MII-tt-DTT及其在制备抗结直肠癌药物中的应用
阅读说明：本技术 MII-tt-DTT及其在制备抗结直肠癌药物中的应用 (MII-tt-DTT and application thereof in preparing anti-colorectal cancer drugs ) 是由 张磊 程小霞 王群 汤昆 贾爽爽 崔昆丽 陈明亮 刘楠 梁雅喻 李慧珍 田志立 于 2021-09-23 设计创作，主要内容包括：本发明属于化工医药技术领域,具体涉及MII-tt-DTT在制备抗癌药物中的应用,所述MII-tt-DTT的化学结构如下所示：MTT结果显示：MII-tt-DTT能显著抑制结直肠肿瘤细胞的增殖,并定位到线粒体。Annexin V and PI双染凋亡检测结果显示：MII-tt-DTT能诱导细胞凋亡；Western Blot结果显示：MII-tt-DTT能诱导细胞铁死亡。本发明的小分子化合物MII-tt-DTT作为新的抗结直肠肿瘤药物或者其辅助成分进行开发,抑制肿瘤效果显著,将为治疗和治愈结直肠肿瘤提供新的途径和手段。(The invention belongs to the technical field of chemical medicines, and particularly relates to an application of MII-tt-DTT in preparing an anticancer drug, wherein the chemical structure of the MII-tt-DTT is as follows: MTT results show that: MII-tt-DTT significantly inhibited proliferation of colorectal tumor cells and was localized to the mitochondria. The Annexin V and PI double-staining apoptosis detection result shows that: MII-tt-DTT can induce apoptosis; the Western Blot results show: MII-tt-DTT induces cellular iron death. The small molecular compound MII-tt-DTT is developed as a new anti-colorectal tumor medicament or an auxiliary component thereof, has obvious tumor inhibition effect, and provides a new way and a new hand for treating and curing colorectal tumorsAnd (4) section.)
技术领域
本发明属于化工医药技术领域，具体涉及一种MII-tt-DTT在制备抗结直肠癌药物中的应用。
背景技术
结直肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，位居恶性肿瘤发病率的第三位，死亡率位于第二位。结直肠癌的发生率不断升高，对其治疗、预防已引起社会的广泛关注。目前为止临床上对于结直肠癌的治疗方式仍以手术、放疗、化疗为主。手术治疗对病人身体有较大程度的损伤，而且肿瘤的进展分期、部位等也决定着手术的可行性。目前的化疗药物5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、伊立替康等均具有不同程度的副作用。因此，开发新的结直肠癌的治疗药物仍然是众多科研工作者的首要任务。
噻吩(Thiophene)，是一种杂环化合物，噻吩类化合物(Thiophene compounds,TPs)广泛存在于自然界中，尤其是一些抗肿瘤药物的有效分子结构中含有噻吩并环结构骨架，表现出了良好的抗肿瘤活性，因此被广泛的应用于医药治疗领域。已有文献报道，噻吩暴露于长波长紫外光下具有细胞毒性活性。它被紫外光(波长300～400nm)和可见光激发后引发高反应性单线态氧(1O2),后者对生物分子(包括脂类、蛋白质和核酸)产生氧化反应,从而对生物造成毒害。
吲哚是吡咯与苯并联的化合物，又称苯并吡咯。吲哚的衍生物在自然界分布很广，许多天然化合物的结构中都含有吲哚环，有些吲哚的衍生物与生命活动密切相关。吲哚类化合物是一类杂环衍生物生物碱,具有显著的生理活性。国内外大量研究表明,吲哚或吲哚类结构有抗癌作用。已有研究表明，由松果体分泌的褪黑素是一类吲哚类激素，具有显著的抗肿瘤活性。研究发现,切除荷瘤动物的松果体,结果促进了肿瘤的发展。而给予一定量的褪黑素,则可消除对肿瘤的生长刺激。
吲哚类化合物广泛存在于天然产物和具有生物活性的药物分子中，被广泛应用于农业化学和制药工业。最近的研究发现，噻吩并吲哚衍生物还能够被广泛用于设计发光器件和发光材料中，但在药物研究方面应用还比较少，这可能与其选择性地进行一取代或者二取代合成方面的研究较少有关，还需要进一步加强与突破。本发明的MII-tt-DTT是一种三噻吩并吲哚衍生物，自身发出红色荧光，有望应用于肿瘤的治疗。目前没有关于该化合物相关活性的研究。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种新结构化合物MII-tt-DTT及其作为药物的新用途，即MII-tt-DTT在制备抗结直肠癌药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
MII-tt-DTT在制备抗肿瘤药物中的应用，所述MII-tt-DTT的化学结构如下所示：
其相关性质如下：
化学名称：3-(2-(N-甲基-3,3-二甲基-3H-吲哚碘化盐)-1-乙烯基)二噻吩并[3,2-b:2',3'-d]噻吩，简称MII-tt-DTT(注：碘化吲哚Iodide indole简写II，单碘化吲哚简称MII)；
分子式：C21H18NS3I；分子量：507.47；检测方式：1HNMR，13CNMR，HRMS；性状：本品为淡红色粉末；来源：本课题组合成。药理性质：不溶于水，溶于DMSO。
具体的，MII-tt-DTT在制备抗结直肠癌药物中的应用。该化合物是吲哚三噻吩的衍生物。
进一步的，所述MII-tt-DTT的抗结直肠癌作用浓度为0.0975－25μM。
本发明提供了一种抑制体外肿瘤细胞增殖的方法，其将MII-tt-DTT加入肿瘤细胞的培养液中，加入MII-tt-DTT的终浓度为0.0975－25μM。
本发明还提供了一种诱导体外肿瘤细胞凋亡和铁死亡的方法，其将MII-tt-DTT加入肿瘤细胞的培养液中，加入MII-tt-DTT的终浓度为0.0975－25μM。
本发明所述肿瘤细胞可以是结直肠癌HCT116细胞、结直肠癌SW480细胞、结直肠癌DLD-1细胞。
本发明还提供了一种抗结直肠癌药物，该抗结直肠癌药物的活性成分为MII-tt-DTT。
MII-tt-DTT合成路线如下：
和现有技术相比，本发明的有益效果。
本发明提供了MII-tt-DTT在制备抗肿瘤药物中的应用。MTT结果显示：MII-tt-DTT能显著抑制结直肠肿瘤细胞的增殖，并且能与线粒体共定位。Annexin V and PI双染凋亡检测结果显示：MII-tt-DTT能诱导细胞凋亡。ROS和Fe2+含量检测结果和Western Blot检测TFR1结果显示：MII-tt-DTT能诱导细胞铁死亡。本发明的小分子化合物MII-tt-DTT作为新的抗结直肠肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑制肿瘤效果显著，将为治疗和治愈结直肠肿瘤提供新的途径和手段。
附图说明
图1：MII-tt-DTT结构鉴定1H NMR(400MHz,DMSO-d6)图谱数据；
图2：MII-tt-DTT结构鉴定13C NMR(100MHz,DMSO-d6))图谱数据；
图3：MII-tt-DTT结构鉴定HRMS(MALDI-DHB)图谱数据；
图4：A:MII-tt-DTT给药后HCT116、SW480、DLD-1细胞形态结果；B-D：MTT结果；E：平板克隆结果；
图5：A：荷瘤模型试验-瘤体积；B：荷瘤模型试验-荷瘤重；C：毒性试验-NS组、5-Fu组、MII-tt-DTT组裸鼠图片；D：毒性试验-脏器HE染色结果；E：荷瘤模型试验-荷瘤HE染色结果；F-G：毒性试验-肝损伤测定；H-I：毒性试验-肾损伤测定；J：毒性试验-裸鼠体重；K-O：毒性试验-脏器系数；
图6：MII-tt-DTT与NAC、VE、Z-VAD-FMK、Necrostatin-1、Apoptosis联合作用对细胞增殖的影响；
图7：A：MII-tt-DTT诱导细胞凋亡的流式结果；B-D：流式量化结果；E：WesternBlot检测MII-tt-DTT对BaX、Bcl-2、Cytc、cleaved-Cas 3表达影响的结果；F-Q：WesternBlot量化结果；
图8：A：线粒体共定位结果；B-D：ATP检测结果；
图9：JC-1染色结果；
图10：A：ROS荧光检测结果；B-D：ROS流式细胞仪检测结果；E-G：MII-tt-DTT与NAC联合作用后ROS流式细胞仪检测结果；
图11：A-C：GSH检测结果；D-F：GSSG检测结果；G-I：Cys检测结果；J：Western Blot检测MII-tt-DTT对XCT、GPX4表达影响的结果；K-P：Western Blot量化结果；
图12：A-C：Fe2+/Fe3+检测结果；D-F：MII-tt-DTT与DFO联合作用后ROS流式细胞仪检测结果；G-I：MII-tt-DTT与DFO联合作用后Fe2+/Fe3+流式细胞仪检测结果；J-L：MII-tt-DTT与DFO联合作用后MTT检测结果；M：Western Blot检测MII-tt-DTT对细胞NCOA4、TRF1表达影响的结果；N-S：Western Blot量化结果；图中，*，P<0.05；**，P<0.015；***，P<0.001；
具体实施方式
为了使本发明的技术目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作出进一步的说明，但所述实施旨在解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实验方法：
化合物准备
具体的，取化合物1(91.3mg，0.41mmol，1.0eq)，化合物2(122.4mg，0.41mmol，1.0eq)，乙酸钾(7.7mg，0.59mmol，1.4eq)于50mL Schlenk瓶中，加入15mL乙醇，氩气保护下100℃反应12h，停止反应冷却至室温，旋蒸除去溶剂得粗品，经柱层析(乙酸乙酯:石油醚＝60:1)，得化合物MII-tt-DTT：85.1mg，产率：41％。
MII-tt-DTT结构鉴定1HNMR、13CNMR、HRMS见图1-3。
MII-tt-DTT溶于DMSO中，配置成100mM母液备用。
应用实例1、MTT、平板克隆法测定MII-tt-DTT对结直肠癌细胞增殖的影响。
HCT 116细胞(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)按3×103/孔接种至96孔板，应用5％CO2、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM完全培养基37℃培养12h后，加入不同浓度(分别为25μM、12.5μM、6.25μM、3.12μM、1.56μM、0.78μM、0.39μM、0.195μM、0.0975μM)的MII-tt-DTT，每个浓度设定5个复孔，继续培养48h，弃培养液，MTT试剂测定细胞存活率。
测定方法为：无血清培养基洗涤细胞一次，15μL/孔加入预先配制好的MTT反应液，继续培养4h，吸弃上清，100μL/孔加入DMSO溶解还原产物，摇床震荡10min，490nm波长处读取吸光度值，计算细胞存活率，以测定MII-tt-DTT干预孔吸光度值/对照孔吸光度值作为细胞存活率的数值，并以此计算MII-tt-DTT对HCT116细胞的IC50值。
IC50指细胞生长被抑制一半时抑制剂的浓度。这里即为HCT 116细胞数量为对照组一半时MII-tt-DTT的浓度。
结果：MII-tt-DTT对HCT116细胞的IC50值为1.957μM(见图4B)。
同样的方法测定MII-tt-DTT对结直肠癌SW 480细胞、结直肠癌DLD-1细胞的抑制作用，结果其对SW480细胞、DLD-1细胞的IC50值为3.249μM、3.274μM。(见图4C-D)。
取HCT116细胞以500个/孔接种于6孔细胞培养板。待细胞贴壁后梯度药物处理，37℃、CO2培养箱培养48h后更换新鲜DMEM完全培养基继续培养。待空白组细胞长成一定数量肉眼可见的克隆斑后进行结晶紫染色，并拍照。
结果：MII-tt-DTT对HCT116细胞的增殖有显著抑制作用(见图4B)。
同样的方法测定MII-tt-DTT对结直肠癌SW480细胞、结直肠癌DLD-1细胞增殖的抑制作用，结果其对SW480细胞、DLD-1细胞的增殖有显著抑制作用(见图4C-D)。
应用实例2、MII-tt-DTT在体内对结直肠癌皮下荷瘤的影响及荷瘤模型裸鼠的毒性检测
收集处于对数生长期的HCT116细胞，重悬于生理盐水中，制成密度为1×107个/mL的细胞悬液。对裸鼠注射部位的皮肤进行消毒处理后，将细胞悬液经皮下注射接于种裸鼠右腋下皮下组织中。接种7天后分别对空白对照组、5-氟尿嘧啶组和实验组给予生理盐水、3.48mg/mL 5-氟尿嘧啶、1mg/kg MII-tt-DTT药物治疗。每3天治疗一次，持续30天。
30天后三组裸鼠麻醉处理后，眼球取血，切取心脏、肝脏、脾脏、肺、肾和瘤，并对肿瘤及脏器进行称重记录。眼球血经处理后用动物专用分析仪检测以下指标：淋巴细胞(LYM)、白细胞(WBC)、血红蛋白(HGB)及红细胞(RBC)等指标。根据试剂盒说明书检测肝脏及肾脏指标：谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CR)。脏器进行组织形态学检测。
结果：MII-tt-DTT对小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾没有实质性损伤，并能明显抑制肿瘤的生长，而且小鼠较对照组没有明显减重(见图5)。
应用实例3、小分子抑制剂与MII-tt-DTT联合处理对结直肠癌细胞增殖的影响
HCT 116细胞按3×103/孔接种至96孔板，应用5％CO2、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM完全培养基37℃培养12h。配置含NAC(1mM)的培养基，并用此培养基将MII-tt-DTT稀释成不同浓度(分别为25μM、12.5μM、6.25μM、3.12μM、1.56μM、0.78μM、0.39μM、0.195μM、0.0975μM)后对细胞给药，每个浓度设定5个复孔，继续培养48h，弃培养液，MTT试剂测定细胞存活率。
同样的方法测定MII-tt-DTT与VE、Z-VAD-FMK、Necrostatin-1、Apoptosis联合作用对结直肠癌SW480细胞、结直肠癌DLD-1细胞增殖的抑制作用，结果其对SW480细胞、DLD-1细胞的增殖有显著抑制作用(见图6)。
应用实例4、MII-tt-DTT诱导结直肠癌细胞凋亡
取HCT116细胞1×104接种于6孔细胞培养板。梯度药物处理后，37℃、CO2培养箱DMEM完全培养基培养48h。无EDTA的胰蛋白酶消化并收集细胞于离心管中，PBS洗涤3次，分别加入5μL(2.5μg/ml)的Annexin-V-FITC和5μL(50μg/ml)PI(碘化丙啶)，染色15min后用流式细胞仪测定，用FlowJo 7.6.1分析细胞凋亡水平。
Annexin-V-FITC和PI的染色结果显示：MII-tt-DTT诱导HCT116细胞凋亡(见图7A-D)。
同样的方法测定MII-tt-DTT对结直肠癌SW480细胞、结直肠癌DLD-1细胞凋亡作用的影响，结果显示：MII-tt-DTT诱导SW480细胞、DLD-1细胞凋亡(见图7A-D)。
取HCT116细胞1×106接种于60mm细胞培养皿。梯度药物处理后，37℃、CO2培养箱DMEM完全培养基培养48h后提取蛋白。Western Blot检测BaX、Bcl-2、Cytc、cleaved-Cas 3的表达。
Western Blot检测结果显示：MII-tt-DTT诱导HCT116细胞内BaX、Cytc、cleaved-Cas 3的表达量升高，Bcl-2表达量降低(见图7E-Q)。
同样的方法测定MII-tt-DTT对结直肠癌SW480细胞、结直肠癌DLD-1细胞BaX、Bcl-2、Cytc、cleaved-Cas 3表达的影响，结果显示：MII-tt-DTT诱导SW480细胞、DLD-1细胞凋亡(见图7E-Q)。
应用实例5、MII-tt-DTT定位于结直肠癌细胞线粒体并诱导线粒体损伤
取HCT116细胞1×103接种于玻底细胞培养皿，待细胞贴壁后对细胞给药，继续培养48h后，弃去培养基，将提前温育好的Mito-Green染色液(Mito-Green：完全培养基＝1:3000)加入培养皿并置于37℃孵育40min，后弃去染色液，Nacl清洗两次后加入一定量的新鲜培养基，用激光共聚焦显微镜观察荧光并进行拍照。全程注意避光处理。
结果：MII-tt-DTT能定位于HCT116细胞的线粒体中(见图8A)。
同样的方法测定MII-tt-DTT对结直肠癌SW480细胞、结直肠癌DLD-1细胞线粒体共定位的影响，结果显示MII-tt-DTT能定位于SW480、DLD-1细胞的线粒体中(见图8A)。
取HCT116细胞1×104接种于6孔细胞培养板。梯度药物处理后，37℃、CO2培养箱DMEM完全培养基培养48h。无EDTA的胰蛋白酶消化并收集细胞于离心管中，加入200μL裂解液于冰上裂解。裂解后4℃、12000g离心5min，取上清待测。按照ATP检测试剂:ATP检测试剂稀释液＝1:9的比例配制当量的ATP检测工作液，以每孔100μL加入到96孔板的检测孔中，室温放置5min，以消耗本底ATP。5min后每孔加入20μL样品，迅速用枪混匀，间隔2s后用化学发光仪测定RLU值。全程注意避光处理。
结果：MII-tt-DTT诱导HCT116细胞线粒体内ATP含量升高(见图8B)。
同样的方法测定MII-tt-DTT对结直肠癌SW480细胞、结直肠癌DLD-1细胞线粒体ATP含量的影响，结果显示MII-tt-DTT能诱导SW480、DLD-1细胞线粒体内ATP含量升高(见图8C-D)。
取HCT116细胞1×103接种于24孔细胞培养皿，待细胞贴壁后对细胞梯度给药，继续培养48h后，弃去培养基，PBS洗涤一次，每孔加入500μL新鲜完全培养基，后加入500μL提前配置好的JC-1染色工作液(按照每50μL JC-1(200X)加入8mL超纯水的比例稀释JC-1。然后再加入2mL JC-1染色缓冲液(5X)，混匀后即为JC-1染色工作液)，充分混匀。37℃、CO2培养箱孵育20min。在孵育期间，按照每1mL JC-1染色缓冲液(5X)加入4mL超纯水的比例配置适量JC-1染色缓冲液(1X),并放置于冰浴。孵育结束后，吸除上清，用JC-1染色缓冲液(1X)洗涤2次，后加入500μL新鲜完全培养基，于荧光显微镜下观察。
荧光显微镜观察结果显示：MII-tt-DTT诱导HCT116细胞线粒体膜电位降低(见图9)。
同样的方法测定MII-tt-DTT对结直肠癌SW480细胞、结直肠癌DLD-1细胞线粒体膜电位的影响，结果显示MII-tt-DTT能诱导SW480、DLD-1细胞线粒体膜电位降低(见图9)。
取HCT116细胞1×104接种于6孔细胞培养板。梯度药物处理后，37℃、CO2培养箱DMEM完全培养基培养48h。(1)流式细胞仪检测：无EDTA的胰蛋白酶消化并收集细胞于离心管中，用无血清培养基稀释DCFH-DA至终浓度为10μmol/L，重悬细胞，37℃、CO2培养箱内孵育20min，每隔3～5min颠倒混匀一次，后用流式细胞仪测定。(2)荧光显微镜检测：去除细胞培养液，加入1mL稀释后的DCFH-DA，37℃、CO2培养箱内孵育20min后，使用488nm激发波长，525nm发射波长检测荧光强弱。
流式检测和荧光检测结果显示：MII-tt-DTT诱导HCT116细胞内ROS含量升高(见图10A-B)。
同样的方法测定MII-tt-DTT对结直肠癌SW480细胞、结直肠癌DLD-1细胞ROS产生含量的影响，结果显示MII-tt-DTT能诱导SW480、DLD-1细胞内ROS含量升高(见图10A-D)。
应用实例6、MII-tt-DTT诱导结直肠癌细胞铁死亡
1、GPX4途径
取HCT116细胞1×104接种于6孔细胞培养板。梯度药物处理后，37℃、CO2培养箱DMEM完全培养基培养48h。无EDTA的胰蛋白酶消化并收集细胞于离心管中，PBS洗涤2次，加入3倍细胞沉淀体积的试剂一重悬细胞，反复冻融2-3次，4℃、8000g、离心10min，收集上清4℃待测。在样品管中依次加入20μL样品，140μL试剂二，40μL试剂三，混匀后静置2min检测412nm处吸光度(空白孔A1，样品孔A2)，△A＝A2-A1。所用试剂盒为索莱宝GSH含量检测试剂盒。
OD值测定结果显示：MII-tt-DTT诱导HCT116细胞GSH含量升高(见图11A)。
同样的方法测定MII-tt-DTT对结直肠癌SW480细胞、结直肠癌DLD-1细胞GSH产生含量的影响，结果显示MII-tt-DTT能诱导SW480、DLD-1细胞内GSH含量升高(见图11B-C)。
取HCT116细胞1×104接种于6孔细胞培养板。梯度药物处理后，37℃、CO2培养箱DMEM完全培养基培养48h。无EDTA的胰蛋白酶消化并收集细胞于离心管中，PBS洗涤2次，加入3倍细胞沉淀体积的试剂一重悬细胞，反复冻融2-3次，4℃、8000g离心10min，收集上清4℃待测。在样品管中加入10μL样品和0.2μL试剂二，混匀后37℃孵育30min。孵育完成后依次加入70μL试剂三，10μL试剂四，10μL试剂五，1μL试剂六(加入试剂六即开始计时)，迅速混匀后，检测412nm处30s和150s吸光度A1和A2，计算△A＝A2-A1。所用试剂盒为索莱宝GSSG含量检测试剂盒。
OD值测定结果显示：MII-tt-DTT诱导HCT116细胞GSSG含量升高(见图11D)。
同样的方法测定MII-tt-DTT对结直肠癌SW480细胞、结直肠癌DLD-1细胞GSH产生含量的影响，结果显示MII-tt-DTT能诱导SW480、DLD-1细胞内GSSG含量升高(见图11E-F)。
取HCT116细胞1×104接种于6孔细胞培养板。梯度药物处理后，37℃、CO2培养箱DMEM完全培养基培养48h。无EDTA的胰蛋白酶消化并收集细胞于离心管中，按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)＝500～1000:1的比例加入试剂一，超声波破碎细胞(冰浴，200W，超声3s，间隔10s，重复30次)，4℃、8000g离心10min，收集上清4℃待测。在样品管中依次加入10μL样品，80μL试剂二，10μL试剂三，混匀后室温静置15min检测600nm处吸光度值。所用试剂盒为南京建成半胱氨酸(Cys)检测试剂盒。
OD值测定结果显示：MII-tt-DTT诱导HCT116细胞Cys含量降低(见图11G)。
同样的方法测定MII-tt-DTT对结直肠癌SW480细胞、结直肠癌DLD-1细胞Cys产生含量的影响，结果显示MII-tt-DTT能诱导SW480、DLD-1细胞内Cys含量降低(见图11H-I)。
取HCT116细胞1×106接种于60mm细胞培养皿。梯度药物处理后，37℃、CO2培养箱DMEM完全培养基培养48h后提取蛋白。Western Blot检测xCT、GPX4的表达。
Western Blot检测结果显示：MII-tt-DTT诱导HCT116细胞内xCT、GPX4的表达量降低(见图11J)。
同样的方法测定MII-tt-DTT对结直肠癌SW480细胞、结直肠癌DLD-1细胞xCT、GPX4表达的影响，结果显示：MII-tt-DTT诱导SW480细胞、DLD-1细胞xCT、GPX4的表达量降低(见图11J)。
总结：MII-tt-DTT通过GPX4介导HCT116细胞内GSH、GSSG含量升高，Cys含量降低，进一步诱导细胞铁死亡。
同样的方法测定MII-tt-DTT对结直肠癌SW480细胞、结直肠癌DLD-1细胞铁死亡的影响，结果显示：MII-tt-DTT诱导SW480细胞、DLD-1细胞发生铁死亡(见图11A-P)。
2、TFR1途径
取HCT116细胞1×104接种于6孔细胞培养板。梯度药物处理后，37℃、CO2培养箱DMEM完全培养基培养48h。无EDTA的胰蛋白酶消化并收集细胞于离心管中，PBS洗涤1次，4℃，3500rpm、10min离心，取上清待测。每样本加入150μL铁显色剂，混匀后沸水浴5min，流水冷却，3500rpm/min，离心10min后取上清，520nm处测定OD值。
OD值测定结果显示：MII-tt-DTT诱导HCT116细胞Fe2+/Fe3+含量升高(见图12A)。
同样的方法测定MII-tt-DTT对结直肠癌SW480细胞、结直肠癌DLD-1细胞Fe2+/Fe3+含量的影响，结果显示MII-tt-DTT诱导SW480、DLD-1细胞Fe2+/Fe3+含量升高(见图12B-C)。
取HCT116细胞1×106接种于60mm细胞培养皿。梯度药物处理后，37℃、CO2培养箱DMEM完全培养基培养48h后提取蛋白。Western Blot检测转铁蛋白受体TFR1、NCOA4的表达。
Western Blot检测结果显示：MII-tt-DTT诱导HCT116细胞内TFR1、NCOA4的表达量升高(见图12M)。
同样的方法测定MII-tt-DTT对结直肠癌SW480细胞、结直肠癌DLD-1细胞TFR1、NCOA4表达的影响，结果显示：MII-tt-DTT诱导SW480细胞、DLD-1细胞TFR1、NCOA4的表达量升高(见图12M)。
加入铁螯合剂DFO后，根据上述方法再次测定HCT116、SW480、DLD-1细胞内Fe2+/Fe3 +含量、ROS产生含量及细胞活力。OD值测定结果显示：MII-tt-DTT和DFO联合作用较MII-tt-DTT单独作用相比，HCT116、SW480、DLD-1细胞Fe2+/Fe3+含量和ROS含量降低，细胞活力升高。(见图12D-F)
总结：MII-tt-DTT通过TFR1介导HCT116细胞内Fe2+/Fe3+含量和ROS含量升高，进一步诱导细胞铁死亡。
同样的方法测定MII-tt-DTT对结直肠癌SW480细胞、结直肠癌DLD-1细胞铁死亡的影响，结果显示：MII-tt-DTT诱导SW480细胞、DLD-1细胞发生铁死亡(见图12A-M)。
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