阅读说明：本技术 板蓝根吲哚醛在制备抗病毒药物中的应用 (Application of the Radix Isatidis indolal in preparation antiviral drugs ) 是由 杨子峰 李征途 李菁 李润峰 周红霞 李楚源 王德勤 于 2018-05-25 设计创作，主要内容包括：本发明提供了板蓝根吲哚醛在制备抗病毒药物中的应用,其中病毒为以下的任意一种：副流感病毒、单纯疱疹病毒、肠道病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒。本发明提供的药物安全有效、毒副作用小。(The present invention provides Radix Isatidis indolal preparation antiviral drugs in application, wherein virus be it is below any one: parainfluenza virus, herpes simplex virus, enterovirus, rhinovirus, Coxsackie virus.Drug provided by the invention is safe and effective, toxic side effect is small.)

板蓝根吲哚醛在制备抗病毒药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，特别是涉及板蓝根吲哚醛在制备抗病毒药物中的应用。

背景技术

病毒引起的感染性疾病一直严重地威胁着人类的生命与健康。据统计，80％以上的传染病是由病毒引起的。而病毒感染中最常见的是由呼吸道病毒和肠道病毒造成的感染。常见病毒包括呼吸道合胞病毒(RSV)；副流感病毒(PIV3)；腺病毒(ADV)；单纯疱疹病毒(HSV-1、HSV-2)；肠道病毒(EV71)；鼻病毒(HRV)；柯萨奇病毒(CoxA16)。呼吸道合胞病毒是婴幼儿呼吸道感染的最主要的病源，同时也是老年人以及免疫缺陷人群下呼吸道感染的主要因素，目前尚无有效疫苗和专门针对呼吸道合胞病毒感染的治疗药物；人类副流感病毒(PIVs)常常引起儿童下呼吸道感染的一种病毒，其致病性仅次于呼吸道合胞病毒(RSV)；腺病毒感染暴发时有发生，所致急性呼吸道感染传染性强，疫情发展快，部分病例病情严重，是引起儿童呼吸道感染的常见病毒，其中腺病毒肺炎是婴幼儿肺炎的严重类型，同时腺病毒传染性很强，特别是在人口密集的地方，对免疫力低下的病人通过飞沫和接触更易传染。因此其危害不容忽视。人类单纯疱疫病毒分为两型，1型和2型。1型主要引起生殖器以外皮肤、粘膜口腔粘膜和器官脑的感染。2型则主要引起生殖器部位皮肤粘膜感染。生殖器疱疫是以引起为主的性传播病，发病率高，可通过胎盘及产道感染新生儿，导致流产或新生儿死亡，与***的发生也有关。鼻病毒属小核糖核酸病毒,不仅能引起普通感冒,还能导致急、慢性支气管炎等其他呼吸系统感染疾病,尤其与儿童哮喘的发病关系更为密切。柯萨奇病毒属小核糖核酸病毒科，肠道病毒属。主要经由粪口途径感染。柯萨奇病毒可引起流行性胸痛、无菌性脑炎、脑膜脑炎和心包炎，尤其是病毒性心肌炎的主要病原体，能引起心肌组织发生灶性坏死，并伴有炎性细胞浸润，心肌细胞裂解等病理改变病毒持续感染可导致扩张性心肌病。据统计，全世界每年心肌炎患病率为个万，急性心包炎患者、急性心肌炎患者有近期或复发的感染。由于缺乏有效的治疗药物，许多患者演变为慢性扩张性心肌病，最后死于心力衰竭。由于柯萨奇病毒是典型的溶细胞病毒，目前尚无理想有效的化学药物。

20世纪年代以来，研究人员发现不少新的抗病毒药物，目前在临床上应用的抗病毒药物已超过余种，但其确切疗效则仍存在很大争议。因病毒是寄生宿主细胞内，要保证抗病毒的药物具有高度选择性，既要能进入细胞，选择性地有效干扰病毒的复制过程，又要避免伤害宿主细胞，这是抗病毒尤其呼吸道病毒西药中多存在选择性高和毒副作用高的主要原因。而且抗病毒化学合成类药物长期应用后，病毒易对其产生耐药性，现已成为临床上治疗病毒性疾病的棘手问题。所以抗病毒药物的研究具有重要的实际意义，寻找高效、安全、副作用少的抗病毒药物的研究势在必行。

发明内容

本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种安全低毒高效的用于治疗常见病毒感染疾病的药物。

为此，本发明提供了板蓝根吲哚醛在制备抗病毒药物中的应用，其中，所述病毒为以下的任意一种：副流感病毒(PIV3)、单纯疱疹病毒(HSV-1、HSV-2)、肠道病毒(EV71)、鼻病毒(HRV)、柯萨奇病毒(CoxXB3)。

本发明的板蓝根吲哚醛优选从板蓝根中分离和提纯得到，其结构式为：

本发明还提供了板蓝根吲哚醛在制备用于抑制病毒的子代复制(即抑制病毒增殖)的药物中的应用，其中，所述病毒为以下的任意一种：副流感病毒(PIV3)、单纯疱疹病毒(HSV-1、HSV-2)、肠道病毒(EV71)、鼻病毒(HRV)、柯萨奇病毒(CoxXB3)。

进一步的，所述板蓝根吲哚醛是从板蓝根中提取的。

进一步的，所述药物可制成药学上允许的任意剂型，其剂型例如但不限于片剂、胶囊等。

实验结果表明，本发明提供了一种安全有效、毒副作用小的用于治疗临床广谱病毒性疾病的药物。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合具体实施例对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限于以下实例。

实施例1板蓝根吲哚醛单体成分分离纯化、结构鉴定

板蓝根吲哚醛分离流程：

乙酸乙酯部分30g，以硅胶(200-300目)拌样，挥干后进行硅胶柱层析(200-300目，10×20cm)，用石油醚-乙酸乙酯作流动相梯度洗脱(1:1-0:1,v/v)，最后用甲醇洗脱。每500ml接一组份，各洗脱液分别减压回收溶剂，以TLC进行检测，合并组成相似的洗脱液，共得到8个部分Fr.A-Fr.H。

各组份再以分析性HPLC检测合并Fr.B～Fr.D。Fr.B～Fr.D棕褐色膏状物，约7.8g，以硅胶(200-300目)拌样，挥干后进行硅胶柱层析(200-300目)，用石油醚-乙酸乙酯作流动相梯度洗脱(10:1-8:1-3:1-3:2-0:1,v/v)。每100ml接一组份，各洗脱液分别减压回收溶剂，以TLC进行检测，合并组成相似的洗脱液，得到7个组份，Fr.1～Fr.7。

Fr.3用甲醇溶解拌硅胶(200～300目)，挥干后上硅胶柱(200～300目)，以石油醚-乙酸乙酯做流动相梯度洗脱(3:1-3:2-3:2,v/v)，最后用甲醇冲柱，石油醚-乙酸乙酯(3:1)洗脱部分用制备型高压液相分离，以甲醇-水做流动相梯度洗脱，得到28个组份，以分析型高压液相检查，从15～17组份得到淡黄色结晶，经甲醇重结晶后得到化合物B14(板蓝根吲哚醛，4.3mg)

板蓝根吲哚醛结构测定：

淡黄色结晶(甲醇)，mp113～115℃。核磁氢谱显示有6个质子信号，均处于低场。¹H-NMRδ:8.18(1H,d,J＝1.6Hz),7.50(1H,d,J＝1.6Hz),7.30(2H,m)为苯环AA’BB’偶合系统的质子信号。δ9.90(1H,s)为尖锐的单峰符合醛基质子信号化学位移数值，δ8.12(1H,s)对应吲哚环上的质子信号。根据参考文献[1]鉴定为板蓝根吲哚醛。(左丽,李建北,徐景等.板蓝根的化学成分研究.中国中药杂志,2007,32(8):688-691.)。

下面提供的试验例对板蓝根吲哚醛所具有的新功效加以证实，用于进一步阐明本发明，而不构成对本发明范围的限制。

试验例1板蓝根吲哚醛体外抗常见呼吸道病毒活性

1.1.材料

1.1.1药物

阳性对照药：磷酸奥司他韦：购自美国GIBCO公司，货号Y0001337；利巴韦林:购自Sigma，货号R9644，阿昔洛韦购自Sigma，货号A4669；实验药物—以上由实施例1获得的板蓝根吲哚醛：板蓝根生药材由广州白云山和记黄埔中药有限公司提供，采自黑龙江大庆及安徽阜阳板蓝根GAP基地，由中国科学院华南植物院叶华国研究员鉴定为菘蓝Isatisinfigotica Fort.的根，即板蓝根。将其按照实施例1进行提取、纯化、鉴定，获得板蓝根吲哚醛提取物。

1.1.2细胞

LLC-MK2细胞，A549细胞，VERO细胞，MRC5细胞，购自购自美国经典培养物收藏中心(ATCC)

1.1.3常见病毒株

呼吸道合胞病毒(RSV,long strain))；单纯疱疹病毒(HSV-1&HSV-2)；柯萨奇病毒(CoxA16)购自美国经典培养物收藏中心(ATCC)；副流感病毒(PIV3)；肠道病毒(EV71)；腺病毒(ADV)；鼻病毒(RHV)；为本室临床分离株。上述毒株病毒在相应的细胞中进行繁殖。以细胞病变抑制法(CPE)判定这些毒株的半数感染量(TCID 50/100μL)作为病毒原始滴度。

1.1.4试剂

DMSO(美国SIGMA公司)；DMEM(美国GIBCO公司)批号：8114414；胎牛血清(美国GIBCO公司)批号：10099；PBS(美国GIBCO公司)批号：20150122；1mg/mL TPCK批号：20140220，购自广州捷倍斯生物科技有限公司。MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2)购自Genebase。

1.2.实验方法

1.2.1药物溶解

板蓝根吲哚醛，以DMSO溶解配制成工作母液(浓度500mg/mL)，置4℃保存；阳性药物利巴韦林和西多福韦，用DMEM培养液溶解，过滤后置4℃保存。

1.2.2.药物毒性实验(MTT法)

按每孔约2.5×10⁴LLC-MK2细胞，A549细胞，VERO细胞接种到96孔板，24h后待细胞长成单层后，弃去培养液，加入不同稀释度的药物100μL/孔，空白对照和正常细胞对照孔加入100μL/孔DMEM，37℃，5％CO₂继续培养36-48小时，每孔加MTT溶液(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐溶液)(5mg/mL)20μL，置37℃，5％CO₂温箱中继续孵育4小时。吸弃培养上清液，每孔加100μL二甲基亚砜(DMSO)，低速振荡10分钟，使结晶物充分融解。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值。

按照下列公式计算抑制率，并用Reed-Muench法计算50％毒性浓度为药物半数有毒浓度(TC₅₀)。

抑制率＝[(正常组平均OD值－空白组平均OD值)－(给药组平均OD值－空白组平均OD值)]/(正常组平均OD值－空白组平均OD值)×100％。

1.2.3.药物体外抗常见呼吸道病毒活性试验

以细胞病变抑制法(Cytopathic Effect Reduction Method)研究板蓝根吲哚醛对不同常见病毒的抑制作用。长满单层的96孔细胞培养板内的LLC-MK2细胞，A549细胞，VERO细胞吸附病毒2小时，同时设定阳性药物和细胞对照。细胞吸附病毒2h，加入不同浓度药物(除病毒和细胞对照外)在37℃5％CO₂环境下培养。

细胞出现病变程度按以下6级标准记录：-为细胞生长正常，无病变出现；±为细胞病变少于整个单层细胞的10％；+为细胞病变约占整个单层细胞的25％；++为细胞病变约占整个单层细胞的50％；+++为细胞病变约占整个单层细胞的75％：++++为细胞病变约占整个单层细胞的75％以上。用Reed-Muench法计算半数抑制浓度(IC₅₀)，并以选择指数SI表示(SI＝TC₅₀/IC₅₀),SI>2表示低毒高效；SI：1～2表示高毒低效；SI<1表示无效。

1.3.实验结果

1.3.1细胞毒性

利用MTT法测得受试药物的半数有毒浓度(TC₅₀)；见表1。

1.3.2药物体外抑制常见病毒药效

细胞病变抑制试验实验结果表明：板蓝根吲哚醛在治疗模型下对多种常见病毒，副流感病毒(PIV3)；单纯疱疹病毒(HSV-1、HSV-2)；肠道病毒(EV71)；鼻病毒(HRV)；柯萨奇病毒(CoxXB3)均有抑制作用，详见表1。

表1板蓝根吲哚醛体外对不同常见病毒药效作用

可见，本发明由板蓝根提取得到的板蓝根吲哚醛对多种不同的病毒均有抑制其子代病毒复制的作用，可用于制备用于临床防治常见病毒性疾病的药物。