阅读说明：本技术 包含作为有效成分的靛玉红衍生物的药物组合物 (Pharmaceutical composition comprising the derivatives of indirubin as effective component ) 是由 崔康叶 韩均和 黄政涵 崔涩和 吴昌墨 于 2018-04-10 设计创作，主要内容包括：根据本发明,用于促进长骨生长的组合物促进软骨细胞的增殖和成骨细胞的分化,并且具有同时提高长骨长度和厚度(骨密度)的效果,并且因此具有可广泛针对多个年龄组开具处方的优点,从而可用作促进长骨长度和厚度生长的药物组合物。与常规的基于激素的治疗剂不同,根据本发明的靛玉红衍生物通过经口施用具有优异的预防或治疗效果,并且具有优异的有竞争力的价格。另外,与常规治疗剂不同,本发明的用于预防或治疗骨疾病的药物组合物是稳定的化合物,已知其对人体基本上无细胞毒性,并且是尚未确定有副作用的材料,并且其对骨疾病和成骨不全具有优异的治疗效果。(According to the present invention, for promoting the composition of long bone uptake to promote the proliferation of cartilage cell and the differentiation of osteoblast, and have the effect of while improving long bone length and thickness (bone density), and therefore has the advantages that multiple age group prescriptions can be directed to extensively, thus can be used as the pharmaceutical composition for promoting long bone length and grown in thickness.Different from the conventional therapeutic agent based on hormone, derivatives of indirubin according to the present invention has excellent prevention or therapeutic effect by oral administration, and has excellent competitive price.In addition, different from conventional therapy agent, of the invention is stable compound for preventing or treating the pharmaceutical composition of bone disease, it is known that it is to human body substantially no cytotoxicity, it and is the not yet determining material for having side effect, and it has excellent therapeutic effect to bone disease and osteogenesis imperfecta.)

包含作为有效成分的靛玉红衍生物的药物组合物

技术领域

本发明涉及用于促进骨长度生长和/或骨厚度提高的包含靛玉红衍生物作为活性成分的组合物，其用于预防或治疗骨长度生长障碍和/或与骨密度相关的疾病，所述组合物包含靛玉红衍生物作为活性成分。

背景技术

骨是构成人骨骼的最坚硬的组织并具有大量骨基质(bone matrix)，其存在于全身，并且发挥关键作用。从婴儿期到成年期，构成手臂和腿的长骨(long bone)的长度生长，并决定我们身体的高度。该过程是由骨生长板中的软骨细胞(chondrocyte)引起的，并且因为生长板是有限开放的所以其在青少年时期生长非常重要。在整个***，生长板逐渐闭合，并且随着成年，不再发生骨生长，但是骨仍然通过持续的代谢过程维持骨厚度或骨密度来支撑身体。在这个过程中，骨分别由成骨细胞(osteoblast)和破骨细胞(osteoclast)形成和分解，并且这两种细胞之间的平衡对于维持骨密度和预防骨折非常重要。

通过这种方式，骨参与了我们身体的整体发育，在结构上维持了身体的形态，保护了内脏器官，在生理上作为例如钙和磷等矿物质的储备来维持其血液水平并提供新的血液。因此，骨发育异常或代谢异常可导致多种疾病，例如性早熟、侏儒症、骨质疏松症、佝偻病、骨软化症、骨髓炎、上皮增生和Bezett病。必需了解的是，骨形成过程分为：1)由软骨细胞引起的长度提高，和2)通过平衡成骨细胞和破骨细胞来提高骨密度。这两个过程是不同的，并且长度的生长决定了人的高度，而骨密度的提高与许多代谢性骨疾病有关。

目前，这些用于骨疾病的治疗大多数限于激素药物。与骨长度相关的高度生长促进剂是临床上唯一使用的生长激素，并且与骨密度相关的骨质疏松症的治疗是唯一使用的甲状旁腺激素。然而，生长激素注射剂不适合于激素分泌正常的儿童，更是具有例如甲状腺功能障碍和增生的不良反应，而且昂贵且不易使用。另外，临床上可获得的用于骨质疏松症的治疗剂是唯一获得FDA批准的重组甲状旁腺激素药物及其类似物，其也限于患有严重脊柱骨质疏松症的患者。此外，由于担心高钙血症的发生，甲状旁腺激素具有2年的最大治疗期的限制，因为其对身体内钙的代谢有很大影响。

因此，需要开发新的治疗来克服现有骨疾病治疗的缺点，并且因此，还需要开发基于小分子化合物的药物。由于常规的激素制剂或合成肽制剂不能经口服用，因此与小分子化合物相比，其通过注射施用很麻烦并且昂贵。由于可应用于骨相关疾病和异常的小分子化合物可经口施用并具有成本竞争力，因此其可成为治疗市场上有希望的新药物。

发明内容

技术问题

已经做出了本发明以解决上述问题。本发明的目的是提供显示出优异的骨长度生长促进作用并且包含靛玉红衍生物作为活性成分同时在体内几乎没有毒性的组合物。

另外，本发明的另一个目的是提供显示出优异的骨疾病预防或治疗作用并且包括靛玉红衍生物作为活性成分同时在体内几乎没有毒性的用于预防或治疗骨疾病的药物组合物。

技术方案

为了实现上述目的，本发明提供了用于促进骨长度生长和/或骨厚度提高的组合物，其包含由下式(1)或(2)表示的靛玉红衍生物作为活性成分。

式1

[式2]

组合物的特征在于通过经由成骨细胞中β-联蛋白(catenin)的稳定和核定位来激活Wnt/β-联蛋白信号传导来促进软骨细胞的增殖、成骨细胞的分化。

骨长度是长骨的长度，并且骨厚度是骨密度。

为了实现上述另一个目的，本发明提供了用于预防或治疗骨长度生长障碍和/或骨疾病的药物组合物，其包含由下式(1)或(2)表示的靛玉红衍生物作为活性成分。

式1

式2

骨长度生长障碍是选自侏儒症和性早熟中的任一种或更多种，骨疾病是选自骨质疏松症、佝偻病、骨软化症、骨髓炎、上皮增生和Bezzet病中的任一种或更多种。本发明提供了用于预防或改善骨长度生长障碍和/或骨疾病的药物组合物，其包含由下式(1)或(2)表示的靛玉红衍生物作为活性成分，以实现上述另一个目的。

式1

[式2]

发明的有利效果

根据本发明的用于促进骨长度生长的组合物对软骨细胞的增殖和成骨细胞的分化均具有促进作用，从而提高了骨长度和骨厚度(骨密度)二者。因此，由于其具有针对多个年龄组的广泛处方的优点，因此其可有效地用作可促进骨长度和骨厚度生长的药物组合物。

与常规的基于激素的治疗剂不同，根据本发明的靛玉红衍生物通过经口施用具有优异的预防或治疗作用，并且在价格上具有竞争力。

另外，与常规的治疗剂不同，本发明的用于预防或治疗骨疾病的药物组合物是稳定的化合物，发现该化合物对人体几乎没有毒性，并且没有确定的不良作用并且具有优异的治疗效力。

附图说明

图1是当离体培养并用实施例1、2和比较例1、8、9、10至12中的靛玉红衍生物处理时长骨生长的照片。

图2是显示在图1中测量的长骨的长度变化的图和表。处理的靛玉红衍生物分别等于0.5μM，在培养基中处理6天。

图3A是当离体培养并用比较例6中的6-溴代靛玉红-3’-肟处理时长骨生长的照片(左)和定量显示这种生长的图(右)。

图3B是根据不同的溴代靛玉红-3’-肟浓度对软骨细胞进行MTT分析以验证用比较例6中的6-溴代靛玉红-3’-肟处理的长骨长度的减少是否与对软骨细胞的生存力的影响有关的图。

图4是显示用实施例1中的5，6-二氯代靛玉红-3’-甲肟、实施例2的5-甲氧基靛玉红-3’-肟、比较例1至5和12中的靛玉红衍生物处理的细胞中ALP活性的图和表。

图5是对从MC3T3-E1细胞(成骨细胞)获得的蛋白质提取物进行western印迹分析的结果，以检查实施例1中的5，6-二氯代靛玉红-3’-甲肟(A3051)和实施例2中的5-甲氧基靛玉红-3’-肟(A3334)对β-联蛋白稳定的作用。

图6是通过免疫细胞化学确定β-联蛋白在用实施例1中的5，6-二氯代靛玉红-3’-甲肟(A3051)和实施例2中的5-甲氧基靛玉红-3’-肟(A3334)处理的ATDC5细胞中的表达和定位的照片。

实施本发明的最佳方式

在下文中，将对本发明的多个方面和实施例进行更详细描述。

本发明的一个方面涉及用于促进骨生长的药物组合物，其包含由式1或式2表示的靛玉红衍生物作为活性成分。

式1

[式2]

靛玉红是一种靛蓝化合物，呈红色，化学结构与靛蓝非常相似。通常，在使用蓼蓝(polygonum tinctorium)和菘蓝(isatis tinctoria)生产靛蓝(蓝色染料)的过程中会产生少量的副产品靛玉红。当归龙荟丸(Danggui Longhui Wan)是中药处方，其由11种已用于治疗慢性白血病的药物组成。其中，发现靛玉红是有效的药物，并且最近，已知其是作为用于治疗慢性白血病和神经退行性疾病例如阿尔茨海默病(Bri J.Haemato，130：..681-690，2005Nature Cell Biol，1：.60-67，1999)的细胞周期抑制剂的具有巨大潜力的药物。靛玉红作为前体可形成多种衍生物，例如靛玉红肟衍生物、靛玉红腙衍生物、靛玉红N-乙酰基衍生物和靛玉红胺衍生物。

在本发明中，靛玉红衍生物中作为有效成分的5，6-二氯代靛玉红-3’-甲肟(式1)和5-甲氧基靛玉红-3’-肟(式2)使可通过施用常规激素制剂产生的副作用最小化，其对成骨细胞和软骨细胞无毒性，具有相对于对照组将长骨长度提高至约两倍(180％)的显著效果，并且通过促进细胞的增殖和成骨细胞的分化提高了骨密度，即骨厚度。

另外，根据本发明，在离体培养系统中，与SB415286(Sigma aldrich)相比，由式1或式2表示的靛玉红衍生物使长骨的长度提高了大于37又3/4倍。

因此，与其他药物不同，根据本发明的由式(1)表示的5-甲氧基靛玉红-3’-肟可应用于不同年龄的患者，因为其可能对骨生长、骨厚度或二者具有效力，并且这些作用比其他靛玉红衍生物的作用更显著提高大于30％。

具体地，如以下的实验例中所述，5，6-二氯代靛玉红3’-甲肟或5-甲氧基靛玉红-3’-肟促进成软骨细胞的增殖、成骨细胞分化和成骨细胞中β-联蛋白的稳定。

具体地，本发明中的式1或式2的靛玉红衍生物(5，6-二氯代靛玉红-3’-甲肟或5-甲氧基靛玉红-3’-肟)作为新的小分子化合物促进了离体培养系统中的胫骨(tibia)长度和ALP活性，其是通过成骨细胞分化系统提高骨密度的重要标志。另外，确定了对于软骨细胞和成骨细胞中的骨形成很重要的β-联蛋白(Wnt/β-联蛋白信号传导系统的关键组分)在用这些药物处理之后被稳定、活化和核定位。

因此，本研究的组合物可用作药物组合物，其针对由以下组成的骨疾病显示出优异的效力：骨质疏松症、肌病佝偻病、骨软化症、骨髓炎、上皮增生和Bezzet病，以及骨长度生长障碍(例如身材矮小、侏儒、呆小病和性早熟)。

当将由式1表示的靛玉红衍生物(5，6-二氯代靛玉红-3’-甲肟)和由式2表示的靛玉红衍生物(5-甲氧基靛玉红-3’-肟)经口施用于小鼠用于毒性研究时，其被认为是安全的物质，因为其50％致死剂量(LD 50)为至少1,000mg/kg。

骨长度意指长骨的长度，并且骨厚度意指骨密度。

本发明中的通式(1)或通式(2)的靛玉红衍生物是可长期使用的组合物，因为其几乎没有毒性和不良作用。

相对于组合物的总重量，本发明的组合物优选包含0.1至50重量份的由式1或式2表示的靛玉红衍生物，但不限于这些。

本发明的另一个方面涉及包含由式1或式2表示的靛玉红衍生物作为活性成分的用于预防或治疗骨长度生长障碍和骨疾病的药物组合物。

式1

[式2]

在式(1)或(2)的靛玉红衍生物的描述中，将省略与上述描述重合的描述。

本发明中使用的术语“预防或治疗骨疾病”包括通过施用根据本发明的组合物实现的预防以及完全或部分治疗骨疾病。其还包括减少或改善骨疾病症状、减轻疼痛、减少骨疾病的发生率以及提高治疗结果的患者中的任何变化。

骨长度生长障碍可以是选自侏儒症和性早熟中的任一种或更多种。

骨疾病可以是选自骨质疏松症病、佝偻病、骨软化症、骨髓炎、上皮增生和Bezzet病中的任一种或更多种。

本发明的药物组合物是用于预防或治疗骨长度生长障碍和/或骨疾病的药物组合物。由式1表示的5，6-二氯代靛玉红-3’-甲肟和由式2表示的5-甲氧基靛玉红-3’-肟通过激活成骨细胞中β-联蛋白的稳定和核定位来促进软骨细胞的增殖和成骨细胞的分化，并且针对骨长度生长障碍或骨疾病或二者具有优异的预防或治疗作用。

换言之，其可应用于多个年龄的患者，因为其可能对骨长度生长或骨厚度提高或二者都有影响，并且已确定与其他靛玉红衍生物相比，这些作用在显著的数值范围内具有优异的作用。

本发明的药物组合物还可包含通常用于制备药物组合物的合适的载体、赋形剂和稀释剂。本发明的式1或式2的靛玉红衍生物的药物剂型也可以以其可药用盐的形式使用。

本发明的式(1)或式(2)的靛玉红衍生物是可长期使用的组合物，因为其几乎没有毒性和副作用。相对于组合物的总重量，本发明的药物组合物优选包含0.1至50重量份的由式1或式2表示的靛玉红衍生物，但不限于这些。

本发明的药物组合物可根据常规方法分别以经口剂型、外用制剂、栓剂和无菌注射溶液，例如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂和气雾剂的形式来使用。可包含在含有式1的靛玉红衍生物的组合物中的载体、赋形剂和稀释剂可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖、淀粉、***胶橡胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。当配制时，使用稀释剂或赋形剂，例如常用的成层剂、增量剂、黏合剂、湿润剂、崩解剂和表面活性剂。用于经口施用固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，并且这样的固体制剂包括至少一种赋形剂，例如淀粉、碳酸钙或上述式1或式2的靛玉红衍生物。其通过混合(碳酸钙)、蔗糖或乳糖、明胶等来制备。除了简单的赋形剂之外，还使用润滑剂，例如硬脂酸镁和滑石粉。用于经口使用的液体制剂包括混悬剂、溶液剂、乳剂和糖浆剂，并且除了通常使用的简单稀释剂液体石蜡之外，还可包括多种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、香料和防腐剂。用于胃肠外施用的制剂包括无菌水溶液、非水性溶剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂和栓剂。作为非水性溶剂或混悬剂，可使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)、可注射酯(例如油酸乙酯)等。作为栓剂的基质，可使用Witepsol、Macrogol、吐温61、可可脂、月桂脂、甘油明胶等。

本发明的药物组合物的优选剂量根据患者的状况和重量、疾病的程度、药物的形式、施用途径和持续时间而变化，并且可由相关技术领域的技术人员适当地选择。然而，为了获得期望的效果，本发明的组合物以每天0.0001至2000mg/kg，优选以每天0.001至1000mg/kg施用。式1或式2的靛玉红衍生物的浓度为1nM至1M、或1μM至1mM、或0.1mM至0.2mM、或0.05μM至5μM，但不限于此。药物可每天施用一次或数次。上述剂量在任何方面均不限制本发明的范围。

本发明的药物组合物可通过多种途径施用于哺乳动物，例如大鼠、小鼠、家畜、人。所有的施用方法都可预期，例如通过经口、经直肠或静脉内、肌内、皮下、子宫内、硬膜或脑室内(intracerebroventricular)注射。

本发明的另一个方面涉及防腐剂或用于预防或改善骨长度生长障碍和/或骨疾病的改良的食品组合物，该食品组合物包含由式1或式2表示的靛玉红衍生物作为活性成分。

本发明中使用的术语“改善”意指降低与待治疗病症相关的参数水平，例如症状程度的任何动作。

本发明的食品组合物可以以多种方式，例如用于治疗骨长度生长障碍或骨疾病或二者的药物、食品和饮料使用。可添加本发明化合物的食品包括，例如，多种食品、饮料、胶、茶、维生素复合物、保健补充剂等，并且可以以粉末、颗粒、片剂、胶囊或饮料的形式使用。

本发明的食品或饮料中化合物的量通常以按总食品重量计0.01至15％添加至食品组合物中，并且健康饮料组合物基于100ml为0.02至5g，优选基于100ml为0.3至1g。

如果将本发明的食品组合物制成饮料，则必须为所示比例，并且对液体组合物(例如普通饮料)没有特别限制，并且可包含数种矫味剂或天然碳水化合物作为附加成分。上述天然碳水化合物的实例是单糖(例如葡萄糖、果糖等)、二糖(例如麦芽糖、蔗糖等)和多糖(例如糊精和环糊精，以及常见的糖，例如木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇)。作为除了上述矫味剂以外的矫味剂，可有利地使用天然矫味剂(例如牛磺酸、甜菊提取物，例如基于蒸汽的A和甘草甜素，以及合成矫味剂，例如萨卡林、阿斯巴甜)。上述天然碳水化合物的比例，相对于100ml本发明的组合物，通常为约1至20g，优选约5至12g。

除了上述之外，本发明的组合物包括多种营养素、维生素、矿物质(电解性质)、例如合成香料和天然香料的矫味剂、着色剂和中和剂(例如奶酪、巧克力)、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、PH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。

本发明的组合物还可包含果肉以生产天然果汁、果汁饮料和蔬菜饮料。这些组分可单独使用或组合使用。这样的添加剂的比例并不非常关键，但相对于根据本发明的组合物的100重量份，通常选择为0至约0.1重量份。

具体实施方式

下面将通过实施例对本发明进行更详细解释，但是不能将其解释为对本发明的范围和内容减少或限制。另外，显然本发明可由通常的技术人员容易地进行，其结果没有具体给出，只要其基于本发明的启动，包括任何以下实践，并且这些修改和修改在专利权利要求的范围内。

另外，以下给出的实验结果仅是上述实施例和比较例的实验结果的代表，下面将在相应章节中对未明确阐述的本发明的多个实施方案的各个效果进行更详细描述。

实施例1.合成5，6-二氯代靛玉红-3’-甲肟(A3051)

①合成中间体5’，6’-二氯代-[2，3’-联二氢亚吲哚基]-2’3-二酮

将5，6-二氯异丁烷(500mg，2.32mmol)添加到250mL圆底烧瓶中，并将其溶于MeOH(92.80ml)中，并添加乙酸吲哚酚(405.48mg，2.315mmol)和碳酸钠(Na₂CO₃)(637.83mg，6.02mmol)在65℃下搅拌12小时。使用TLC(Rf＝0.4；乙酸乙酯/己烷＝1/2(v/v))检查反应是否终止，并将产物冷却直至在冰中形成晶体物质。当晶体形成，将其滤出，除去溶剂，弃去滤液并用溶剂(乙醇/水＝1/1(v/v))将产品冲洗数次。将产物过滤以在真空泵中干燥，并用于下一步骤而无需进一步纯化。

②合成A3051

将5’6’-二氯-[2，3’-联二氢亚吲哚基]-2’3-二酮(5’，6’-二氯-[2，3’-联二氢亚吲哚基]-2’，3-二酮(600mg，1.81mmol)放入100ml圆底烧瓶中，并且然后放入吡啶(151ml)。添加H₂NOCH₃·HCl(3026.4mg，36.24mmol)并在120℃下搅拌12小时。使用TLC(Rf＝0.4并且乙酸乙酯/己烷＝1/1(v/v))验证反应是否终止并将反应溶液的温度降低至室温。将产物的所有吡啶溶剂蒸发之后，添加水和乙酸乙酯以使用超声波溶解产物30分钟。用乙酸乙酯等萃取两次。用将其用饱和NaHCO₃溶液洗涤。将萃取液用无水硫酸镁进行吸收之后，蒸发溶剂，并使用甲醇和核酸将其复位。如果将产品在真空泵中干燥，可获得红色固体A3051，产率为47.94％(326mg)。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.36(s，2H)，8.80(s，1H)，8.08(d，1H，J＝7.7Hz)，7.46-7.41(m，2H)，7.07-6.99(m，2H)，4.38(s，3H).

实施例2.合成5-甲氧基靛玉红-3’-肟(A3334)

①合成中间体5’-甲氧基-[2，3′-联二氢亚吲哚基]-2’，3-二酮

将5-甲氧基靛红(1000mg，5.65mmol)添加到250ml圆底烧瓶中，并将其溶于MeOH(225ml)中。添加吲哚乙酸酯(989mg，5.65mmol)和碳酸钠(Na₂CO₃)(1496mg，14.11mmol)在65℃下搅拌12小时。使用TLC(Rf＝0.4；乙酸乙酯/己烷＝1/2(v/v))检查反应是否终止，并将产物冷却直至在冰中形成晶体物质。晶体形成之后，将其滤出，除去溶剂，弃去滤液，然后用溶剂(乙醇/水＝1/1(v/v))将产物冲洗数次。将产生的水过滤以在真空泵中干燥，并用于下一步骤而无需进一步纯化。

②合成A3334

将5’-甲氧基-[2，3’-联二氢亚吲哚基]-2’，3-二酮(670mg，2.29mmol)放入100ml的圆底烧瓶中，并将其溶于吡啶(phyridine)(27ml)中。添加H₂NOH·HCl(3186mg，45.85mmol)并在120℃下搅拌12小时。使用TLC(Rf＝0.5并且乙酸乙酯/己烷＝1/1(v/v))以验证反应是否终止并将反应溶液的温度降低至室温。将产物的所有吡啶溶剂蒸发之后，添加水和乙酸乙酯以使用超声波溶解产物30分钟。用乙酸乙酯等萃取两次。将其用饱和NaHCO₃溶液洗涤。将萃取溶液用无水硫酸镁进行脱水之后，蒸发溶剂，并使用甲醇和核酸将其复位。如果将产品在真空泵中干燥，可获得红色固体A3334，产率为59％(420mg)。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ13.52(s，1H)，11.79(s，1H)，10.54(s，1H)，8.35(d，J＝1.5Hz，1H)，8.26(d，J＝7.6Hz，1H)，7.41(d，J＝2.8Hz，2H)，7.08-7.00(m，1H)，6.82-6.71(m，2H)，3.78(s，3H).

比较例1至12.合成靛玉红衍生物

以与5，6-二氯代靛玉红-3’-甲肟或5-甲氧基靛玉红-3’-肟相同的方式(将其溶于二甲基硫醚(DMSO)中并用于实验)合成5-氯代靛玉红-3’-甲肟、5-溴代靛玉红-3’-肟、5-溴代靛玉红-3’-甲肟、5-溴代靛玉红-3’-乙肟、6-溴代靛玉红-3’-肟、6-氯-5-硝基靛玉红、6-氯-5-硝基靛玉红-3’-肟、6-氯代靛玉红-3’-甲肟、5，6-二氯代靛玉红、5，6-二氯代靛玉红-3’-肟、5，6-二氯代靛玉红-3’-丙肟。依次将其命名为比较例1至12。

<实验装置及方法>

1.细胞培养

1)ATDC5细胞培养

将ATDC5细胞(鼠恒定细胞系)在37℃和5％CO₂的条件下，在包含5％胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)和1％青霉素/链霉素的DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基，Gibco，Grand Island，NYC)中培养。

2)MC3T3-E1细胞培养

将MC3T3-E1细胞(小鼠成骨细胞系)在37℃和5％CO₂的条件下，在包含10％产前血清和1％青霉素/链霉素的最低必需培养基(α-MEM)(Gibco)中培养。为了进行分化诱导测试，将细胞在包含50μg/ml抗坏血酸和100mMβ-甘油磷酸的α-MEM培养基中培养。

2.MTT还原分析

在将5×10³个ATDC5细胞固定在96孔板中之后，当细胞稳定附着时，用药物(此处为6-溴代靛玉红-3’-肟)进行处理。24小时之后，转移至包含100μg/ml MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑鎓)]的培养基中，并将细胞孵育2小时，然后除去生长培养基。将还原成紫色甲臜(formazane)的MTT用DMSO溶解，并且然后通过在540nm处的ab吸光度测量进行分析。

3.western印迹分析.

为了进行western印迹分析，用药物(此处为5，6-二氯代靛玉红-3’-甲肟、5-甲氧基靛玉红-3’-肟)处理24小时，并且培养MC3T3-E1细胞并在培养皿达到100％汇合时收集。使用SDA-PAGE凝胶，在电泳之后使用抗体，对收获的样品进行免疫印迹分析，以定量细胞裂解之后的蛋白质。

4.免疫细胞化学

当细胞以每孔2.5×10⁴个细胞的密度牢固地附着在放置在12孔板中的盖玻片上时，用药物(此处为5，6-二氯代靛玉红-3’-甲肟、5-甲氧基靛玉红-3’-肟)处理24小时。用磷酸缓冲溶液清洗细胞，并通过添加4％多聚甲醛在室温下固定20分钟，并且然后通过透化、封闭和免疫荧光过程观察在细胞中表达的蛋白质。

5.ALP活性测定

将5×10⁴个MC3T3-E1细胞在24孔板上孵育两天并固定。在确定细胞达到100％汇合之后，将药物(实施例1中的5，6-二氯代靛玉红-3’-甲肟)在分化培养基中处理48小时。细胞裂解之后，用磷酸缓冲溶液清洗细胞，并用包含50mM Tris-盐酸、100mM甘氨酸和对硝基苯基磷酸盐的缓冲溶液(pH 10.3)处理收集的样品。为了分析，用3M氢氧化钠处理，并在405nm处测量吸光度。通过使用Bradford Analyzer测量蛋白质浓度来对ALP活性进行定量。

6.组织培养和试剂

从15.5个胚胎日C57BL/6小鼠中分离出长骨，并在24孔组织培养皿中孵育7天。培养基用作最低必需培养基(α-MEM，Gibco)，其包括10％胎牛血清(FBS)、1mMβ聚甘油磷酸二钠、50ng/ml抗坏血酸、0.3g/L-谷氨酰胺、0.2％BSA、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素。从小鼠分离出长骨之后，将从培养基分离出的长骨孵育24小时，然后用药物进行处理。每隔一天更换培养基和药物(这里是实施例1，实施例2，比较例1、7至9和10至12的靛玉红衍生物)。在用药物处理之前和之后测量长骨的长度。在药物处理之后将长骨组织用PBS冲洗，并用4％甲醛固定。

为了更精确地确定本发明的实施例1或实施例2中靛玉红衍生物和其他靛玉红衍生物对离体长骨的培养的影响，如实验方法6中那样处理多种靛玉红衍生物(实施例1和2以及比较例1、8、9、10至12的靛玉红衍生物)，并测量长骨的长度。

图1是当用实施例1、实施例2和比较例1、8、9、10至12中的靛玉红诱导处理时在每个离体培养的长骨的照片。图2是显示图1中测量的长骨的长度变化的图和表。在这种情况下，下垂的靛玉红衍生物在0.5μM下是相同的，并且在培养基中处理了6天。

可以确定，实施例1中的5，6-二氯代靛玉红-3’-甲肟和实施例2中的5-甲氧基靛玉红-3’-肟的这些效果显著优于比较例8、9和比较例10至12的靛玉红衍生物的效果。具体地，发现根据本发明的这两个分子使长骨的长度更有效地提高了约54％。长骨长度的这种差异的改善非常显著，其比预期能够使长骨生长的常规激素药物要快得多。对照组(对照)是用DMSO溶液代替药物进行处理的长骨长度的测量。

我们试图更准确地确定6-溴代靛玉红-3’-肟(比较例6)对离体长骨培养的影响。图3A是离体的长骨培养物的照片(左)和显示当用对比例6的6-溴代靛玉红-3’-肟处理时的数值的图(右)。此时，在培养基中用0.5μM的6-溴代靛玉红-3’-肟处理6天。对照是用DMSO溶液代替药物进行处理的长骨。

如图3A中所示，与对照组相比，在比较例6中，通过6-溴代靛玉红-3’-肟的处理，减少了离体长骨的长度。

图3B是在用不同浓度的6-溴代靛玉红-3’-肟处理之后软骨细胞MTT还原分析的图，以确定比较例6中用6-溴代靛玉红-3’-肟处理的长骨长度的减少是否与对软骨细胞存活率的影响有关。

MTT还原法是通过分析由于由活细胞中线粒体酶反应导致的黄色MTT还原为紫色甲臜而引起的吸光度差异来测量细胞活力的方法。

如图3B中所示，当以1μM或更高的浓度处理时，6-溴代靛玉红-3’-肟(比较例6)抑制软骨细胞的生长，并且通过5μM的6-溴代靛玉红-3’-肟确定这些细胞的存活率降低至低于50％。即，表明比较例6中的6-溴代靛玉红-3’-肟对软骨细胞具有毒性。换言之，6-溴代靛玉红素-3’-肟抑制长骨的长度并对细胞具有毒性，因此其可能是该药物将被用作治疗骨疾病或骨生长障碍的问题。

按照实验方法5进行ALP活性分析，以确定实施例1中的5，6-二氯代靛玉红-3’-甲肟和实施例2中的5-甲氧基靛玉红-3’-肟对骨矿物质密度的影响。图4是显示测量的示出了细胞中ALP活性的图的表，和显示在用根据本发明的实施例1的5，6-二氯代靛玉红-3’-甲肟、实施例2的5-甲氧基靛玉红-3’-肟、对比例1至5和12的靛玉红衍生物处理的细胞中ALP活性的程度的表。对照是药物处理之前细胞中的ALP活性。

如图4中所示，当分析ALP(碱性磷酸酶(alkaline phosphatase))的活性(分化条件下骨形成的重要标志物)时，用实施例1的5，6-二氯代靛玉红3’-甲肟和实施例2的5-甲氧基靛玉红-3’-肟处理的组中的ALP活性显著高于其他组。

该效果具有不能被现有的靛玉红衍生物(比较例1至5、12)所确定的非常显著的效力，具体地，实施例1和2的靛玉红衍生物将ALP活性提高了近2倍，而常规靛玉红衍生物仅将ALP活性提高了1.5倍。

换言之，在根据本发明的实施例1的5，6-二氯代靛玉红-3’-甲肟或实施例2的5-甲氧基靛玉红-3’-肟情况下，在骨形成中发挥最重要的作用的ALP活性提高了30％至100％，从而确定其是最有效的治疗剂。

Wnt/β-联蛋白信号传导在脊椎动物的发育、生长和体内平衡中发挥至关重要的作用。特别地，已经发现，如果Wnt/β-联蛋白信号传导失调，则在包括人在内的动物的骨形成过程中可能会发生异常。β-联蛋白是该通路中的关键信号分子，其稳定并在细胞质中积累，然后进入核中，以促进与骨长度和密度提高有关的多种基因的表达。

图5是使用MC3T3-E1细胞(成骨细胞)确定实施例1的5，6-二氯代靛玉红-3’-甲肟和实施例2的5-甲氧基靛玉红-3’-肟对β-联蛋白的稳定性的影响的western印迹的结果。

如图5中所示，实施例1的5，6-二氯代靛玉红-3’-甲肟和实施例2的5-甲氧基靛玉红-3’-肟显著诱导了β-联蛋白的稳定。

我们确定了实施例1的5，6-二氯代靛玉红-3’-甲肟和实施例2的5-甲氧基靛玉红-3’-肟对β-联蛋白的稳定是否最终显著导致了移入核中的β-联蛋白的量提高。

图6是通过免疫细胞化学确定用实施例1的5，6-二氯代靛玉红-3’-甲肟和实施例2的5-甲氧基靛玉红-3’-肟处理的ATDC5细胞中β-联蛋白浓度的照片。换言之，通过ICC确定了ATDC5细胞中β-联蛋白的表达和定位。

如图6中所示，根据本发明的实施例1的5，6-二氯代靛玉红-3’-甲肟和实施例2的5-甲氧基靛玉红-3’-肟诱导β-联蛋白稳定并提高了稳定的β-联蛋白进入核中的迁移率。换言之，实施例1的5，6-二氯代靛玉红-3’-甲肟和实施例2的5-甲氧基靛玉红-3’-肟的处理提高了β-联蛋白的总量和移至核的β-联蛋白的量。

通过实验结果，实施例1的5，6-二氯代靛玉红-3’-甲肟或实施例2的5-甲氧基靛玉红-3’-肟即使在低浓度下也能改善β-联蛋白的稳定性并提高移至核内的β-联蛋白的量，从而提高了多种与骨形成相关的基因的表达，并改善了骨密度以及骨长度。

总之，以上结果表明，实施例1的5，6-二氯代靛玉红-3’-甲肟和实施例2的5-甲氧基靛玉红-3’-肟可通过提高骨长度和密度来有效治疗多种骨疾病。