用于治疗奥尔波特综合征的方法
阅读说明：本技术 用于治疗奥尔波特综合征的方法 (Methods for treating Alport syndrome ) 是由 T·莱特 于 2018-05-04 设计创作，主要内容包括：本文提供了用于使用靶向于miR-21的经修饰的寡核苷酸治疗奥尔波特综合征的方法。在某些实施方案中,靶向于miR-21的所述经修饰的寡核苷酸改善患有奥尔波特综合征的受试者的肾功能和/或降低其纤维化。在某些实施方案中,靶向于miR-21的所述经修饰的寡核苷酸的给予延迟患有奥尔波特综合征的受试者的终末期肾病的发作。在某些实施方案中,靶向于miR-21的所述经修饰的寡核苷酸延迟患有奥尔波特综合征的受试者对透析或肾移植的需要。(Provided herein are methods for treating alport syndrome using modified oligonucleotides targeted to miR-21. In certain embodiments, the modified oligonucleotide targeted to miR-21 improves renal function and/or reduces fibrosis in a subject having alport syndrome. In certain embodiments, administration of the modified oligonucleotide targeted to miR-21 delays the onset of end stage renal disease in a subject having alport syndrome. In certain embodiments, the modified oligonucleotide targeted to miR-21 delays the need for dialysis or kidney transplantation in a subject having alport syndrome.)
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年5月4日提交的美国临时申请号62/501,699的优先权权益，将所述临时申请出于任何目的通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本文提供了用于治疗奥尔波特综合征的方法和组合物。
背景技术
IV型胶原蛋白(基底膜的一种主要组分)是六种α链的家族：α-1胶原蛋白(IV型)、α-2胶原蛋白(IV型)、α-3胶原蛋白(IV型)、α-4胶原蛋白(IV型)、α-5胶原蛋白(IV型)和α-6胶原蛋白(IV型)。胶原蛋白IV的α-3、α-4和α-6链是肾小球基底膜(GBM)的胶原蛋白网络的基本组分，肾小球基底膜执行通过肾脏过滤血液的重要功能。
奥尔波特综合征是一种遗传形式的肾脏疾病，其中产生异常类型的肾小球基底膜(GBM)，从而导致间质性纤维化、肾小球硬化和最终的肾功能丧失。所述疾病还经常以听力缺陷和眼部异常为特征。奥尔波特综合征是由Col4a3、Col4a4或Col4a5的突变引起的，所述基因分别编码IV型胶原蛋白的α3(IV)、α4(IV)和α5(IV)链。X染色体上Col4a5基因的突变导致X连锁形式的奥尔波特综合征，其占所述疾病所有病例的85％。常染色体隐性形式是由于Col4a3或Col4a4的每个拷贝的突变的遗传，所述基因各自位于2号染色体上。罕见的常染色体显性形式是由于Col4a3或Col4a4基因的显性失活突变的遗传。X连锁形式在男性中比在女性中更为严重，其中男性的大多数病例进展为终末期肾病(ESRD)。常染色体形式在男性和女性中的严重程度相似。所述疾病的大多数病例是由于遗传突变，但是一些病例是由于Col4aA基因之一的从头突变。
发明内容
实施方案1.一种用于治疗奥尔波特综合征的方法，其包括向患有奥尔波特综合征的受试者给予两个或更多个剂量的经修饰的寡核苷酸，其中所述经修饰的寡核苷酸由19个连接的核苷组成并且具有结构5’-AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE-3’(SEQ ID NO:3)，其中后面不带下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷；后面带有下标“E”的核苷是2’-MOE核苷；后面带有下标“S”的核苷是S-cEt核苷，并且每个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键，并且其中以剂量之间两周的频率给予1.5mg/kg的剂量。
实施方案2.根据实施方案1所述的方法，其中所述剂量是在药学上可接受的稀释剂中递送。
实施方案3.根据实施方案2所述的方法，其中所述药学上可接受的稀释剂是盐水溶液。
实施方案4.根据实施方案3所述的方法，其中所述盐水溶液是0.3％氯化钠溶液。
实施方案5.根据实施方案2至4中任一项所述的方法，其中在所述药学上可接受的稀释剂中所述经修饰的寡核苷酸的浓度是至少110mg/mL。
实施方案6.根据实施方案1至5中任一项所述的方法，其中所述剂量是110mg/mL的所述经修饰的寡核苷酸的单次推注剂。
实施方案7.根据实施方案1至6中任一项所述的方法，其中所述药物组合物是作为皮下注射剂给予。
实施方案8.根据实施方案7所述的方法，其中所述皮下注射剂是在所述受试者的前腹壁中给予。
实施方案9.根据实施方案1至8中任一项所述的方法，其包括选择已经依据临床、组织病理学和/或遗传标准诊断为患有奥尔波特综合征的受试者。
实施方案10.根据实施方案1至9中任一项所述的方法，其中在接受第一剂量的所述经修饰的寡核苷酸之前，所述受试者的估计的肾小球滤过率为30ml/min/1.73m2。
实施方案11.根据实施方案15所述的方法，其中在接受所述第一剂量的经修饰的寡核苷酸之前，所述受试者的估计的肾小球滤过率(eGFR)在45和90ml/min/1.73m2之间。
实施方案12.根据实施方案1至11中任一项所述的方法，其中在接受所述第一剂量的经修饰的寡核苷酸之前，所述受试者的估计的肾小球滤过率以≥5ml/min/1.73m2/年的速率下降。
实施方案13.根据实施方案1至12中任一项所述的方法，其中所述受试者是男性，已经诊断为患有X连锁奥尔波特综合征，并且年龄在18和30岁之间。
实施方案14.根据实施方案1至13中任一项所述的方法，其中在接受所述第一剂量的经修饰的寡核苷酸之前，所述受试者的蛋白尿大于300毫克蛋白质/克肌酸酐。
实施方案15.根据实施方案1至14中任一项所述的方法，其中在给予所述经修饰的寡核苷酸后，所述受试者经历与奥尔波特综合征相关的一个或多个参数的改善，所述参数选自：
a.估计的肾小球滤过率；
b.估计的肾小球滤过率的下降速率；和
c.使用Short Form 36Health
实施方案16.根据实施方案1至15中任一项所述的方法，其中在给予所述经修饰的寡核苷酸后，所述受试者展示一种或多种肾生物标记的改善，所述肾生物标记选自：
a.活检组织中的miR-21；
b.血尿素氮；
c.尿蛋白/白蛋白比；
d.尿白蛋白/肌酸比；
e.肌酸酐；
f.尿足细胞尿(podocyturia)；
g.肾损伤分子-1；
h.β-2微球蛋白；
i.丛集素；
j.胱抑素C；
k.不对称二甲基精氨酸；
l.转化生长因子-β；
m.***生长因子；和
n.嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白。
实施方案17.根据实施方案1至16中任一项所述的方法，其中在所述受试者的血液样品中测量肌酸酐、胱抑素C、肾损伤分子-1、β-2微球蛋白和/或丛集素中的一种或多种。
实施方案18.根据实施方案1至16中任一项所述的方法，其中在所述受试者的尿液样品中测量肌酸酐、胱抑素C、肾损伤分子-1、β-2微球蛋白和/或丛集素中的一种或多种。
实施方案19.根据实施方案1至18中任一项所述的方法，其中在接受所述第一剂量的寡核苷酸之前，所述受试者已经用血管紧张素II转化酶(ACE)抑制剂治疗至少30天。
实施方案20.根据实施方案1至19中任一项所述的方法，其中在接受所述第一剂量的寡核苷酸之前，所述受试者已经用血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)治疗至少30天。
实施方案21.根据实施方案19所述的方法，其中所述血管紧张素II转化酶(ACE)抑制剂选自卡托普利、依那普利、赖诺普利、苯那普利、喹那普利、福辛普利和雷米普利。
实施方案22.根据实施方案20所述的方法，其中所述血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)选自坎地沙坦、厄贝沙坦、奥美沙坦、氯沙坦、缬沙坦、替米沙坦和依普沙坦。
实施方案23.根据实施方案1至22中任一项所述的方法，其中向所述受试者给予至少24个剂量。
实施方案24.一种用于治疗受试者的奥尔波特综合征的方法，所述方法包括：
a.选择已经使用临床、组织病理学和/或遗传标准诊断为患有奥尔波特综合征的受试者；
b.向所述受试者给予两个或更多个剂量的包含经修饰的寡核苷酸的药物组合物，其中所述经修饰的寡核苷酸由19个连接的核苷组成并且具有结构5’-AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE-3’(SEQ ID NO:3)，其中后面不带下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷；后面带有下标“E”的核苷是2’-MOE核苷；后面带有下标“S”的核苷是S-cEt核苷，并且每个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键，其中所述经修饰的寡核苷酸的剂量是1.5mg/kg，并且其中以剂量之间两周的频率给予所述剂量，
c.其中在给予所述药物组合物后，所述受试者展示一个或多个AS相关参数的改善，所述参数选自：
i.估计的肾小球滤过率(eGFR)；
ii.eGFR的下降速率；和
iii.如通过Short Form 36Health
实施方案25.一种用于治疗受试者的奥尔波特综合征的方法，所述方法包括：
a.选择已经使用临床、组织病理学和/或遗传标准诊断为患有奥尔波特综合征的受试者，其中所述受试者：
i.具有至少30ml/min/1.73m2的估计的肾小球滤过率；
ii.具有≥5ml/min/1.73m2/年的估计的肾小球滤过率的速率下降；
iii.具有大于等于或大于300mg蛋白质/g肌酸酐的蛋白尿；并且
iv.已经用ACE抑制剂和/或ARB的稳定给药方案治疗至少30天；
b.向所述受试者给予两个或更多个剂量的包含经修饰的寡核苷酸的药物组合物，其中所述经修饰的寡核苷酸由19个连接的核苷组成并且具有结构5’-AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE-3’(SEQ ID NO:3)，其中后面不带下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷；后面带有下标“E”的核苷是2’-MOE核苷；后面带有下标“S”的核苷是S-cEt核苷，并且每个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键，其中所述经修饰的寡核苷酸的剂量是1.5mg/kg，并且其中以剂量之间两周的频率给予所述剂量，
c.其中在给予所述药物组合物后，所述受试者展示与奥尔波特综合征相关的一个或多个参数的改善，所述参数选自：
i.估计的肾小球滤过率(eGFR)；
ii.eGFR的下降速率；和
iii.如通过Short Form 36Health
实施方案26.一种用于减轻患有奥尔波特综合征的受试者的肾功能随时间减退的方法，所述方法包括：
a.选择依据临床、组织病理学和/或遗传标准确认诊断为患有奥尔波特综合征的受试者，其中所述受试者：
i.具有至少30ml/min/1.73m2的估计的肾小球滤过率；
ii.具有≥5ml/min/1.73m2/年的估计的肾小球滤过率的速率下降；
iii.具有大于等于或大于300mg蛋白质/g肌酸酐的蛋白尿；并且
iv.已经用ACE抑制剂和/或ARB的稳定给药方案治疗至少30天；
b.向所述受试者给予两个或更多个剂量的包含经修饰的寡核苷酸的药物组合物，其中所述经修饰的寡核苷酸由19个连接的核苷组成并且具有结构5’-AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE-3’(SEQ ID NO:3)，其中后面不带下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷；后面带有下标“E”的核苷是2’-MOE核苷；后面带有下标“S”的核苷是S-cEt核苷，并且每个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键，其中所述经修饰的寡核苷酸的剂量是1.5mg/kg，并且其中以剂量之间两周的频率给予所述剂量，
c.其中在给予所述药物组合物后，所述受试者展示一个或多个奥尔波特综合征相关参数的改善，所述参数选自：
i.估计的肾小球滤过率(eGFR)；
ii.eGFR的下降速率；和
iii.如通过Short Form 36Health
实施方案27.根据实施方案1至26中任一项所述的方法，其中所述经修饰的寡核苷酸具有结构：
实施方案28.根据实施方案27所述的方法，其中所述经修饰的寡核苷酸作为所述结构的药学上可接受的盐存在。
实施方案29.根据实施方案28所述的方法，其中所述经修饰的寡核苷酸作为所述结构的钠盐存在。
实施方案30.根据实施方案1至29中任一项所述的方法，其中所述经修饰的寡核苷酸具有结构：
实施方案31.根据实施方案10至30中任一项所述的方法，其中使用慢性肾脏病流行病学合作研究(CKD-EPI)肌酸酐公式计算所述估计的肾小球滤过率。
实施方案32.根据实施方案10至30中任一项所述的方法，其中使用慢性肾脏病流行病学合作研究(CKD-EPI)肌酸酐-胱抑素C公式计算所述估计的肾小球滤过率。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。除非提供具体的定义，否则与本文所述的分析化学、合成有机化学以及医药化学结合使用的命名法及其程序和技术是本领域中众所周知并且常用的那些。在本文中的术语存在多个定义的情况下，以本部分中的那些为准。标准技术可以用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及受试者的治疗。某些此类技术和程序可以例如在Sangvi和Cook,American Chemical Society,Washington D.C.,1994编辑的“Carbohydrate Modifications in Antisense Research”；和“Remington'sPharmaceutical Sciences,”Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,第18版,1990中找到；并且将所述参考文献出于任何目的通过引用特此并入。在允许的情况下，除非另外说明，否则在本文的整个公开文本中提及的所有专利、专利申请、公开的申请和公开案、GENBANK序列、网站和其他公开的材料均通过引用以其整体而并入。在提及URL或其他这种标识符或地址的地方，应当理解，可以改变此类标识符并且可以改变互联网上的特定信息，但是可以通过搜索互联网来找到等效信息。对其的提及证明了此类信息的可用性和公开传播。
在公开和描述本发明的组合物和方法之前，应当理解，本文中使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，而不旨在是限制性的。必须指出，如在说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个/一种(a、an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地规定。
定义
“奥尔波特综合征(Alport syndrome)”意指一种遗传形式的肾脏疾病，其中产生异常水平的肾小球基底膜(GBM)，从而导致间质性纤维化、肾小球硬化和最终的肾功能丧失。所述疾病还经常以听力缺陷和眼部异常为特征。
“血尿”意指尿液中存在红细胞。
“白蛋白尿”意指尿液中存在过量的白蛋白，并且包括但不限于正常白蛋白尿、高正常白蛋白尿、微量白蛋白尿和大量白蛋白尿。正常地，肾小球滤过透性屏障(其由足细胞、肾小球基底膜和内皮细胞组成)防止血清蛋白渗入尿液中。白蛋白尿可以反映肾小球滤过透性屏障的损伤。白蛋白尿可以由24小时尿液样品、过夜尿液样品或点尿样品计算得出。
“高正常白蛋白尿”意指升高的白蛋白尿，其特征在于(i)每24小时将15至<30mg的白蛋白排入尿液中和/或(ii)男性中1.25至<2.5mg/mmol(或10至<20mg/g)或女性中1.75至<3.5mg/mmol(或15至<30mg/g)的白蛋白/肌酸酐比。
“微量白蛋白尿”意指升高的白蛋白尿，其特征在于(i)每24小时将30至300mg的白蛋白排入尿液中和/或(ii)男性中2.5至<25mg/mmol(或20至<200mg/g)或女性中3.5至<35mg/mmol(或30至<300mg/g)的白蛋白/肌酸酐比。
“大量白蛋白尿”意指升高的白蛋白尿，其特征在于(i)每24小时将多于300mg的白蛋白排入尿液中和/或(ii)男性中>25mg/mmol(或>200mg/g)或女性中>35mg/mmol(或>300mg/g)的白蛋白/肌酸酐比。
“白蛋白/肌酸酐比”意指尿液白蛋白(mg/dL)/尿液肌酸酐(g/dL)的比率，并且以mg/g表示。在某些实施方案中，白蛋白/肌酸酐比可以从点尿液样品计算得出，并且可以用作24小时内白蛋白***量的估算值。
“肾小球滤过率(GFR)”意指经过滤的流体通过肾脏的流速，并且用作受试者的肾功能的指标。在某些实施方案中，受试者的GFR通过计算估计的肾小球滤过率来确定。在某些实施方案中，受试者的GFR使用菊粉法直接在受试者体内测量。
“估计的肾小球滤过率(eGFR)”意指肾脏过滤肌酸酐的程度的测量值，并且用于粗略估计肾小球滤过率。由于GFR的直接测量很复杂，因此在临床实践中经常使用eGFR。正常结果的范围可以是90-120mL/min/1.73m2。低于60mL/min/1.73m2的水平持续3个月或更多个月可能是慢性肾脏疾病的指标。低于15mL/min/1.73m2的水平可能是肾衰竭的指标。
“蛋白尿”意指尿液中存在过量的血清蛋白。蛋白尿的特征可以在于每24小时将>250mg的蛋白质排入尿液中和/或尿蛋白与肌酸酐的比率≥0.20mg/mg。与蛋白尿相关升高的血清蛋白包括但不限于白蛋白。
“血尿素氮”或“BUN”意指血液中呈尿素形式的氮的量的度量。肝脏在尿素循环中产生尿素作为蛋白质消化的废物，并且尿素被肾脏从血液中去除。正常成人血液每100ml血液中可能含有7至21mg尿素氮(7-21mg/dL)。将血尿素氮的测量值用作肾脏健康的指标。如果肾脏不能正常从血液中去除尿素，则受试者的BUN升高。
“终末期肾病(ESRD)”意指肾功能完全或几乎完全衰竭。
“肾功能损害”意指相对于正常肾功能，肾功能降低。
“纤维化”意指器官或组织中过量的纤维***的形成或发展。在某些实施方案中，纤维化作为修复或反应过程而发生。在某些实施方案中，纤维化响应于损害或损伤而发生。术语“纤维化”应当理解为在器官或组织中作为修复或反应过程的过量纤维***的形成或发展，而不是作为器官或组织的正常组分的纤维组织的形成。
“基线”意指在即将开始治疗之前受试者的临床参数的测量值。基线测量值可以用于确认受试者有资格用一种或多种选择的药剂治疗。在某些实施方案中，从患有奥尔波特综合征的受试者获得基线eGFR，以确认所述受试者有资格用如本文所述的一种或多种选择的药剂治疗。
“Short Form 36 Health”或“SF-36”意指受试者健康的36项受试者报告的调查，用于评估受试者的健康状况和生命质量。SF-36可以用于监测和比较接受疾病或病症治疗的受试者的疾病负担。SF-36包括8个独立领域：躯体功能、躯体角色功能、躯体疼痛、总体健康感、生命力、社会角色功能、情感角色功能和心理健康。例如，SF-36已经由McHorney等人(Med Care.1993年3月；31(3):247-63)进行了描述。
“生命质量”意指疾病和/或疾病的治疗损害受试者的身体、心理和社会功能的程度。患有慢性疾病(包括奥尔波特综合征)的受试者的生命质量可能会受损。
“稳定给药方案”意指给予受试者的药剂的在受试者体内维持药剂的治疗水平的量。例如，受试者可接受初始剂量的药剂，所述剂量可根据受试者对初始剂量的反应而调整为更高或更低。一旦确定了提供所需治疗水平的剂量，便认为受试者正在接受稳定给药方案。所需治疗水平可为受试者的组织(如血液)中所需的药剂水平；或所需药理作用，如疾病的一种或多种症状的改善。
“减慢进一步进展”意指降低医学病症向晚期状态发展的速度。
“阻止进一步进展”意指停止医学病症向晚期状态的进展。
“延迟透析时间”意指维持足够的肾功能，从而延迟对透析治疗的需要。
“延迟肾移植时间”意指维持足够的肾功能，从而延迟对肾移植的需要。
“改善预期寿命”意指通过治疗受试者的一种或多种疾病症状来延长受试者的寿命。
“抗miR”意指具有与微小RNA互补的核碱基序列的寡核苷酸。在某些实施方案中，抗miR是经修饰的寡核苷酸。
“抗miR-X”(其中“miR-X”指定特定的微小RNA)意指具有与miR-X互补的核碱基序列的寡核苷酸。在某些实施方案中，抗miR-X与miR-X完全互补(即100％互补)。在某些实施方案中，抗miR-X与miR-X至少80％、至少85％、至少90％或至少95％互补。在某些实施方案中，抗miR-X是经修饰的寡核苷酸。
“miR-21”意指具有核碱基序列UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA(SEQ ID NO:1)的成熟的miRNA。
“miR-21茎环序列”意指具有核碱基序列UGUCGGGUAGCUUAUCAGACUGAUGUUGACUGUUGAAUCUCAUGGCAACACCAGUCGAUGGGCUGUCUGACA(SEQ ID NO:2)的茎环序列。
“靶核酸”意指设计与寡聚化合物杂交的核酸。
“靶向”意指设计和选择将与靶核酸杂交的核碱基序列的过程。
“靶向于”意指具有将允许与靶核酸杂交的核碱基序列。
“调节”意指功能、量或活性的扰动。在某些实施方案中，调节意指功能、量或活性的增加。在某些实施方案中，调节意指功能、量或活性的降低。
“表达”意指将基因的编码信息转换为细胞中存在并且运行的结构的任何功能和步骤。
“核碱基序列”意指寡聚化合物或核酸中连续核碱基的顺序，通常以5’至3’方向列出，与任何糖、键和/或核碱基修饰无关。
“连续核碱基”意指核酸中彼此紧邻的核碱基。
“核碱基互补性”意指两个核碱基经由氢键合非共价配对的能力。
“互补”意指一种核酸能够与另一种核酸或寡核苷酸杂交。在某些实施方案中，互补是指寡核苷酸能够与靶核酸杂交。
“完全互补”(也称为“100％互补”)意指寡核苷酸的每个核碱基能够与靶核酸中每个相应位置的核碱基配对。在某些实施方案中，寡核苷酸与微小RNA完全互补，即，寡核苷酸的每个核碱基与微小RNA中相应位置的核碱基互补。在某些实施方案中，其中每个核碱基与微小RNA的茎环序列区域内的核碱基具有互补性的寡核苷酸与微小RNA的茎环序列完全互补。
“互补性百分比”意指寡核苷酸的与靶核酸的等长部分互补的核碱基的百分比。互补性百分比是通过将寡核苷酸的与靶核酸中相应位置的核碱基互补的核碱基的数目除以寡核苷酸中的核碱基总数来计算。
“同一性百分比”意指第一核酸中与第二核酸中相应位置的核碱基相同的核碱基数除以第一核酸中的核碱基总数。在某些实施方案中，第一核酸是微小RNA并且第二核酸是微小RNA。在某些实施方案中，第一核酸是寡核苷酸并且第二核酸是寡核苷酸。
“杂交”意指通过核碱基互补性发生的互补核酸的退火。
“错配”意指第一核酸的不能与第二核酸的相应位置的核碱基进行沃森-克里克配对的核碱基。
在核碱基序列的背景下，“相同”意指具有相同的核碱基序列，与糖、键和/或核碱基修饰无关并且与存在的任何嘧啶的甲基状态无关。
“微小RNA”意指长度在18和25个核碱基之间的内源性非编码RNA，其是通过Dicer酶切割前微小RNA的产物。在称为miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/)的微小RNA数据库中可找到成熟的微小RNA的例子。在某些实施方案中，微小RNA缩写为“微小RNA”或“miR”。
“微小RNA调控的转录物”意指通过微小RNA调控的转录物。
“种子序列”意指包含成熟的微小RNA序列的5’末端的核碱基1至9的6至8个连续核碱基的核碱基序列。
“种子匹配序列”意指与种子序列互补并且与种子序列长度相同的核碱基序列。
“寡聚化合物”意指包含多个连接的单体亚单位的化合物。寡聚化合物包括寡核苷酸。
“寡核苷酸”意指包含多个连接的核苷的化合物，每个核苷可以彼此独立地被修饰或未被修饰。
“天然存在的核苷间键”意指核苷之间的3’至5’磷酸二酯键。
“天然糖”意指在DNA(2’-H)或RNA(2’-OH)中发现的糖。
“核苷间键”意指相邻核苷之间的共价键。
“连接的核苷”意指通过共价键相连的核苷。
“核碱基”意指能够与另一核碱基非共价配对的杂环部分。
“核苷”意指与糖部分连接的核碱基。
“核苷酸”意指具有与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。
“包含由许多连接的核苷组成的经修饰的寡核苷酸的化合物”意指包括具有指定数目的连接的核苷的经修饰的寡核苷酸的化合物。因此，所述化合物可以包括另外的取代基或缀合物。除非另外指示，否则经修饰的寡核苷酸不与和经修饰的寡核苷酸杂交的互补链杂交，并且不包括除经修饰的寡核苷酸的那些之外的任何另外的核苷。
“经修饰的寡核苷酸”意指相对于天然存在的末端、糖、核碱基和/或核苷间键具有一个或多个修饰的单链寡核苷酸。经修饰的寡核苷酸可以包含未经修饰的核苷。
“经修饰的核苷”意指与天然存在的核苷相比具有任何变化的核苷。经修饰的核苷可以具有经修饰的糖和未经修饰的核碱基。经修饰的核苷可以具有经修饰的糖和经修饰的核碱基。经修饰的核苷可以具有天然糖和经修饰的核碱基。在某些实施方案中，经修饰的核苷是双环核苷。在某些实施方案中，经修饰的核苷是非双环核苷。
“经修饰的核苷间键”意指与天然存在的核苷间键相比的任何变化。
“硫代磷酸酯核苷间键”意指非桥连原子之一是硫原子的核苷之间的键。
“经修饰的糖部分”意指与天然糖相比的取代和/或任何变化。
“未经修饰的核碱基”意指RNA或DNA的天然存在的杂环碱基：嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)(包括5-甲基胞嘧啶)和尿嘧啶(U)。
“5-甲基胞嘧啶”意指包含附接到5位的甲基的胞嘧啶。
“非甲基化的胞嘧啶”意指不具有附接到5位的甲基的胞嘧啶。
“经修饰的核碱基”意指不是未经修饰的核碱基的任何核碱基。
“糖部分”意指天然存在的呋喃糖基或经修饰的糖部分。
“经修饰的糖部分”意指经取代的糖部分或糖替代物。
“2’-O-甲基糖”或“2’-OMe糖”意指在2’位具有O-甲基修饰的糖。
“2’-O-甲氧基乙基糖”或“2’-MOE糖”意指在2’位具有O-甲氧基乙基修饰的糖。
“2’-氟”或“2’-F”意指在2’位具有氟修饰的糖。
“双环糖部分”意指包含4至7元环(包括但不限于呋喃糖基)的经修饰的糖部分，其包含连接4至7元环的两个原子的桥以形成第二环，从而产生双环结构。在某些实施方案中，所述4至7元环是糖环。在某些实施方案中，所述4至7元环是呋喃糖基。在某些此类实施方案中，所述桥连接呋喃糖基的2’-碳和4’-碳。非限制性示例性双环糖部分包括LNA、ENA、cEt、S-cEt和R-cEt。
“锁核酸(LNA)糖部分”意指在4’和2’呋喃糖环原子之间包含(CH2)-O桥的经取代的糖部分。
“ENA糖部分”意指在4’和2’呋喃糖环原子之间包含(CH2)2-O桥的经取代的糖部分。
“受约束的乙基(cEt)糖部分”意指在4’和2’呋喃糖环原子之间包含CH(CH3)-O桥的经取代的糖部分。在某些实施方案中，CH(CH3)-O桥在S方向上受约束。在某些实施方案中，(CH2)2-O在R方向上受约束。
“S-cEt糖部分”意指在4’和2’呋喃糖环原子之间包含S-约束的CH(CH3)-O桥的经取代的糖部分。
“R-cEt糖部分”意指在4’和2’呋喃糖环原子之间包含R-约束的CH(CH3)-O桥的经取代的糖部分。
“2’-O-甲基核苷”意指具有2’-O-甲基糖修饰的2’-修饰的核苷。
“2’-O-甲氧基乙基核苷”意指具有2’-O-甲氧基乙基糖修饰的2’-修饰的核苷。2’-O-甲氧基乙基核苷可以包含经修饰的或未经修饰的核碱基。
“2’-氟核苷”意指具有2’-氟糖修饰的2’-修饰的核苷。2’-氟核苷可以包含经修饰的或未经修饰的核碱基。
“双环核苷”意指具有双环糖部分的2’-修饰的核苷。双环核苷可以具有经修饰的或未经修饰的核碱基。
“cEt核苷”意指包含cEt糖部分的核苷。cEt核苷可以包含经修饰的或未经修饰的核碱基。
“S-cEt核苷”意指包含S-cEt糖部分的核苷。
“R-cEt核苷”意指包含R-cEt糖部分的核苷。
“β-D-脱氧核糖核苷”意指天然存在的DNA核苷。
“β-D-核糖核苷”意指天然存在的RNA核苷。
“LNA核苷”意指包含LNA糖部分的核苷。
“ENA核苷”意指包含ENA糖部分的核苷。
“受试者”意指选择进行治疗或疗法的人或非人动物。
“有需要的受试者”意指鉴定为需要疗法或治疗的受试者。
“怀疑患有...的受试者”意指展示疾病的一种或多种临床指标的受试者。
“给予”意指向受试者提供药剂或组合物，并且包括但不限于由医学专业人员给予和自我给予。
“肠胃外给予”意指通过注射或输注给予。
肠胃外给予包括但不限于皮下给予、静脉内给予和肌内给予。
“皮下给予”意指刚好在皮肤以下给予。
“静脉内给予”意指给予进静脉。
“同时给予”是指以任何方式共给予两种或更多种药剂，其中两者的药理作用同时在受试者体内表现出。同时给予不需要两种药剂在单一药物组合物中、以相同的剂型或通过相同的给予途径给予。两种药剂的作用不必同时表现出来。作用仅需要重叠一段时间，并且不必共存。
“持续时间”意指活性或事件持续期间的时间段。在某些实施方案中，治疗的持续时间是给予药剂或药物组合物的剂量期间的时间段。
“疗法”意指疾病治疗方法。在某些实施方案中，疗法包括但不限于化学疗法、放射疗法或药剂的给予。
“治疗”意指用于疾病的治愈或缓解的一种或多种特定程序的应用。在某些实施方案中，所述特定程序是一种或多种药剂的给予。
“缓解”意指减轻病症或疾病的至少一种指标的严重程度。在某些实施方案中，缓解包括病症或疾病的一种或多种指标的进展的延迟或减慢。指标的严重程度可以通过本领域技术人员已知的主观或客观措施来确定。
“有患上...的风险”意指受试者易于患上病症或疾病的状态。在某些实施方案中，有患上病症或疾病的风险的受试者展示所述病症或疾病的一种或多种症状，但是没有展示足以诊断为患有所述病症或疾病的足够数量的症状。在某些实施方案中，有患上病症或疾病的风险的受试者展示所述病症或疾病的一种或多种症状，但是在较小程度上需要诊断为患有所述病症或疾病。
“预防...的发作”意指预防有患上疾病或病症的风险的受试者的病症或疾病的发展。在某些实施方案中，有患上疾病或病症的风险的受试者接受与已经患有所述疾病或病症的受试者所接受的治疗相似的治疗。
“延迟...的发作”意指延迟有患上疾病或病症的风险的受试者的病症或疾病的发展。在某些实施方案中，有患上疾病或病症的风险的受试者接受与已经患有所述疾病或病症的受试者所接受的治疗相似的治疗。
“治疗剂”意指用于治愈、缓解或预防疾病的药剂。
“剂量”意指在单次给予中提供的药剂的特定数量。在某些实施方案中，剂量能以两个或更多个丸剂、片剂或注射剂给予。例如，在需要皮下给予的某些实施方案中，所需剂量需要的体积通过单次注射不容易提供。在此类实施方案中，可以使用两次或更多次注射以获得所需剂量。在某些实施方案中，剂量能以两次或更多次注射给予，以最小化个体的注射部位反应。在某些实施方案中，剂量作为缓慢输注剂给予。
“剂量单位”意指提供药剂的形式。在某些实施方案中，剂量单位是含有冻干的寡核苷酸的小瓶。在某些实施方案中，剂量单位是含有重构的寡核苷酸的小瓶。
“治疗有效量”是指药剂的向动物提供治疗益处的量。
“药物组合物”意指适于向个体给予的物质(其包括药剂)的混合物。例如，药物组合物可以包含无菌水溶液。
“药剂”意指当向受试者给予时提供治疗效果的物质。
“活性药物成分”意指药物组合物中提供所需效果的物质。
“改善的器官功能”意指器官功能朝正常极限变化。在某些实施方案中，器官功能是通过测量受试者血液或尿液中发现的分子来评估。例如，在某些实施方案中，改善的肾功能通过血尿素氮的减少、蛋白尿的减少、白蛋白尿的减少等来测量。
“可接受的安全特性”意指在临床可接受极限内的副作用模式。
“副作用”意指可归因于治疗的除了所需效果以外的生理响应。在某些实施方案中，副作用包括但不限于注射部位反应、肝功能检查异常、肾功能异常、肝毒性、肾毒性、中枢神经系统异常和肌病。此类副作用可以直接或间接地检测。例如，血清中升高的转氨酶水平可能指示肝毒性或肝功能异常。例如，升高的胆红素可能指示肝毒性或肝功能异常。
“受试者依从性”意指受试者遵守推荐或开处方的疗法。
“依从”意指受试者遵守推荐的疗法。
“推荐的疗法”意指医学专业人员推荐的用于治疗、缓解或预防疾病的治疗。
如本文所用，术语“血液”涵盖全血和血液级分(如血清和血浆)。
综述
奥尔波特综合征是一种遗传形式的肾脏疾病，其中产生异常水平的肾小球基底膜(GBM)，从而导致间质性纤维化、肾小球硬化并且通常导致终末期肾病。在奥尔波特综合征的管理中，治疗的主要目标是维持肾功能并且预防终末期肾病(ESRD)的发作，这进而改善患有奥尔波特综合征的受试者的预期寿命。
奥尔波特综合征的特征在于由于GBM组成的缺陷导致进行性纤维化，因此期望改善GBM形态和肾功能。
通过临床试验注册中心公开的RG-012的先前剂量方案是每周110mg和每周220mg的固定剂量。对来自临床前模型中多个物种以及来自多递增剂量研究中健康志愿者的药代动力学数据的分析表明，以每两周一次的低频繁间隔给予的1.5mg/kg的基于体重的剂量将是既有效又适当安全的剂量方案。
某些经修饰的寡核苷酸
在某些实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸具有结构5’-AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE-3’(SEQ ID NO:3)，其中后面不带下标的核苷表示β-D-脱氧核糖核苷；后面带有下标“E”的核苷表示2’-MOE核苷；后面带有下标“S”的核苷表示S-cEt核苷；并且每个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
在某些实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸具有结构：
本文还提供了所述经修饰的寡核苷酸的药学上可接受的盐。因此，在一些实施方案中，经修饰的寡核苷酸具有结构：
或其药学上可接受的盐。所述经修饰的寡核苷酸的非限制性示例性药学上可接受的盐具有结构：
在一些实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸的药学上可接受的盐的每个分子包含少于硫代磷酸酯键的阳离子抗衡离子(如Na+)(即，一些硫代磷酸酯被质子化)。在一些实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸的药学上可接受的盐的每分子经修饰的寡核苷酸包含少于18个阳离子抗衡离子(如Na+)。也就是说，在一些实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸的药学上可接受的盐的每分子经修饰的寡核苷酸平均包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个阳离子抗衡离子，并且剩余的硫代磷酸酯被质子化。
本发明的某些用途
本文提供了用于治疗奥尔波特综合征的方法，其包括向患有或怀疑患有奥尔波特综合征的受试者给予本文提供的经修饰的寡核苷酸。
在某些实施方案中，在给予所述经修饰的寡核苷酸之前，所述受试者已经诊断为患有奥尔波特综合征。奥尔波特综合征的诊断可以通过参数的评估来实现，所述参数包括但不限于受试者的家族史、临床特征(包括但不限于蛋白尿、白蛋白尿、血尿、GFR受损，例如如通过测量eGFR、耳聋和/或眼部变化确定的)和组织活检结果。可以针对IV型胶原蛋白α-3、α-4和α-5链的存在或不存在对肾脏活检进行测试。另外，可以通过肾脏活检材料的电子显微镜检查来检测肾小球的结构变化。可以针对IV型胶原蛋白α-5链的存在对皮肤活检进行测试，所述链通常存在于皮肤中，并且几乎总是不存在于患有X连锁形式的奥尔波特综合征的男性受试者体内。奥尔波特综合征的诊断还可以包括筛选Col4a3、Col4a4或Col4a5基因的一个或多个突变。
在某些实施方案中，患有奥尔波特综合征的受试者的eGFR是至少30ml/min/1.73m2。在某些实施方案中，患有奥尔波特综合征的受试者的eGFR是45至90ml/min/1.73m2。在某些实施方案中，患有奥尔波特综合征的受试者的蛋白尿大于等于或大于300mg蛋白质/g肌酸酐。
在某些实施方案中，在患有奥尔波特综合征的受试者的肾脏中，miR-21的水平升高。在某些实施方案中，在给予之前，确定受试者在肾脏中具有升高水平的miR-21。miR-21水平可以从肾脏活检材料中测量而来。在某些实施方案中，在给予之前，确定受试者在受试者的尿液或血液中具有升高水平的miR-21。
在某些实施方案中，与miR-21互补的经修饰的寡核苷酸的给予导致与奥尔波特综合征相关的一个或多个参数的改善。在某些实施方案中，所述给予改善估计的肾小球滤过率。在某些实施方案中，所述给予改善测量的肾小球滤过率。在某些实施方案中，所述给予减慢肾小球滤过率的下降速率。在某些实施方案中，所述给予改善受试者的生命质量。
在某些实施方案中，所述给予改善肾功能。在某些实施方案中，所述给予延迟终末期肾病的发作。在某些实施方案中，所述给予延迟透析时间。在某些实施方案中，所述给予延迟肾移植的时间。在某些实施方案中，所述给予改善受试者的预期寿命。
在某些实施方案中，所述给予降低肾脏纤维化。在某些实施方案中，所述给予减慢肾脏纤维化的进一步进展。在某些实施方案中，所述给予阻止肾脏纤维化的进一步进展。在某些实施方案中，所述给予减少血尿。在某些实施方案中，所述给予延迟血尿的发作。在某些实施方案中，所述给予减少蛋白尿。在某些实施方案中，所述给予延迟蛋白尿的发作。
患有或怀疑患有奥尔波特综合征的受试者可能在编码IV型胶原蛋白的α3链的基因(Col4a3)中有突变、在编码IV型胶原蛋白的α4链的基因(Col4a4)中有突变或在编码IV型胶原蛋白的α5链的基因(Col4a5)中有突变。在某些实施方案中，所述受试者是男性。在某些实施方案中，所述受试者是女性。
在某些实施方案中，所述受试者的肾功能受损。在某些实施方案中，所述受试者需要改善肾功能。在某些实施方案中，所述受试者鉴定为肾功能受损。在某些实施方案中，所述受试者鉴定为患有血尿。在某些实施方案中，所述受试者鉴定为患有蛋白尿。
在本文提供的任何实施方案中，受试者可以经受某些测试以评估肾功能。此类测试包括但不限于受试者的血尿素氮的测量；测量受试者血液中的肌酸酐；测量受试者血液中的肌酸酐清除率；测量受试者的蛋白尿；测量受试者的白蛋白:肌酸酐比；测量受试者的估计的肾小球滤过率；以及测量受试者的尿排出量。
在某些实施方案中，所述受试者的足细胞尿是通过分析受试者尿液中的足细胞数目和足细胞特异性mRNA来评估。
在本文提供的任何实施方案中，尿液或血液中存在的蛋白质可以用于评估肾功能。肾功能的此类测试包括但不限于测量受试者尿液中的N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷酶(NAG)蛋白质；测量受试者尿液中的嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)蛋白质；测量受试者尿液中的肾损伤分子-1(KIM-1)蛋白质；测量受试者尿液中的白细胞介素-18(IL-18)蛋白质；测量受试者尿液中的***生长因子(CTGF)水平；测量受试者尿液中的单核细胞趋化蛋白1(MCP1)水平；测量受试者尿液中的胶原蛋白IV(Col IV)片段；测量受试者尿液中的胶原蛋白III(Col III)片段水平；测量受试者血液中的胱抑素C蛋白质；测量受试者血液中的β-微量蛋白(BTP)；以及测量受试者血液中的2-微球蛋白(B2M)。在本文提供的任何实施方案中，可以在尿液中测量足细胞损伤的标记。此类蛋白质包括肾病蛋白(nephrin)和裂隙膜蛋白(podocin)。所述蛋白质可以使用可商购获得的试剂盒例如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA)进行定量。
在本文提供的任何实施方案中，靶向于miR-21的经修饰的寡核苷酸的给予改善受试者的肾功能的一种或多种标记。肾功能的标记的改善包括但不限于：受试者的血尿素氮减少；受试者血液中的肌酸酐减少；受试者的肌酸酐清除率改善；受试者的蛋白尿减少；受试者的白蛋白:肌酸酐比降低；受试者的估计的肾小球滤过率改善；和/或受试者的尿排出量增加。
某些药物组合物
本文提供了包含经修饰的寡核苷酸或其药学上可接受的盐的药物组合物，所述经修饰的寡核苷酸由19个连接的核苷组成并且具有结构5’-AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE-3’(SEQ ID NO:3)，其中后面不带下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷；后面带有下标“E”的核苷是2’-MOE核苷；后面带有下标“S”的核苷是S-cEt核苷，并且每个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
在一些此类实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸以其十八钠盐形式存在于药物组合物中。除非另外指示，否则所述经修饰的寡核苷酸5’-AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE-3’(SEQ ID NO:3)的重量和剂量是基于所述经修饰的寡核苷酸的十八钠盐形式的重量。作为非限制性例子，110mg经修饰的寡核苷酸的十八钠盐形式相当于103.6mg经修饰的寡核苷酸的游离酸形式。
在某些实施方案中，制备药物组合物用于注射。在某些实施方案中，制备用于注射的药物组合物包含在无菌水溶液中的浓度为110mg/mL的经修饰的寡核苷酸。通过注射给予的合适途径包括皮下和静脉内注射。
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物以推注剂量单位的形式来给予。在一些实施方案中，所述推注剂量单位包含在无菌水溶液中的浓度为110mg的经修饰的寡核苷酸。在一些实施方案中，所述推注剂量单位包含在无菌的0.3％氯化钠水溶液中的浓度为110mg/ml的经修饰的寡核苷酸。在一些实施方案中，对于110mg经修饰的寡核苷酸的剂量，向受试者以包含110mg/ml经修饰的寡核苷酸的1mL推注剂量单位来给予。在某些实施方案中，所述给予是通过皮下注射。
在某些实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸作为无菌冻干的经修饰的寡核苷酸提供，其可以用合适的稀释剂(例如，水溶液如水或生理上相容的缓冲液如盐水溶液、汉克溶液和林格氏溶液)重构。经重构的产物可以作为皮下注射剂或作为静脉内输注剂来给予。经冻干的药物产物由经修饰的寡核苷酸组成，所述经修饰的寡核苷酸已经在注射用无菌水溶液中制备，在制备期间用酸或碱调节至pH 7.0-9.0，然后冻干。经冻干的药物产物可以包装在2mL的I型透明玻璃小瓶中，用橡胶盖塞住并且用铝制顶封密封。
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物可以按其本领域确定的使用水平另外含有药物组合物中常规发现的其他辅助组分。因此，例如，所述组合物可以含有另外的相容的药学活性材料，例如像止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂。
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物含有一种或多种赋形剂。在某些此类实施方案中，赋形剂选自水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、淀粉酶、硬脂酸镁、滑石粉、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。
某些另外的疗法
奥尔波特综合征的治疗可以包括给予本文提供的抗miR-21经修饰的寡核苷酸和至少一种另外的疗法。在某些实施方案中，所述至少一种另外的疗法包括药剂。
在某些实施方案中，在给予所述第一剂量的经修饰的寡核苷酸之前，患有奥尔波特综合征的所述受试者已经用另外的疗法的稳定给药方案治疗至少30天。在某些实施方案中，所述受试者正在接受血管紧张素II受体阻滞剂的稳定给药方案。在某些实施方案中，所述受试者正在接受血管紧张素II转化酶抑制剂的稳定给药方案。
在某些实施方案中，所述至少一种另外的疗法包括药剂。
在某些实施方案中，药剂包括血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)。在某些实施方案中，血管紧张素II受体阻滞剂是坎地沙坦、厄贝沙坦、奥美沙坦、氯沙坦、缬沙坦、替米沙坦或依普沙坦。
在某些实施方案中，药剂包括血管紧张素II转化酶(ACE)抑制剂。在某些实施方案中，ACE抑制剂是卡托普利、依那普利、赖诺普利、苯那普利、喹那普利、福辛普利或雷米普利。
在某些实施方案中，药剂是抗高血压剂。抗高血压剂用于控制所述受试者的血压。
在某些实施方案中，药剂是维生素D类似物。维生素D类似物可以用于限制所述受试者体内副甲状腺素的产生。
在某些实施方案中，药剂是减少膳食磷酸盐吸收的口服磷酸盐粘结剂。
在某些实施方案中，药剂包括免疫抑制剂。在某些实施方案中，免疫抑制剂是皮质类固醇、环磷酰胺或霉酚酸酯。
在某些实施方案中，药剂是环孢菌素、HMG-辅酶A抑制剂、血管肽酶抑制剂或TGF-β拮抗剂。
在某些实施方案中，另外的疗法是基因疗法。在某些实施方案中，所述基因疗法提供正常的Col4a3基因。在某些实施方案中，所述基因疗法提供正常的Col4a4基因。在某些实施方案中，所述基因疗法提供正常的Col4a5基因。
在某些实施方案中，另外的疗法是透析。在某些实施方案中，另外的疗法是肾移植。
在某些实施方案中，药剂是醛固酮拮抗剂。在某些实施方案中，醛固酮拮抗剂是螺内酯。
在某些实施方案中，药剂包括抗炎剂。在某些实施方案中，抗炎剂是甾体抗炎剂。在某些实施方案中，类固醇抗炎剂是皮质类固醇。在某些实施方案中，皮质类固醇是***。在某些实施方案中，抗炎剂是非甾体抗炎药。在某些实施方案中，非甾体抗炎剂是布洛芬、COX-I抑制剂或COX-2抑制剂。
在某些实施方案中，药剂是阻断对纤维发生信号的一种或多种反应的药剂。
在某些实施方案中，药剂包括抗糖尿病剂。抗糖尿病剂包括但不限于双胍类、葡糖苷酶抑制剂、胰岛素、磺酰脲类和噻唑烷二酮类。
某些修饰
本文提供的经修饰的寡核苷酸包含糖-修饰的核苷和经修饰的核苷间键。
由于期望的特性，例如像增强的细胞摄取、对其他寡核苷酸或核酸靶标增强的亲和力以及在核酸酶存在下增强的稳定性，可以选择优于未经修饰的形式的经修饰的核碱基、糖和/或核苷间键。
糖-修饰的核苷包括双环糖部分。在某些此类实施方案中，双环糖部分是α构型的D糖。在某些此类实施方案中，双环糖部分是β构型的D糖。在某些此类实施方案中，双环糖部分是α构型的L糖。在某些此类实施方案中，双环糖部分是β构型的L糖。
包含此类双环糖部分的核苷称为双环核苷或BNA。在某些实施方案中，双环核苷包括但不限于(A)α-L-亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)BNA；(B)β-D-亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)BNA；(C)乙烯氧基(4’-(CH2)2-O-2’)BNA；(D)氨氧基(4’-CH2-O-N(R)-2’)BNA；(E)氧氨基(4’-CH2-N(R)-O-2’)BNA；(F)甲基(亚甲基氧基)(4’-CH(CH3)-O-2’)BNA(也称为受约束的乙基或cEt)；(G)亚甲基-硫代(4’-CH2-S-2’)BNA；(H)亚甲基-氨基(4’-CH2-N(R)-2’)BNA；(I)甲基碳环(4’-CH2-CH(CH3)-2’)BNA；(J)c-MOE(4’-CH2-OMe-2’)BNA和(K)丙烯碳环(4’-(CH2)3-2’)BNA，如以下所描绘。
其中Bx是核碱基部分并且R独立地是H、保护基团或C1-C12烷基。
在某些实施方案中，2’-修饰的核苷包含选自F、OCF3、O-CH3、OCH2CH2OCH3、2’-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(CH3)2、-O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2和O-CH2-C(＝O)-N(H)CH3的2’-取代基。
在某些实施方案中，2’-修饰的核苷包含选自F、O-CH3和OCH2CH2OCH3的2’-取代基。
在某些实施方案中，糖-修饰的核苷是4’-硫代修饰的核苷。在某些实施方案中，糖-修饰的核苷是4’-硫代-2’-修饰的核苷。4’-硫代修饰的核苷具有4’-O用4’-S替代的β-D-核糖核苷。4’-硫代-2’-修饰的核苷是2’-OH用2’-取代基替代的4’-硫代修饰的核苷。合适的2’-取代基包括2’-OCH3、2’-O-(CH2)2-OCH3和2’-F。
在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸包含一个或多个核苷间修饰。在某些此类实施方案中，经修饰的寡核苷酸的每个核苷间键是经修饰的核苷间键。在某些实施方案中，经修饰的核苷间键包含磷原子。
在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷间键。在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸的每个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
某些试剂盒
本发明还提供了试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含本文提供的抗miR-21经修饰的寡核苷酸。在一些实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸可以存在于小瓶内。多个(如10个)小瓶可以存在于例如分配包装中。在一些实施方案中，制造所述小瓶以便用注射器可进入。所述试剂盒还可以含有使用所述经修饰的寡核苷酸的说明书。
在一些实施方案中，所述试剂盒可以用于所述经修饰的寡核苷酸的给予。在此类情况下，除所述经修饰的寡核苷酸外，所述试剂盒还可以包含以下中的一种或多种：注射器、酒精拭子、棉球和/或纱布垫。在一些实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸可以存在于预填充的注射器(如具有例如27号1/2英寸针头带有针套的单剂量注射器)中，而不是存在于小瓶中。多个(如10个)预填充的注射器可以存在于例如分配包装中。所述试剂盒还可以含有给予所述经修饰的寡核苷酸的说明书。
某些实验模型
在某些实施方案中，本发明提供了在实验模型中使用和/或测试本发明的经修饰的寡核苷酸的方法。本领域技术人员能够选择和修改用于此类实验模型的方案以评估本发明的药剂。
通常，首先在经培养的细胞中对经修饰的寡核苷酸进行测试。合适的细胞类型包括与在体内需要将经修饰的寡核苷酸递送到的细胞类型相关的那些。例如，用于研究本文所述的方法的合适的细胞类型包括原代的或经培养的细胞。
在某些实施方案中，在经培养的细胞中评估经修饰的寡核苷酸干扰miR-21活性的程度。在某些实施方案中，miR-21活性的抑制可以通过测量细胞或组织中miR-21的水平来评估。可替代地，可以测量预测的或验证的微小RNA调控的转录物的水平。对miR-21活性的抑制可能导致miR-21调控的转录物和/或miR-21调控的转录物编码的蛋白质增加。此外，在某些实施方案中，可以测量某些表型结果。
熟练技术人员可用几种动物模型在人类疾病模型中进行miR-21研究。例如，可在奥尔波特综合征的实验模型(例如Col4a3基因敲除小鼠(Col4a3-/-小鼠))中研究miR-21抑制剂。小鼠模型中疾病的严重程度取决于携带Col4a3突变的小鼠的遗传背景。例如，相对于C57BL/6J背景，在129X1/SvJ上疾病的发作和进展通常更快。因此，可选择Col4a3-/-小鼠的遗传背景以改变疾病的发作和进展。另外的模型包括X连锁、常染色体隐性或常染色体显性奥尔波特综合征的犬模型。参见例如，Kashtan,Nephrol.Dial.Transplant,2002,17:1359-1361。
某些定量测定
在给予经修饰的寡核苷酸之后，对miR-21的反义抑制作用可以通过本领域已知的多种方法来评估。在某些实施方案中，这些方法用于在体外或在体内定量细胞或组织中的微小RNA水平。在某些实施方案中，通过微阵列分析测量微小RNA水平的变化。在某些实施方案中，微小RNA水平的变化是通过几种可商购获得的PCR测定之一(如
靶标接合测定
抗miR或微小RNA模拟物对微小RNA活性的调节可以通过测量靶标接合来评估。在某些实施方案中，靶标接合是通过mRNA的微阵列分析来测量。针对微小RNA种子序列搜索通过抗miR或微小RNA模拟物调节(增加或减少)的mRNA的序列，以比较作为微小RNA的靶标的mRNA的调节与不作为微小RNA的靶标的mRNA的调节。以此种方式，可以评估抗miR与miR-21或miR-21模拟物与其靶标的相互作用。在抗miR的情况下，针对包含与抗miR所互补的微小RNA的种子匹配的mRNA序列对表达水平升高的mRNA进行筛选。
实施例
为了更充分地说明本发明的一些实施方案，呈现以下实施例。然而，它们绝不应理解为对本发明的宽范围的限制。
本领域普通技术人员在不背离本发明的精神的情况下将容易地采用此发现的基本原理来设计多种化合物。
实施例1：患有奥尔波特综合征的受试者的2期研究
所述研究是在多个研究中心在患有奥尔波特综合征的受试者中进行的一项随机、双盲、安慰剂对照、多中心2期研究。奥尔波特综合征是一种由编码毛细血管基底膜胶原蛋白IV的基因的突变引起的遗传形式的肾脏疾病。随着时间的流逝，奥尔波特综合征对肾脏造成损害。
所述研究药物是RG-012。通过临床试验注册中心公开的RG-012的先前剂量方案是每周110mg和每周220mg的固定剂量。对来自临床前模型中多个物种以及来自多递增剂量研究中健康志愿者的药代动力学数据的分析表明，以每两周一次的低频繁间隔给予的1.5mg/kg的基于体重的剂量将是既有效又适当安全的剂量方案。
RG-012中的活性成分(AI)是19个碱基的单链的化学修饰的寡核苷酸的十八钠盐，其结构为：
5’-AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE-3’(SEQ ID NO:3)，其中后面不带下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷；后面带有下标“E”的核苷是2’-MOE核苷；后面带有下标“S”的核苷是S-cEt核苷，并且每个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
将RG-012配制成含有0.3％氯化钠的AI的水溶液，并且每两周一次通过皮下(SC)途径给予。
在一些情况下，主要的活性代谢物(AM)缺少3’末端2’-MOE修饰的“A”核苷：
5’-AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCST-3’(SEQ ID NO:4)，其中后面不带下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷；后面带有下标“E”的核苷是2’-MOE核苷；后面带有下标“S”的核苷是S-cEt核苷，并且每个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
主要目的是评估每周给予持续48周时RG-012的安全性和耐受性。安全性和耐受性是通过诸如不良事件、实验室参数、生命体征、ECG和注射部位反应等变量来评估。
次要目的包括：
·评估RG-012对其他选择的血液、尿液和肾生物标记的影响；
·评估在给予RG-012后母体化合物(AI)及其活性主要代谢物(AM)的药代动力学(PK)参数；
·评估在给予RG-012后抗药物抗体(ADA)的潜在形成；
·评估RG-012对减轻肾功能随时间减退的初步功效；
·使用Short Form 36Health
双盲、安慰剂对照治疗期-将符合条件的受试者以1:1:1的比率随机分配，以接受两周一次(每两周)皮下(SC)注射RG-012 1.5mg/kg或安慰剂，持续48周。
基于耐受性，研究者可以将个体受试者两周一次的RG-012剂量降低至0.75mg/kg。基于研究者的判断，两周一次的RG-012剂量已经降低至0.75mg/kg的受试者也可能将其剂量重新调整回1.5mg/kg。
服用血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂或血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)的受试者以稳定剂量和方案维持这些药剂持续积极治疗期的持续时间。在研究期间，所有其他伴随的用药也以稳定给药方案维持。
开放标签扩展期-完成48周治疗的受试者有资格针对征募进所有受试者均接受积极治疗的48周扩展研究进行筛选。
随访期-完成研究治疗后，所有受试者将进入治疗后12周的随访期，其将包括在随访第2周进行简短的家庭访视、在随访第4周进行家庭访视以及在随访第12周进行现场访视。完成双盲、安慰剂对照治疗期但是未进入开放标签治疗扩展期的受试者将直接进入治疗后随访期。
入选标准：
1.18至65岁(包含端值)的男性受试者
2.确诊奥尔波特综合征(临床、组织病理学和/或遗传诊断)
3.如用慢性肾脏病流行病学合作研究(CKD-EPI)肌酸酐或肌酸酐-胱抑素C公式估计的，必须满足以下eGFR标准：
a.eGFR的初始筛选测量值在40和90ml/min/1.73m2之间；
b.基于前52周≥4eGFR测量值的线性回归斜率分析，eGFR下降≥5mL/min/1.73m2/年。eGFR下降≥5mL/min/1.73m2/年等于≤-5mL/min/1.73m2/年的eGFR斜率。使用线性回归计算eGFR斜率或受试者的eGFR随时间的变化。
4.初步筛选和基线访视时蛋白尿≥300mg蛋白质/g肌酸酐
不具有足够数量的先前eGFR测量值以允许计算eGFR斜率的受试者可以有资格参加所述研究，如果他们是男性、诊断为患有XLAS并且年龄在18至30岁(包含端值)的话。
服用ACE抑制剂和/或ARB的受试者必须在筛选之前接受ACE抑制剂和/或ARB的稳定给药方案≥30天。
排除标准：
1.除奥尔波特综合征以外的慢性肾脏疾病的原因(包括但不限于糖尿病肾病、高血压肾病、狼疮、IgA肾病)。
2.如通过正在进行的透析疗法或肾移植史证明为ESRD。
3.负责的临床研究者认为的可能使受试者不太可能完成研究或遵守研究程序和要求，或者可能对受试者的安全和健康构成风险的任何其他状况或情况。
药效学终点包括药效学和生物标记终点随时间的变化，包括：
·血尿素氮[BUN]；
·尿液中的蛋白质/白蛋白比和白蛋白/肌酸酐比；
·血清和尿液两者中的肌酸酐、胱抑素C、肾损伤分子-1[KIM-1]、β-2微球蛋白和丛集素；
·血清和尿液两者中的不对称二甲基精氨酸(ADMA)、转化生长因子-β(TGFβ)、***生长因子(CTGF)和嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)；
·尿液中的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、钙结合蛋白、白细胞介素-18(IL-18)和表皮生长因子(EGF)；
·以及如通过分析尿液中的足细胞数目和足细胞特异性mRNA测量的足细胞尿。
药代动力学终点包括母体化合物(AI)及其活性代谢物(AM)的血药浓度和计算的PK参数。
功效终点包括：
·从基线到第24、48和96周的估计的肾小球滤过率(eGFR)的线性回归斜率；
·从基线到第24、48和96周的eGFR值的绝对和百分比变化；
·基于以下定义，从基线到第24、48和96周对治疗有反应的受试者的比例：
οeGFR斜率>-2mL/min/1.73m2/年
οeGFR斜率>-5mL/min/1.73m2/年
οeGFR斜率>-10mL/min/1.73m2/年
οeGFR斜率>-15mL/min/1.73m2/年；
·基于以下定义，从基线到第24、48和96周对治疗有反应的受试者的比例：
ο相对于基线，eGFR值减少<5％
ο相对于基线，eGFR值减少<10％
ο相对于基线，eGFR值减少<20％
ο相对于基线，eGFR值减少<30％；
·筛选期和治疗期之间eGFR斜率的差异；
·如通过eGFR≤15mL/min/1.73m2或开始血液透析或肾移植定义的达到终末期肾病(ESRD)的受试者的数目和比例；以及
·如使用Short Form 36 Health
预期每两周一次向患有奥尔波特综合征的受试者给予的1.5mg/kg的RG-012剂量提供了适当的安全系数，并且导致疗效终点改善，例如维持肾功能或肾功能改善。
实施例2：肾小球滤过率的计算
美国肾脏基金会提供了由慢性肾脏病流行病学合作研究(CKD-EPI)开发的几个公式，以计算受试者的估计的肾小球滤过率(eGFR)。这些公式中的一个或多个用于测量筛选并且参与本文所述的2期研究的受试者的eGFR。
CKD-EPI肌酸酐公式(2009)
表示为单个公式：eGFR＝141x min(SCr/κ,1)αx max(SCr/κ,1)-1.209x 0.993年龄x1.018[如果是女性]x 1.159[如果是非洲裔美国人]
缩写/单位
eGFR(估计的肾小球滤过率)＝mL/min/1.73m2
SCr(血清肌酸酐)＝mg/dL
Scys(归一化血清胱抑素C)＝mg/l
κ＝0.7(女性)或0.9(男性)
α＝-0.248(女性)或-0.207(男性)
min(SCr/κ或1)＝表示SCr/κ的最小值或1
max(SCr/κ或1)＝表示SCr/κ的最大值或1
min(Scys/0.8,1)＝表示Scys/0.8,1的最小值
max(Scys/0.8,1)＝表示Scys/0.8,1的最大值
年龄＝岁。
CKD-EPI肌酸酐-胱抑素公式(2012)
表示为单个公式：eGFR＝135×min(SCr/κ,1)α×max(SCr/κ,1)-0.601×min(Scys/0.8,1)-0.375max(Scys/0.8,1)-0.711×0.995年龄×0.969[如果是女性]×1.08[如果是非洲裔美国人]
缩写/单位
eGFR(估计的肾小球滤过率)＝mL/min/1.73m2
SCr(归一化血清肌酸酐)＝mg/dL
κ＝0.7(女性)或0.9(男性)
α＝-0.329(女性)或-0.411(男性)
min＝表示SCr/κ的最小值或1
max＝表示SCr/κ的最大值或1
年龄＝岁。
实施例3：1期活检研究
所述研究是向患有奥尔波特综合征的受试者给予RG-012的安全性、药效学和药代动力学的1期研究。在此项开放标签研究期间，所有符合条件的受试者都将接受RG-012。所述研究由两个部分(A部分和B部分)组成。在A部分中，一半的参与者将接受单剂量的RG-012，并且一半的参与者将接受4个剂量的RG-012(每隔一周一个剂量，持续6周)。所有受试者都将进行两次肾活检，一次是接受RG-012之前，并且一次是接受RG-012之后，以评估RG-012对肾脏的影响。完成A部分后，受试者将能够进入所述研究的B部分。在B部分中，所有受试者都将每隔一周接受RG-012，持续48周。
主要结果度量包括：
·发病率和不良事件的严重程度；以及
·RG-012对肾miR-21的影响。
次要结果度量包括：
·药代动力学(PK)参数-Cmax(观察到的最大血药浓度)
·药代动力学(PK)参数-Tmax(达到观察到的最大血药浓度的时间)
·药代动力学(PK)参数-AUC(血药浓度与时间曲线下面积)
入选标准：
1.男性或女性，年龄18岁至65岁
2.确诊奥尔波特综合征
3.eGFR在40和90mL/min/1.73m2之间
4.蛋白尿为至少300mg蛋白质/g肌酸酐
5.对于服用ACE抑制剂或ARB的受试者，给药方案应该在筛选之前稳定至少30天。
6.愿意遵守避孕要求。
排除标准：
1.除奥尔波特综合征以外的慢性肾脏疾病的原因(如糖尿病肾病、高血压肾病、狼疮性肾炎或IgA肾病)
2.如通过正在进行的透析疗法或肾移植史证明为终末期肾病(ESRD)
3.可能对受试者的安全和健康构成风险的任何其他状况
4.怀孕或哺乳的女性受试者
主要结果度量包括：
·发病率和不良事件的严重程度；以及
·RG-012对肾miR-21的影响。
次要结果度量包括：
·药代动力学(PK)参数-Cmax(观察到的最大血药浓度)
·药代动力学(PK)参数-Tmax(达到观察到的最大血药浓度的时间)
·药代动力学(PK)参数-AUC(血药浓度与时间曲线下面积)
在此项研究中，在第一剂量的RG-012之前和最终剂量的RG-012之后，对受试者进行肾脏活检。收集血液样品。将RNA从肾脏中分离，并且测量miR-21水平。在血液和肾脏组织中测量RG-012水平。可以测量miR-21调控的mRNA转录物。
预期每两周一次的1.5mg/kg的剂量提供了在肾脏中足够水平的RG-012以接合(即，抑制)miR-21。
序列表
<110> 莱古路斯治疗法股份有限公司(REGULUS THERAPEUTICS INC.)
<120> 用于治疗奥尔波特综合征的方法
<130> 01138-0037-00PCT
<150> US 62/501,699
<151> 2017-05-04
<160> 4
<170> PatentIn 版本3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 2
<211> 72
<212> RNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 2
ugucggguag cuuaucagac ugauguugac uguugaaucu cauggcaaca ccagucgaug 60
ggcugucuga ca 72
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (13)..(13)
<223> RNA
<400> 3
acatcagtct gauaagcta 19
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (13)..(13)
<223> RNA
<400> 4
acatcagtct gauaagct 18
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