非CpG的硫代磷酸寡核苷酸在制备抗血小板药物中的用途
阅读说明：本技术 非CpG的硫代磷酸寡核苷酸在制备抗血小板药物中的用途 (Use of non-CpG phosphorothioate oligonucleotides in preparation of antiplatelet drugs ) 是由 夏荣 韩佳 丁忠仁 潘冠星 陈绍恒 于 2020-05-26 设计创作，主要内容包括：本发明属生物制药技术领域,涉及抗血小板的核酸药物,具体涉及非CpG结构的硫代磷酸寡核苷酸在制药中的新用途,经实验证实Let7b inhibitor-PS静脉给药可抑制FeCl3诱发的血栓形成,且药物浓度增加,抑制效果增强；与阳性药物替罗非班比,在相同的抗栓能力下,Let7b inhibitor-PS出血副作用小；Let7b inhibitor-PS可抑制血小板的聚集、分泌、铺展及血块回缩,未硫代磷酸化修饰的Let7b inhibitor不具有上述功能；同时Let7b inhibitor-PS对血小板活化功能的抑制,不具有序列依赖性,但含有CpG基序的硫代磷酸寡核苷酸除外；所述的非CpG结构的硫代磷酸寡核苷酸可用于制备抗血小板的核酸药物,进一步作为预防和治疗动脉血栓性疾病的药物。(The invention belongs to the technical field of biological pharmacy, relates to a nucleic acid medicament for resisting platelet, and particularly relates to a new application of phosphorothioate oligonucleotide with a non-CpG structure in pharmacy, and experiments prove that the intravenous administration of Let7b inhibitor-PS can inhibit the thrombosis induced by FeCl3, the concentration of the medicament is increased, and the inhibition effect is enhanced; compared with the positive medicament tirofiban, under the same antithrombotic capacity, Let7b inhibitor-PS has small bleeding side effect; the Let7b inhibitor-PS can inhibit the aggregation, secretion, spreading and retraction of blood clots of platelets, and the Let7b inhibitor which is not modified by thiophosphorylation does not have the functions; meanwhile, Let7b inhibitor-PS has no sequence dependence on the inhibition of the platelet activation function, except for phosphorothioate oligonucleotides containing CpG motifs; the phosphorothioate oligonucleotide with the non-CpG structure can be used for preparing a nucleic acid medicament for resisting platelet, and further can be used as a medicament for preventing and treating arterial thrombotic diseases.)
技术领域
本发明属生物制药技术领域，涉及抗血小板的核酸药物，具体涉及非CpG结构的硫代磷酸寡核苷酸在制药中的新用途，所述的非CpG结构的硫代磷酸寡核苷酸可用于制备抗血小板的核酸药物，进一步用于预防和治疗动脉血栓性疾病。
背景技术
2015年新英格兰杂志发表的研究表明近20年间，全球心血管疾病的死亡人数增加了40.8％，缺血性心脏病是导致心血管死亡人数增加的最大原因(总心血管死亡人数增加了500万，其中缺血性心脏病占240万)；其次是缺血性脑卒中；文中就亚洲地区心血管疾病的研究显示，2013年新增120多万人死亡，比1990年增加47.2％。2017年，我国心血管病报告指出，心血管病死亡占居民疾病死亡构成40％以上，居首位，高于肿瘤及其他疾病。临床研究公开了动脉血栓形成，表现为心肌梗死(MI)和缺血性脑卒中，是导致全球死亡和残疾的主要原因。业内认为，血小板在介导动脉粥样硬化血栓形成中的具基本作用，因此，抗血小板药物是预防和治疗动脉血栓形成的核心。
目前临床实践主要使用以下4种抗血小板的药物，根据情况可单独使用或联合使用：环氧合酶1(cyclooxygenase1，COX1)抑制剂(阿司匹林)、ADPP2Y12受体拮抗剂(坎格瑞洛、氯吡格雷、普拉格雷和替卡格雷)、蛋白酶激活受体1(protease-activated receptor1，PAR1)拮抗剂(沃拉帕沙)和GPIIb/IIIa拮抗剂(阿昔单抗、依替巴肽和替罗非班)。现有的抗血小板药物分别抑制了正常止血过程的重要靶点，似乎已经达到了临床获益的上限，在临床应用实践中存在耐受及抵抗现象，且治疗强度的增加必然导致出血风险的增加。总之，目前仍然需研发新的抗血小板药物，以允许更安全，更有效，更广泛的血小板抑制来满足现有的临床需求。
本领域新的血小板激活理论认为，正常止血过程和病理性血栓的形成机制存在很大差异，这些差异点则是新型抗血小板药物的潜在作用靶点。血栓核心即动脉损伤处的完全活化的血小板，高度依赖于可溶性激动剂，如凝血酶；相比较，延续性血栓是由低活化状态的血小板组成，该区域募集的血小板似乎对传统抗血小板药物敏感性不高；业内越来越认识到血栓过度增长的调控机制，为开发出血风险小的治疗药物提供了可能。研究显示，动脉粥样硬化病变处由于狭窄而引起的血流变化似乎是调节血栓生长的一个重要因素，在狭窄的动脉中，高剪切应力条件下GPIb和vWF之间的相互作用更加强有力，因此目前临床实验的不同阶段已经出现了抗GPIb或vWF的抗体、源自蛇毒的GPIb拮抗剂、抗vWF的适配子等研究；
与此同时，结合蛋白质的单链寡核苷酸(也即适配子)在抗血栓治疗方面取得了重大新进展。针对vonWillebrand因子、FVIIa-组织因子复合物、FIXa和凝血酶的适配子的临床前研究取得了令人鼓舞的结果，尤其是药物活性逆转剂的构建，可为血栓患者提供针对性和控制性的治疗。尽管适配子药物比蛋白质抗体有诸多优势，但迄今为止，尚未见有关靶向作用于血小板表面功能受体的适配子的报道。
基于现有技术的现状，针对现有抗血小板药物存在的缺陷，提供新的抗血小板的核酸药物，涉及非CpG结构的硫代磷酸寡核苷酸在制药中的新用途，进一步用于预防和治疗动脉血栓性疾病。
发明内容
本发明的目的是基于现有技术的现状，针对现有抗血小板药物存在的缺陷，提供新的抗血小板的核酸药物，涉及非CpG结构的硫代磷酸寡核苷酸在制药中的新用途，所述的非CpG结构的硫代磷酸寡核苷酸可用于制备抗血小板的核酸药物，进一步用于预防和治疗动脉血栓性疾病。
本发明提供了非CpG结构的硫代磷酸寡核苷酸在用于制备抗血小板的核酸药物中的新用途，本发明进行了体外实验和体内实验，经体外实验证实Let7b inhibitor-PS可以抑制血小板的聚集、分泌、铺展及血块回缩，未硫代磷酸化修饰的Let7b inhibitor不具有上述功能；同时发现Let7b inhibitor-PS对血小板活化功能的抑制，不具有序列依赖性，但含有CpG基序的硫代磷酸寡核苷酸除外；体内实验通过FeCl3诱导小鼠肠系膜动脉血栓模型，证实Let7b inhibitor-PS静脉给药后可抑制FeCl3诱发的血栓形成，并且随着药物浓度的增加，抑制效果增强；小鼠截尾实验结果表明，同阳性药物替罗非班相比，在相同的抗栓能力下，Let7b inhibitor-PS出血副作用小。
具体的，本发明通过下述技术方案实施，
首先通过细胞热转变分析(Cellular Thermal Shift Assay，CETSA)在分子学上验证Let7b inhibitor-PS与GPIb能够结合；其次借用计算机生物信息学通过分子模拟和分子对接技术实现Let7b inhibitor-PS与GPIb相互作用的三维空间模式以及氨基酸结合位点，同时推测Let7b inhibitor-PS与GPIb之所以能够结合是由于分子氢键的断裂导致核苷酸空间结构松散；所述实验技术证实非CpG结构的硫代磷酸寡核苷酸可与血小板表面功能受体GPIb在空间结构上发生结合；
本发明进一步通过一系列体内功能实验，如FeCl3诱导小鼠肠系膜动脉血栓模型，证实Let7b inhibitor-PS静脉给药后可抑制FeCl3诱发的动脉血栓形成，并且随着药物浓度的增加，抑制效果增强；小鼠截尾实验结果表明，同阳性药物替罗非班相比，在同样的抗栓效果下，Let7b inhibitor-PS引起的出血副作用小；
实验证实，所述的Let7b inhibitor-PS及其他不含CpG基序的硫代磷酸寡核苷酸可用于制备抗血栓药物；
非CpG结构的硫代磷酸寡核苷酸可作为血小板表面功能受体GPIb的适配子抑制血小板活化聚集，进而用于预防及治疗动脉血栓性疾病。
本发明中，所述的适配子—非CpG结构的硫代磷酸寡核苷酸，是指与特定蛋白发生空间构象结合的短链核苷酸，所述的特定蛋白是指GPIb，并且只有进行硫代磷酸化修饰的寡核苷酸才能与之结合；该结合不具有序列特异性；但含有CpG结构的硫代磷酸寡核苷酸不能与之结合。
本发明中，体外实验结果显示Let7b inhibitor-PS(硫代磷酸化修饰的Let7binhibitor核苷酸序列)抑制人和小鼠血小板聚集及分泌；抑制血小板的铺展及血块回缩，并且随着浓度的增加，抑制效果增强；然而Let7b inhibitor-PO(未经硫代磷酸化修饰的Let7b inhibitor核苷酸序列)不具备上述抑制功能，表明Let7b inhibitor-PS具备成为抗血小板药物的潜力；其次，本发明实验显示其他序列的硫代磷酸寡核苷酸也能抑制血小板的活化聚集，但是含有CpG基序的硫代磷酸寡核苷酸不能抑制血小板的活化聚集；
本发明的实验结果显示：不含CpG结构的硫代磷酸寡核苷酸均在Thrombin和Ristocetin激动剂的作用下抑制血小板聚集，上述两种激动剂均可通过血小板表面的功能受体GPIb激活血小板，实验表明，非CpG结构的硫代磷酸寡核苷酸可作为血小板表面功能受体GPIb的适配子发挥抗栓作用。
本发明中，所述的Let7b inhibitor-PS核苷酸序列如序列1所示。
本发明中，所述的核苷酸序列如序列2--4所示。
本发明中的非CpG结构的硫代磷酸寡核苷酸在进一步作为预防及治疗动脉血栓性疾病的药物时具有以下特点：
1、靶向抗栓治疗效果好；
2、出血副作用小；
3、提供了新的抗血小板的核苷酸药物，
4、非CpG结构的硫代磷酸寡核苷酸可作为血小板表面功能受体GPIb的适配子发挥抗栓作用。
附图说明
图1：体外实验显示Let7b inhibitor-PS对血小板活化功能抑制，而Let7binhibitor-PO不具备上述功能，其中，
(a)在凝血酶及瑞斯托霉素激动剂作用下,Let7b inhibitor-PS抑制人和小鼠血小板聚集，其他激动剂作用下，无抑制作用；
(b)凝血酶的作用下，Let7b inhibitor-PS抑制人血小板ATP的分泌(A图)；
Let7b inhibitor-PS抑制血小板在纤维蛋白原玻片上的铺展(B图)；
Let7b inhibitor-PS对血块回缩的抑制呈现浓度依赖性(C图)。
图2：Let7b inhibitor-PS对血小板功能抑制具有非序列依赖性，其中，在凝血酶(A图)，瑞斯托霉素激动剂(B图)的作用下，硫代磷酸寡核苷酸(Phosphorothioates-oligonucleotides,PS-ODN)(1μM)抑制血小板聚集，PO-ODN(1μM)不能抑制血小板聚集；CpGtypeA-PS在没有激动剂存在下可引起血小板自发性聚集。
图3：通过细胞热转变分析(Cellular Thermal Shift Assay，CETSA)技术，在温度梯度和药物的浓度梯度下证实，Let7b inhibitor-PS、Poly T-PS能与GPIb的结合；CpGtype A-PS不能与GPIb的结合；其中，
(a)在温度梯度作用下，Let7b inhibitor-PS和Poly T-PS能够延迟GPIb蛋白的变性，而血小板表面的GPVI和P2Y12蛋白不受影响，CpG type A-PS不能发挥此作用；
(b)在浓度梯度作用下，随着Let7b inhibitor-PS和Poly T-PS药物浓度的增高，GPIb蛋白变性延迟，而GPVI和P2Y12蛋白不受影响，CpG type A-PS不能发挥此作用。
图4：利用生物信息技术对Let7b inhibitor-PS与GPIb的相互作用进行分子模拟和分子对接，预测Let7b inhibitor-PS能够与GPIb发生结合是由于硫代磷酸化修饰后破坏了分子间氢键的作用，使Let7b inhibitor-PS分子结构疏松，易于结合，其中，
Let7b inhibitor-PO与Let7b inhibitor-PS的分子模拟(A图)；
Let7b inhibitor-PS与GPIb相互作用的三维结构模式图(B图)；
Let7b inhibitor-PS与GPIb相互作用的氨基酸结合位点(C图)。
图5：利用激光共聚焦对Let7b inhibitor-PS与GPIb的共定位分析，其中，
(A)粘附玻片上，血小板分别与Let7b inhibitor-PO(10μM)、Let7b inhibitor-PS(10μM)共孵育5min，从单个血小板的放大图可见PO组药物的绿色荧光散在分布，没有发生聚集，而PS组绿色荧光多聚集在血小板表面，从而导致了如两组第一幅图所示的PS组药物量多于PO组药物量的假象；
(B)纤维蛋白原玻片上，血小板分别与Let7b inhibitor-PO(10μM)、Let7binhibitor-PS(10μM)共孵育30min，Let7b inhibitor-PO与Let7b inhibitor-PS均可以通过胞吞作用进入血小板胞浆内。
图6：凝血酶活化血小板后，Western blot检测Let7b inhibitor-PS对GPIb下游信号分子活化的抑制，其中，随着药物浓度的增高，对下游磷酸化蛋白(Syk 1/2(Tyr525/526)、PLC2(Tyr525/52、Akt(Ser473)和Erk1/2(T202/Y204)抑制作用越强。
图7：与替罗非班相比，不同浓度的Let7b inhibitor-PS对小鼠血栓形成的影响及尾端出血时间的影响，其中，
(A)在Fecl3小鼠动脉血栓模型中，与替罗非班相比，不同浓度的Let7binhibitor-PS对小鼠血栓形成的抑制，随着Let7b inhibitor-PS浓度的增加，血栓抑制的能力增强(图i))，通过>20通过血栓形成的时间(图ii))和肠系膜动脉血管完全阻塞的时间(图iii))进行统计分析，Let7b inhibitor-PS(15mg/kg)和替罗非班(Tirofiban，0.5mg/kg)的抗栓能力近似；
(B)在同样的抗栓作用下，静脉注射Let7b inhibitor-PS(15mg/kg)比替罗非班(Tirofiban，0.5mg/kg)的尾部出血时间短(*p<0.05 vs.Saline,**p<0.01 vs.Saline,***p<0.005 vs.Saline,NS＝not significant.)。
具体实施方式
实施例1.体外实验验证Let7b inhibitor-PS对血小板活化功能的抑制
1)设计并合成Let7b inhibitor-PS和Let7b inhibitor-PO：
在线网站(http://mirdb.org/cgi-bin/target_detail.cgi？targetID＝1913611)找到hsa-let-7b-5p的RNA序列5’UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU 3’，其互补序列即为hsa-let7b-5pinhibitor序列5’AACCACACAACCUACUACCUAC 3’，并对其进行硫代磷酸化修饰，即为Let7b inhibitor-PS，未被修饰的序列是Let7b inhibitor-PO(由上海杰李公司合成)；
2)洗涤血小板制备：
(1)人血小板：血小板来自于签订知情同意书的健康志愿者，志愿者在取血前20天未服用阿司匹林、氯吡格雷等抗血小板药物，首先将健康供者的静脉血液收集在10％ACD-A抗凝管中，离心300g×20分钟，收集上清，得富含血小板的血浆，900g×10分钟，收集富含血小板沉淀，并在Tyrode's(134mM NaCl，2.9mM KCL0.34mM Na2PO4，12mM NaHCO3，20mMHEPES，1mM MgCl2，5mM葡萄糖，0.5mg/mL牛血清白蛋白，pH＝7.4)缓冲液中重悬，将血小板数目调整为3×108/mL；
(2)小鼠血小板：通过腹腔注射戊巴比妥钠(60mg/kg)进行麻醉，对麻醉小鼠进行腹主动脉穿刺采集全血，置入3.8％的ACD抗凝管中，加入0.5ml的生理盐水，270g×1分钟，取上清，重复上述操作1次，将上清液离心，420g×3分钟，得到的沉淀用Tyrode's缓冲液重悬，制备洗涤过的血小板；
3)血小板聚集和分泌的测定：
使用血小板聚集仪(Model 400VS，Chrono-Log，Haverston，PA)测定血小板的聚集和分泌，参数设定：搅拌速度900rpm，温度37℃，在加激动剂之前，将血小板与药物在37℃下共孵育5分钟，血小板聚集曲线监测时间为5分钟，聚集率定义以溶剂对照组为100％。在测定血小板分泌ATP时，激动剂刺激前2分钟，将荧光素/荧光素酶(3μl)加入300μl洗涤血小板悬液中，注意避光。不同激动剂作用下聚集结果如图1(a)所示，分泌结果如图1(b)所示；
4)血小板的铺展：
用0.1M NaHCO3(pH8.3)配制100μg/ml纤维蛋白原涂在玻片上，4℃过夜，在37℃下，血小板(1×107/ml)粘附并在纤维蛋白原包被的玻片铺展1h，经固定，破膜，并用鬼笔环肽标记的肌动蛋白进行染色，用Olympus fluoview FV1000共聚焦显微镜观察粘附血小板的形态，利用IMAGEJ软件采集图像，以像素数为单位测量单个血小板的扩散面积，从至少三个不同测试中随机选择区域进行统计分析，Let7b inhibitor-PS对血小板铺展功能的抑制如图1(b)所示；
5)血块回缩：
将洗涤的人血小板(4×108/ml)用Tyrode缓冲液重悬在未使用的聚集管中，并与100μl的人血浆(PPP)混合，添加10ul的人α-凝血酶(10U/ml，生理盐水配制)和1.5ul的Cacl2(2mM)，室温下观察，每15min监测一次并拍照，使用J2X软件从照片中量化血块大小，Let7b inhibitor-PS对血块回缩功能的抑制如图1(b)所示。
实施例2.Let7b inhibitor-PS对血小板功能抑制呈现非序列依赖性实验
硫代磷酸寡核苷酸(phosphorothioate oligonucleotide，PS-ODN)是指寡核苷酸链中磷酸上带双键的氧原子被硫原子取代的衍生物，能够抵抗核酸酶，从而延长其在体内的作用时间；为明确是否其他核苷酸序列进行硫代修饰后也可以抑制血小板的活化，由上海杰李公司合成如下四大类寡核苷酸序列：a.不含CpG基序的Let7b inhibitor；b.不含CpG的随机序列R22；c.含CpG基序的CpG type A；d.不含CpG基序的22个核苷酸的聚合物(polyA,T,C,U)(如序列表所示)；每个序列有硫代和非硫代修饰两种划分，激动剂Thrombin、Ristocetin、AYPGKF、SFLLRN的作用下对血小板聚集率进行监测，每组设8例健康供者；实验结果显示：除含有CpG基序的硫代磷酸寡核苷酸外，其他序列均可在Thrombin、Ristocetin的作用下抑制血小板聚集，同时非硫代磷酸化的寡核苷酸不能抑制血小板聚集(如图2所示)。
实施例3.细胞热转变分析验证硫代磷酸寡核苷酸与GPIb的结合
细胞热转变分析(Cellular Thermal Shift Assay，CETSA)技术，依据蛋白和药物结合时热稳定性有所提高的特征，直接在细胞或组织内检测药物和标靶蛋白的结合亲和力：将标靶细胞和药物在固定温度下培育一定时间，然后通过蛋白免疫印迹法(WesternBlot)检测细胞浆内的标靶蛋白即可，结果如图3(a)，3(b)所示。
实施例4.利用生物信息学计算机模拟Let7b inhibitor-PS与GPIb的结合
经反复多次预实验结果均表明Let7b inhibitor-PS在Thrombin及Ristocetin的作用下抑制血小板的活化，表明适配子Let7b inhibitor-PS的作用靶点为血小板表面功能受体GPIb，通过生物信息学计算机模拟Let7b inhibitor-PS与GPIb的结合，图4显示了进一步推测结合的原因及结合位点。
实施例5.利用血小板免疫荧光染色观察Let7b inhibitor-PO、Let7b inhibitor-PS与血小板相互作用的异同
按常规方式处理获得血小板TB重悬液(1×107/ml),血小板悬液与药物在37℃下共孵育5min，吸取150uL血小板滴在粘附玻片上，37℃烘箱內放置30min，1*PBS静置洗涤3次，室温下滴加100uL固定液，静置15min，再次使用1*PBS静置洗涤3次，滴加150uL5％BSA(1*PBS配置)室温孵育1h，洗涤后，以1:200的比例用1*PBS稀释一抗，200uL/片4℃孵育12-14h(可视情况延长时间)(湿盒内孵育)，1*PBS静置洗涤3次后，以1:200比例用1*PBS稀释二抗，200uL/片室温避光孵育1-1.5h，最后进行封片，盖玻片上滴加20uL防荧光淬灭剂后盖在载玻片上，在盖玻片边缘涂抹适量指甲油，共聚焦显微镜观察Let7b inhibitor-PS与GPIb的共定位，结果如图5(A)所示；
按常规方式处理获得血小板TB重悬液(1×107/ml),血小板悬液与药物在37℃下共孵育30min，吸取150uL血小板滴在粘附玻片上，37℃烘箱內放置30min，后续的实验方法同前，共聚焦显微镜观察到Let7b inhibitor-PO与Let7b inhibitor-PS均可以通过胞吞作用进入血小板胞浆内(如图5(B)所示)。
实施例6.在凝血酶激动剂的作用下，Let7b inhibitor-PS对GPIb下游信号分子活化的抑制
免疫印迹法(Western blot)检测GP1b激活后下游通路中磷酸化蛋白表达：不同浓度的Let7b inhibitor-PS与血小板共孵育5min后，激动剂作用下利用血小板聚集仪收集样品并裂解；配置Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶，将蛋白与上样缓冲液混合上样后进行凝胶电泳，转膜后放入含3％BSA1×TBST中封闭2h，加入相应一抗Syk1/2(Tyr525/526)、PLC2(Tyr525/52、Akt(Ser473)和Erk1/2(T202/Y204)4℃孵育过夜，洗膜后加入HRP标记的二抗(1:1000)室温孵育1h，使用ECL荧光显影液A液和B液曝光显影，用QuantityOne图像分析系统检测Western印迹的蛋白条带及分光密度测定，结果如图6所示。
实施例7.在小鼠体内证实Let7b inhibitor-PS的动脉抗栓作用及Let7binhibitor-PS静脉给药后的出血倾向
本实施例通过FeCl3诱导小鼠肠系膜动脉血栓模型，从供体小鼠中分离血小板，钙黄绿素(Calcein-AM)5μg/ml标记，受试鼠尾静脉注射钙黄绿素标记的血小板(5×106/g)及药物，循环30分钟，肠系膜血管床外翻，在荧光显微镜(Leica DM5500)观察血栓形成过程(10％FeCl3浸泡的3mm2滤纸损伤血管壁，诱发血栓)，共聚焦显微镜(Leica TCS SPE)实时记录血栓形成的影像资料，结果如图7所示，Let7b inhibitor-PS静脉给药后可抑制FeCl3诱发的血栓形成，并且随着药物浓度的增加，抑制效果增强；
用10％水合氯醛(400mg/kg)腹腔麻醉6-8周龄的雄鼠(BALB/C)，尾部尖端3mm处截断，立即在37℃下浸入生理盐水中，记录出血停止时间，即60s内无再出血，，实验结果如图7所示。
序列表
>序列1不含CpG基序的Let7b inhibitor(hsa-let7b-5p inhibitor)
5’AACCACACAACCUACUACCUAC 3’
>序列2不含CpG的随机序列R22
5’UUGUACUACACAAAAGUACUGC 3’
>序列3含CpG基序的CpG type A
5’GGGGGACGATCGTCGGGGG 3’
>序列4不含CpG基序的22个核苷酸的聚合物(polyA,T,C,U)
5’AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 3’
5’TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3’
5’CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC 3’
5’UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU 3’。
SEQUENCE LISTING
<110> 复旦大学附属华山医院
<120> 非CpG的硫代磷酸寡核苷酸在制备抗血小板药物中的用途
<130>
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> hsa-let7b-5p inhibitor
<400> 1
aaccacacaa ccuacuaccu ac 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> R22
<400> 2
uuguacuaca caaaaguacu gc 22
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> CpG type A
<400> 3
gggggacgat cgtcggggg 19
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> poly A,T,C,U
<400> 4
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> poly A,T,C,U
<400> 5
tttttttttt tttttttttt tt 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> poly A,T,C,U
<400> 6
cccccccccc cccccccccc cc 22
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> poly A,T,C,U
<400> 7
uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uu 22