摄水量和尿排出量。
ii.细胞培养实验
对于sPRR信号传导研究，如前所述，从4周龄SD大鼠制备原代IMCD细胞(35)。使细胞在具有含有10％(体积/体积)FBS、0.5μM8-Br-cAMP、130mM NaCl和80mM尿素的DMEM/F-12培养基的Transwell板(目录号29442-074；VWR International)中生长。汇合后，对细胞剥夺血清持续12小时，并用抑制剂(10μM XAV或10μM OMP)预处理，之后用AVP(10nM)或sPRR-His(10nM)处理24小时。在实验结束时，收集培养基用于生物化学测定。
在mpkCCD细胞中测试TO901337对PRR表达的影响。这些细胞在六孔板中生长至汇合。经过12小时血清剥夺后，将细胞用媒介物或10μM TO901317处理24小时，然后收获用于PRR表达和sPRR释放的分析。在单独的实验中，用含有在PRR基因的2，016bp 5′侧翼区的控制下的荧光素酶基因的构建体瞬时转染约50％密度的mpkCCD细胞。汇合后，将转染的细胞用媒介物或10μM TO901317处理24小时，然后收获用于荧光素酶活性分析。
iii.酶免疫测定.
根据制造商的说明，使用市售sPRR酶免疫测定(EIA)试剂盒(目录号JP27782；Immuno-Biological Laboratories)测定尿或培养基sPRR。
iv.免疫荧光染色.
将组织在10％中性***缓冲液中固定24小时，接着包埋在石蜡中。去石蜡后，对薄切片(4μm)进行处理以进行免疫荧光双重标记。为了回收抗原，将载玻片浸入高温(98℃)的Tris·HCl EDTA缓冲液(pH 9.0)中持续12分钟。将载玻片在1％(质量/体积)BSA中封闭1小时，接着与一抗一起在4℃下孵育过夜。洗掉一抗后，将切片与驴抗山羊IgG-FITC(Santa Cruz)或驴抗兔IgG-TRITC(Life Technologies)一起在室温下孵育1小时。来自Abcam的兔抗PRR抗体是针对C端的335-350残基而产生(称为“抗PRR-C抗体”)。本研究中所用的针对PRR的N端的残基218-235而产生的第二抗PRR抗体(称为“抗PRR-N抗体”)在Y.F.的实验室中产生(24)。山羊抗AQP2抗体购自Santa Cruz。兔抗NKCC2抗体购自Stress-MarqBiosciences Inc。
v.免疫印迹.
裂解肾组织，随后进行超声处理。使用Coomassie试剂测定蛋白质浓度。将每个样品中的40微克蛋白质在沸水中变性，通过SDS/PAGE分离，并转移到硝酸纤维素膜上。将印迹在含5％脱脂奶粉的Tris缓冲盐水(TBS)中封闭1小时，之后与一抗孵育一起过夜。用TBS洗涤后，将印迹与山羊抗兔/小鼠HRP缀合二抗一起孵育，并使用ECL可视化。通过使用Image-Pro Plus(Media Cybernetics)定量印迹。一抗是山羊抗AQP2抗体、兔抗PRR-N抗体和兔抗FZD8抗体(均来自Santa Cruz)、兔抗V2R抗体(Abcam)以及山羊抗β-连环蛋白抗体(Novus)。
vi.定量RT-PCR.
从肾脏组织中分离出总RNA，然后反转录为cDNA。使用Primer3软件(bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)设计寡核苷酸。AQP2的引物为5′-gctgtcaatgctctccacaa-3′(有义)和5′-ggagcaaccggtgaaataga-3′(反义)；GAPDH的引物为5′-gtcttcactaccatggagaagg-3′(有义)和5′-tcatggatgaccttggccag-3′(反义)。
vii.细胞膜和细胞质蛋白级份分离.
根据制造商的说明，使用试剂盒(目录号BSP002；Bio Basic Inc.)提取膜和胞质蛋白级份。
viii.共免疫沉淀.
针对与PRR和FZD8的共免疫沉淀，使用试剂盒(目录号BSP002；Bio Basic Inc.)进行大鼠肾髓质内层膜级分。将抗PRR-N(来自Y.F.)或抗FZD8(Santa Cruz)抗体与磁珠(目录号88805；Pierce)交联，接着与肾髓质膜蛋白一起孵育30分钟。收集磁珠，洗涤并洗脱。通过免疫印迹分析免疫沉淀样品的结合配偶体。
ix.在培养的原代IMCD细胞中进行的siRNA或质粒转染.
使用HiPerFect转染试剂(目录号301702；Qiagen)用5nM终浓度的FZD8 siRNA寡核苷酸(Invitrogen)或荧光素酶报告质粒(目录号CCS-018L；Qiagen)转染IMCD细胞，持续72小时。通过FZD8免疫印迹验证了FZD8敲低的效率。对于萤光素酶测定，每个样品均由阳性对照物、阴性对照物和靶萤光素酶构建体组成，并且根据制造商的说明计算报告活性。
x.萤光素酶构建体的制备.
使用组织DNA试剂盒(D3396-01；Promega)从大鼠尾巴提取基因组DNA。通过PCR从大鼠基因组DNA扩增PRR基因(GenBank登录号NM_001007091；1，941±75bp)的5′侧翼区的2，016bp片段，并使用NheI和BgIII限制性位点亚克隆到pGL3-Basic报告载体(Promega)中；此构建体被称为“pGL3-PRR”。通过类似的策略将AQP2基因(GenBank登录号NM_012909；2,000±84bp)的5′侧翼区的2，084bp片段克隆到pGL3-Basic报告载体中；此构建体被称为“pGL3-AQP2”。通过测序验证这些构建体的同一性。
xi.萤光素酶测定.
通过使用HiPerFect转染试剂(目录号301702；Qiagen)，用pGL3-AQP2质粒或空载体转染mpkCCD细胞。汇合后，使所有细胞饥饿12小时；接着分别用TO901317(10μM)或sPRR-His(10nM)处理经pGL3-PRR和pGL3AQP2转染的细胞持续24小时。媒介物处理的组作为对照组。使用荧光素酶测定系统(Promega)测量荧光素酶活性，并使用照度计(BMG FLUOstarOPTIMA)检测发光。
xii.统计分析.
数据总结为平均值±SE。使用ANOVA进行统计分析，利用Bonferroni检验进行多次比较，或者利用配对或非配对学生t检验进行两次比较。P＜0.05被视为具有统计学显著性。
B.可溶性肾素(原)受体的治疗用途
肾素(原)受体(PRR)是肾素-血管紧张素系统的新组成部分。28kDa可溶性形式PRR(sPRR)可以通过经由弗林蛋白酶的胞内裂解而产生并分泌到血浆中。大量临床研究表明循环sPRR的重要性。通过ELISA，在怀孕期间以及患有心力衰竭、妊娠期糖尿病、阻塞性睡眠呼吸暂停综合症、原发性上皮性卵巢癌的患者中，sPRR的血清水平升高。在此研究中，生成了带有组氨酸标签的重组sPRR(称为sPRR-His)，并检查了其对原代IMCD细胞中水通道蛋白-2(AQP2)表达和体内尿液浓缩能力的影响。纳摩尔范围内的sPRR-His诱导AQP2mRNA和蛋白表达并增强尿液浓缩能力，因此可治疗肾原性尿崩症。
1.方法
i.动物
两个月大的雄性C57/BL6小鼠购自Jason Laboratory。给动物喂食正常饮食或高脂饮食持续8个月。将高脂喂养的动物分组以经由放置在颈静脉中的导管(导管的另一端连接至微型渗透泵)接受媒介物或sPRR-His输注。
ii.胰岛素耐量测试(ITT)和葡萄糖耐量测试(GTT)
进行这些测试是为了评估胰岛素敏感性和葡萄糖代谢。设计胰岛素耐量测试以确定啮齿动物中胰岛素响应组织的敏感性。这是通过测量大剂量腹膜内(IP)胰岛素注射后随时间在循环中残留的葡萄糖来确定的。禁食6小时后，在异氟烷麻醉下，施用胰岛素(0.25U/kg体重)，通过切尾的方法收集一滴血液(约5μl)，并在0、15、30、60和90分钟时直接转移到葡萄糖指示条上。实验结束时，用70％酒精擦拭尾巴，然后放干。在将动物放回其笼子之前，请确保从尾部止血。葡萄糖耐量测试测量IP注射的葡萄糖负荷从体内的清除率。它用于检测可能与糖尿病或代谢综合症有关的葡萄糖代谢。禁食6小时后，在通过IP注射施用葡萄糖溶液之前，先测定禁食血糖水平。随后，如上文针对ITT测试所述，在接下来的90分钟内的不同时间点测量血糖水平。所提议的ITT和GTT测试可应用于此方案中的所有动物品系，尤其是当它们出现代谢综合征或血浆葡萄糖或胰岛素异常的迹象时。
iii.胰岛素ELISA测定
用市售试剂盒(超敏小鼠胰岛素ELISA试剂盒，Crystal Chem，#90080)测量胰岛素。收集血液并离心。血浆用于以下测试。使样品中的胰岛素与微孔板上包被的豚鼠抗胰岛素抗体结合。洗涤后，接着添加辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗胰岛素抗体。这些酶标记的抗体与先前结合的胰岛素形成复合物。通过添加TMB底物检测微孔板孔中结合的HRP缀合物。测量450nm处的吸光度。
iv.白蛋白测定
用市售试剂盒(小鼠白蛋白ELISA试剂盒，GenWay，#GWB-282C17)测量小鼠尿白蛋白。尿白蛋白与包被在微孔板上的抗白蛋白抗体发生反应。洗涤后，接着添加辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗白蛋白抗体。这些酶标记的抗体与先前结合的白蛋白形成复合物。通过添加TMB底物检测微孔板孔中结合的HRP缀合物。测量450nm处的吸光度。
2.结果
在当前的研究中，在高脂饮食喂养的雄性C57/BL6小鼠中，测试了sPRR-His(重组可溶性肾素(原)受体)对肥胖症和肥胖症相关疾患的作用。小鼠接受高脂饮食持续8个月(DIO)。在最后两周内，将DIO小鼠随机分组以通过由微型渗透泵驱动的静脉输注接受媒介物或sPRR-His。长期高脂饮食诱导的DIO模型发展为严重的肥胖症，伴以葡萄糖和胰岛素抵抗增加、脂质谱异常和脂肪肝。2周sPRR-His处理可显著降低体重(图12)。sPRR-His组的肾周脂肪量较少(图13)。与瘦对照组相比，DIO小鼠的血浆葡萄糖和胰岛素增加(图14)，表明长期高脂饮食诱导2型糖尿病，这归因于胰岛素抵抗。随后进行GTT和ITT以检查胰岛素敏感性状况。DIO小鼠表现出GTT受损，通过sPRR-His处理受损几乎完全正常化(图15A)。同时，DIO小鼠的ITT受损，这是胰岛素抵抗的证明。在ITT的90分钟内，DIO和瘦对照组的血糖逐渐回到基线。令人惊讶的是，在大剂量注射胰岛素后，DIO+sPRR-His组的血糖持续下降很多。从血糖下降反映出，即使在90分钟时，DIO+sPRR-His中的胰岛素敏感性仍保持在峰值水平，相比之下DIO和瘦对照组中的血糖水平在最后一个时间点时几乎完全恢复(图15B)。DIO小鼠的肝脏外观苍白(图16A)。对肝脏匀浆进行离心后，上部白层反映出脂质含量，与瘦对照组相比，DIO小鼠中的脂质含量明显增加。通过sPRR-His处理脂质层几乎已正常化(图16B)。通过测量肝脏中甘油三酸酯含量证实了此结果(图16C)。从三个不同参数得出的一致结果表明，sPRR-His在脂肪变性治疗中具有保护作用。有趣的是，sPRR-His输注并没有影响循环甘油三酸酯水平(图17)，这表明sPRR-His的抗脂肪变性作用对全身脂质谱没有影响。这是重要的观察结果，因为基于脂解作用的抗肥胖症疗法将与循环脂质水平升高的不利后果相关联。肥胖症也是慢性肾病的危险因素。DIO小鼠的尿白蛋白***增加，而sPRR-His输注则减弱了这种现象(图18)。
图19示出了sPRR-His对尿量和附睾脂肪量以及在锂处理的小鼠中的作用。此实验最初旨在检查sPRR-His对锂诱导的尿崩症的作用。LiCl被广泛用于治疗精神障碍，但与多尿相关联。LiCl如何削弱尿液浓缩能力的机制尚不清楚，但可能与加压素无关。单独用LiCl或与sPRR-His联合治疗雄性C57/BL6小鼠。尽管与sPRR-His共同施用未能影响Li诱导的多尿(图19A)，但出人意料地减少了脂肪量(图19B)。附睾脂肪的图像在图19C中示出。Li+sPRR-His组中的脂肪比其他两组中的脂肪更小，并且更“着褐色”。此结果表明，sPRR-His可以促进附睾脂肪由白色转化至褐色。不管潜在的机制如何，尽管本研究中使用的动物不是肥胖症模型，但此结果表明sPRR在抑制脂肪量方面具有新的治疗潜力。这一发现促使随后对sPRR在饮食诱导的肥胖症中的作用进行了研究。另外，此结果表明，sPRR主要有效地减轻由于加压素产生或信号传导受损而引起的尿崩症，而非由于锂毒性而引起的尿崩症。每组N＝4-5。数据为平均值±SE。
本领域技术人员将认识到或者能够仅使用常规实验确定本文所述的方法和组合物的具体实施方案的许多等效物。这些等效物旨在由以下权利要求涵盖。
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Ala Asn Glu Phe Ser Ile Leu Arg Ser Pro Gly Ser Val Val Phe Arg
1 5 10 15
Asn Gly Asn Trp Pro Ile Pro Gly Asp Arg Ile Pro Asp Val Ala Ala
20 25 30
Leu Ser Met Gly Phe Ser Val Lys Glu Asp Leu Ser Trp Pro Gly Leu
35 40 45
Ala Val Gly Asn Leu Phe His Arg Pro Arg Ala Thr Ile Met Val Thr
50 55 60
Val Lys Gly Val Asp Lys Leu Ala Leu Pro Thr Gly Ser Val Ile Ser
65 70 75 80
Tyr Pro Leu Glu Asn Ala Val Pro Phe Ser Leu Asp Ser Val Ala Asn
85 90 95
Ser Ile His Ser Leu Phe Ser Glu Glu Thr Pro Val Val Leu Gln Leu
100 105 110
Ala Pro Ser Glu Glu Arg Val Tyr Met Val Gly Lys Ala Asn Ser Val
115 120 125
Phe Glu Asp Leu Ser Val Thr Leu Arg Gln Leu Arg Asn Arg Leu Phe
130 135 140
Gln Glu Asn Ser Val Leu Asn Ser Leu Pro Leu Asn Ser Leu Ser Arg
145 150 155 160
Asn Asn Glu Val Asp Leu Leu Phe Leu Ser Glu Leu Gln Val Leu His
165 170 175
Asp Ile Ser Ser Leu Leu Ser Arg His Lys His Leu Ala Lys Asp His
180 185 190
Ser Pro Asp Leu Tyr Ser Leu Glu Leu Ala Gly Leu Asp Glu Leu Gly
195 200 205
Lys Arg Tyr Gly Glu Asp Ser Glu Gln Phe Arg Asp Ala Ser Arg Ile
210 215 220
Leu Val Asp Ala Leu Gln Lys Phe Ala Asp Asp Met Tyr Ser Leu Tyr
225 230 235 240
Gly Gly Asn Ala Val Val Glu Leu Val Thr Val Lys Ser Phe Asp Thr
245 250 255
Ser Leu