具体实施方式

本文描述了用于优先性和/或选择性检测和/或定量靶标RNA(相对于DNA)的方法、试剂盒和反应混合物。特别地，提供了用于优先性和/或选择性地检测和/或定量靶标RNA的聚合酶、dNTP(包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP和dITP)、引物和探针，以及含有此类试剂的制品或试剂盒。此外，该技术还可用于血液筛查和预后。

如本文所用，术语“扩增”是指合成与模板核酸分子(例如核酸分子，例如来自HBV基因组的RNA)的一条或两条链互补的核酸分子的过程。扩增核酸分子通常包括使模板核酸变性，在低于引物解链温度的温度将引物与模板核酸退火，以及从引物酶促延伸以产生扩增产物。扩增通常需要存在脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶(例如，Taq)和适当的缓冲液和/或聚合酶最佳活性的辅助因子(例如，MgCl₂和/或KCl)。

本文所用术语“引物”为本领域的熟练专家所知，且指能够引发通过模板依赖性DNA聚合酶的DNA合成的寡聚化合物，主要指寡核苷酸，但也指经修饰的寡核苷酸，即例如引物的3′末端提供游离的3′-OH基团，另外“核苷酸”可以通过模板依赖性DNA聚合酶建立3′至5′磷酸二酯键与其连接，由此使用脱氧核苷三磷酸且由此释放焦磷酸盐。

术语“杂交”是指一种或多种探针与扩增产物的退火。“杂交条件”通常包括低于探针的解链温度但避免探针的非特异性杂交的温度。

术语“5′到3′核酸酶活性”是指核酸聚合酶的活性，通常与核酸链合成相关，由此从核酸链的5′末端去除核苷酸。

术语“热稳定的聚合酶”是指热稳定的聚合酶，即为催化与模板互补的引物延伸产物的形成并且当处于升高的温度经历实现双链模板核酸变性所需的时间时没有不可逆地变性的酶。通常，合成在每个引物的3′末端处起始，并且沿着模板链以5′至3′方向前进。已从黄栖热菌(Thermus flavus)、红栖热菌(T.ruber)、嗜热栖热菌(T.thermophilus)、水生栖热菌(T.aquaticus)、乳栖热菌(T.lacteus)、红色栖热菌(T.rubens)、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)和炽热甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)分离出热稳定的聚合酶。然而，非热稳定的聚合酶也可用于PCR测定中，条件是补充该酶(如果必要)。

术语“其补体”是指与给定核酸具有相同长度并且与其完全互补的核酸。

当用于核酸时，术语“延伸”或“伸长”是指额外的核苷酸(或其他类似分子)掺入核酸时。例如，核酸任选地被掺入核苷酸的生物催化剂延伸，例如通常在核酸的3′末端添加核苷酸的聚合酶。

如本文所用，术语“相同”或百分比“同一性”指在两个或更多核酸序列的背景下，当对最大对应性比较和对准(例如，使用熟练人员可用的序列比较算法或通过目测来测量)时，两个或更多序列或子序列是相同的或具有特定百分比的相同核苷酸。适合确定序列同一性和序列相似性的示例性算法是BLAST程序，描述于例如Altschul et al.(1990)“Basiclocal alignment search tool”J.Mol.Biol.215：403-410，Gish et al.(1993)“Identification of protein coding regions by database similarity search”Nature Genet.3：266-272，Madden et al.(1996)“Applications of network BLASTserver”Meth.Enzymol.266：131-141，Altschul et al.(1997)“Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs”Nucleic AcidsRes.25：3389-3402，和Zhang et al.(1997)“PowerBLAST：A new network BLASTapplication for interactive or automated sequence analysis and annotation”Genome Res.7：649-656，其各自通过引用并入本文。

寡核苷酸上下文中的“修饰的核苷酸”是指这样的改变，其中寡核苷酸序列的至少一个核苷酸被不同的核苷酸替换，为寡核苷酸提供所需的特性。可在本文所述的寡核苷酸中被取代的示例性修饰核苷酸包括例如叔丁基苄基、C5-甲基-dC、C5-乙基-dC、C5-甲基-dU、C5-乙基-dU、2，6-二氨基嘌呤、C5-丙炔基-dC、C5-丙炔基-dU、C7-丙炔基-dA、C7-丙炔基-dG、C5-炔丙基氨基-dC、C5-炔丙基氨基-dU、C7-炔丙氨基-dA、C7-炔氨基-dG、7-脱氮-2-脱氧-黄苷、吡唑并嘧啶类似物、假-dU、硝基吡咯、硝基吲哚、2′-0-甲基核糖-U、2′-0-甲基核糖-C、N4-乙基-dC、N6-甲基-dA、5-丙炔基dU、5-丙炔基dC、7-脱氮-脱氧鸟苷(脱氮G(u-脱氮))等。可以在寡核苷酸中取代的许多其他修饰的核苷酸在本文中提及或在本领域中另外已知。在某些实施例中，相对于相应的未修饰寡核苷酸的解链温度，修饰的核苷酸取代改变了寡核苷酸的解链温度(T_m)。为了进一步说明，在一些实施例中，某些修饰的核苷酸取代可以减少非特异性核酸扩增(例如，最小化引物二聚体的形成等)、增加预期靶标扩增子的产率等。这些类型的核酸修饰的实例描述于例如美国专利号6,001,611，其通过引用并入本文。其他修饰的核苷酸取代可以改变寡核苷酸的稳定性，或提供其他所需的特征。

术语“探针”是指合成或生物产生的核酸(DNA或RNA)，其通过设计或选择包含特定核苷酸序列，允许它们在定义的预定严格性下特异性(即优先性和/或选择性地)杂交到“靶标核酸”，在本例中为RNA(靶标)核酸。“探针”可以称为“检测探针”，意思是它检测靶标核酸。

在一些实施例中，所述探针可以用至少一种荧光标记物进行标记。在一个实施例中，探针可以用供体荧光部分(例如荧光染料)和相应的受体部分(例如淬灭剂)标记。

设计用作探针的寡核苷酸可以以类似于设计引物的方式进行。实施例可以使用单个探针或一对探针来检测扩增产物。根据实施例，使用的探针可包含至少一种标记和/或至少一种淬灭剂部分。与引物一样，探针通常具有相似的解链温度，每个探针的长度必须足以发生序列特异性杂交，但不能太长以至于在合成过程中保真度降低。寡核苷酸探针的长度通常为15至40(例如，16、18、20、21、22、23、24或25)个核苷酸。

聚合酶链式反应(PCR)

美国专利号4,683,202、4,683,195、4,800,159和4,965,188公开了常规的PCR技术。PCR通常采用两个寡核苷酸引物，其与所选核酸模板(例如DNA或RNA)结合。在一些实施例中有用的引物包括能够作为所述RNA靶标核酸序列内的核酸合成起始点的寡核苷酸。引物可以通过常规方法从限制性消化物中纯化，或它可以合成产生。为了扩增中的最大效率，引物优先为单链的，但引物可以是双链的。首先将双链引物变性即处理以分离链。使双链核酸变性的一种方法是通过加热。

如果模板核酸是双链的，则必须在它可以用作PCR中的模板前分离两条链。链分离可以通过任何合适的变性方法完成，包括物理、化学或酶促方法。分离核酸链的一种方法涉及加热核酸直至它多数变性(例如，大于50％、60％、70％、80％、90％或95％变性)。用于使模板核酸变性必需的加热条件将取决于例如缓冲液盐浓度以及变性核酸的长度和核苷酸组成，但通常范围在约90℃至约105℃，持续取决于反应特征(诸如温度和核酸长度)的一段时间。变性通常进行约30秒至4分钟(例如，1分钟至2分钟30秒、或1.5分钟)。

如果双链模板核酸通过加热变性，则允许反应混合物冷却至促进每个引物退火至其靶标序列的温度。退火温度通常为约35℃至约65℃(例如，约40℃至约60℃；约45℃至约50℃)。退火时间可为约10秒至约1分钟(例如，约20秒至约50秒；约30秒至约40秒)。然后将反应混合物调整至聚合酶的活性得到促进或最佳化的温度，即足以使延伸从退火引物发生，以生成与模板核酸互补的产物的温度。温度应足以从退火至核酸模板的每个引物合成延伸产物，但不应如此高，以使延伸产物变性脱离其互补模板(例如用于延伸的温度通常范围为约40℃至约80℃(例如约50℃至约70℃；约60℃))。延伸时间可为约10秒至约5分钟(例如，约30秒至约4分钟；约1分钟至约3分钟；约1分钟30秒至约2分钟)。

PCR测定可以使用核酸，例如RNA或DNA(cDNA)。模板核酸不需要纯化；它可能是复杂混合物的一小部分，例如人类细胞中包含的靶标RNA。靶标RNA核酸分子可以通过常规技术从生物学样品中提取，例如以下中描述的那些：Diagnostic Molecular Microbiology：Principles and Applications(Persing et al.编，1993，American Society forMicrobiology，Washington D.C.).核酸可以从许多来源获得，例如质粒，或天然来源，包括细菌、酵母、病毒、细胞器或高等生物，例如植物或动物。

寡核苷酸引物与在诱导引物延伸的反应条件下的PCR试剂组合。这种PCR试剂包括但不限于一种或多种聚合酶和dNTP(包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP和dITP)。例如，链延伸反应通常包括50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 8.3)、15mM MgCl₂、0.001％(w/v)明胶、0.5-1.0μg变性模板DNA、每个寡核苷酸引物50pmol、2.5U Taq聚合酶和10％DMSO)。反应通常含有150至320μM的dATP、dCTP、dTTP、dGTP和dITP中的每一种，或其一种或多种类似物。

新合成的链形成双链分子，可用于反应的后续步骤。链分离、退火和延伸步骤可以根据需要重复多次，以产生所需数量的对应于靶标RNA核酸分子的扩增产物。反应中的限制因素是反应中存在的引物、热稳定酶和核苷三磷酸的量。循环步骤(即变性、退火和延伸)优先重复至少一次。对于在检测中的使用，循环步骤的数目将取决于例如样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物，则将需要更多循环步骤以扩增足以检测的靶标序列。通常，循环步骤重复至少约20次，但可以重复多达40、60或甚至100次。

荧光共振能量转移(FRET)

FRET技术(例如，参见美国专利号4,996,143、5,565,322、5,849,489和6,162,603)基于这样一个概念：当供体荧光部分和相应的受体荧光部分位于彼此相距一定距离内时，能量转移发生在两个荧光部分之间，这可以可视化或以其他方式检测和/或定量。当供体被具有合适波长的光辐射激发时，供体通常将能量转移至受体。受体通常以具有不同的波长的光辐射的形式重新发射转移的能量。在某些系统中，非荧光能量可以通过包括基本上非荧光供体部分的生物分子在供体和受体部分之间转移(参见，例如，美国专利第7,741,467号)。

在一个实例中，寡核苷酸探针可以包含供体荧光部分或染料(例如，HEX或FAM)和相应的淬灭剂(例如，BlackHole Quencher^TM(BHQ)(例如BHQ-2))，其可以是也可以不是荧光的，并以光以外的形式耗散传递的能量。当探针完整时，能量转移通常发生在供体和受体部分之间，使得来自供体荧光部分的荧光发射被受体部分淬灭。在聚合酶链式反应的延伸步骤期间，结合至扩增产物的探针由例如Taq聚合酶的5′至3′核酸酶活性切割，使得供体荧光部分的荧光发射不再淬灭。为此目的的示例性探针在例如美国专利号5,210,015、5,994,056和6,171,785中有所描述。常用的供体-受体对包括FAM-TAMRA对。常用的淬灭剂是DABCYL和TAMRA。常用的暗淬灭剂包括BlackHole Quenchers^TM(BHQ)(例如BHQ2)(BiosearchTechnologies，Inc.，Novato，Cal.)、Iowa Black^TM(Integrated DNA Tech.，Inc.，Coralville，Iowa)和BlackBerry^TMQuencher 650(BBQ-650)(Berry&Assoc.，Dexter，Mich.)。

在另一个实例中，各自含有荧光部分的两个寡核苷酸探针可以在特定位置与扩增产物杂交，特定位置由寡核苷酸探针与靶标RNA靶核酸序列的互补性决定。在寡核苷酸探针在适当位置与扩增产物核酸杂交后，产生FRET信号。杂交温度可在约35℃至约65℃的范围内持续约10秒至约1分钟。

荧光分析可以使用例如光子计数落射荧光显微镜系统(包含适当的二向色镜和用于监测特定范围的荧光发射的滤光片)、光子计数光电倍增管系统或荧光计来进行。可以使用氩离子激光器、高强度汞(Hg)弧光灯、氙气灯、光纤光源或其他适当过滤以在所需范围内激发的高强度光源进行激发，以启动能量转移或允许直接检测荧光团。

如本文所用的关于供体和相应受体部分的“对应”是指受体荧光部分或暗淬灭剂，其吸收光谱与供体荧光部分的发射光谱重叠。受体荧光部分的发射光谱的最大波长应比供体荧光部分的激发光谱的最大波长至少大100nm。因此，可以在它们之间产生有效的非辐射能量传递。

通常选择荧光供体和相应的受体部分用于(a)高效Foerster能量转移；(b)大的最终斯托克斯位移(＞100nm)；(c)将发射尽可能迁移到可见光谱的红色部分(＞600nm)中；(d)将发射迁移至比在供体激发波长激发产生的拉曼水荧光发射更高的波长。例如，可以选择在激光线附近具有最大激发(例如，氦-镉442nm或氩气488nm)、高消光系数、高量子产率和其荧光发射与相应受体荧光部分的激发光谱的良好重叠的供体荧光部分。可选择具有高消光系数、高量子产率、其激发与供体荧光部分的发射的良好重叠以及在可见光谱的红色部分(＞600nm)中的发射的相应受体荧光部分。

可在FRET技术中与各种受体荧光部分一起使用的代表性供体荧光部分包括荧光素、荧光黄、B-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸酯、荧光黄VS、4-乙酰氨基-4′-异硫基-氰酸茋-2，2′-二磺酸、7-二乙氨基-3-(4′-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素、琥珀酰亚胺1-芘丁酸酯和4-乙酰氨基-4′-异硫氰酸茋-2，2′-二磺酸衍生物。代表性受体荧光部分，取决于所用的供体荧光部分，包括LC Red 640、LC Red 705、Cy5、Cy5.5、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、四甲基罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明x异硫氰酸酯、异硫氰酸赤藓红、荧光素、二亚乙基三胺五乙酸盐或其他镧系离子的螯合物(例如铕或铽)。供体和受体荧光部分可以从例如Molecular Probes(Junction City，Oreg.)或Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)获得。

供体和受体荧光部分可以通过连接基臂连接到合适的探针寡核苷酸上。每个连接基臂的长度很重要，因为连接基臂会影响供体和受体荧光部分之间的距离。连接基臂的长度是以埃为单位的从核苷酸碱基到荧光部分的距离。通常，接头臂为约至约接头臂可以是WO 84/03285中所述的种类。WO 84/03285还公开用于将接头臂连接至特定核苷酸碱基，以及用于将荧光部分连接至接头臂的方法。

受体荧光部分，例如LC Red 640，可以与包含氨基连接基的寡核苷酸(例如，可从ABI(Foster City，CA)或Glen Research(Sterling，VA)获得的C6-氨基亚磷酰胺)组合以生产，例如LC Red 640标记的寡核苷酸。经常使用的将供体荧光部分(诸如荧光素)偶联至寡核苷酸的连接基包括硫脲连接基(FITC-衍生的，例如来自Glen Research或ChemGene(Ashland，Mass.)的荧光素-CPG′s)、酰胺连接基(荧光素-NHS-酯衍生的，诸如来自BioGenex(San Ramon，Calif.)的CX-荧光素-CPG)、或需要在寡核苷酸合成后偶联荧光素-NHS-酯的3′-氨基-CPGs。

靶标RNA扩增产物(扩增子)的检测和/或定量

本公开提供了用于优先性和/或选择性地检测和/或定量生物学样品或非生物学样品中的靶标RNA(相对于DNA)的方法。提供的方法避免了样品污染、假阴性和假阳性的问题。该方法包括进行至少一个循环步骤，包括使用一对或多对靶标RNA引物优先性和/或选择性地扩增来自样品的靶标RNA的一部分，以及FRET检测步骤。执行多个循环步骤，优选在热循环仪中。可以使用靶标RNA引物和探针优先性和/或选择性地检测和/或定量靶标RNA(相对于DNA)进行方法，其中靶标RNA的存在，并且靶标RNA的检测表明靶标RNA在样品中存在。

如本文所述，可以使用利用FRET技术的标记杂交探针检测扩增产物。一种FRET形式利用技术检测扩增产物的存在与否，从而检测靶标RNA的存在与否。技术使用一种单链杂交探针，其标记有例如一种荧光部分或染料(例如HEX或FAM)和一种淬灭剂(例如BHQ-2)，其可以是也可以不是荧光的。当第一荧光部分用合适波长的光激发时，吸收的能量根据FRET原理转移至第二荧光部分或暗淬灭剂。第二荧光部分通常是淬灭剂分子。在PCR反应的退火步骤中，标记的杂交探针与靶标DNA(即扩增产物)结合，并在随后的延伸阶段被例如Taq聚合酶的5′至3′核酸酶活性降解。因此，荧光部分和淬灭剂部分变得彼此空间上分离。因此，在不存在淬灭剂的情况下的第一荧光部分激发后，可以检测到来自第一荧光部分的荧光发射。举例来说，ABI7700序列检测系统(AppliedBiosystems)使用技术，并且适用于执行本文所述的用于优先性和/或选择性地检测和/或定量样品中的靶标RNA(相对于DNA)的方法。

也可以使用与FRET缀合的分子信标来检测使用实时PCR方法的扩增产物的存在。分子信标技术使用被第一荧光部分和第二荧光部分标记的杂交探针。第二荧光部分通常是淬灭剂，且荧光标记一般位于探针的每个末端处。分子信标技术使用具有允许二级结构形成(例如发夹)的序列的探针寡核苷酸。作为在探针内的二级结构形成的结果，当探针在溶液中时，两个荧光部分空间接近。在与靶标核酸(即扩增产物)杂交以后，探针的二级结构被破坏，并且荧光部分变得彼此分离，从而使得在用合适波长的光激发后，可以检测第一荧光部分的发射。

FRET技术的另一种常见形式是使用两个杂交探针。每个探针都可以用不同的荧光部分标记，并且通常设计为在靶标DNA分子(例如，扩增产物)中彼此非常接近地杂交。供体荧光部分，例如荧光素，在470nm处被仪器的光源激发。在FRET期间，荧光素将其能量转移到受体荧光部分，例如640(LC Red 640)或705(LC Red 705)。然后受体荧光部分发出更长波长的光，由仪器的光学检测系统检测。只有当荧光部分直接局部接近，并且当供体荧光部分的发射光谱与受体荧光部分的吸收光谱重叠时，有效的FRET才发生。发射信号的强度可以与原始靶标DNA/RNA分子的数量(例如，靶标RNA分子的数量)相关。如果发生靶标RNA的扩增并产生扩增产物，则杂交步骤产生基于探针对成员之间的FRET的可检测信号。

通常，FRET的存在表示样品中存在靶标RNA，FRET的不存在则表示样品中不存在靶标RNA。然而，样本采集不足、运输延迟、运输条件不当或使用某些采集拭子(海藻酸钙或铝轴)都是会影响测试结果的成功和/或准确性的条件。

可用于实施该方法的代表性生物学样品包括但不限于全血、呼吸道标本、尿液、粪便标本、血液标本、血浆、皮肤拭子、鼻拭子、伤口拭子、血培养物、皮肤、和软组织感染。生物学样品的收集和储存方法是本领域技术人员已知的。可以处理生物学样品(例如，通过本领域已知的核酸提取方法和/或试剂盒)以释放核酸(例如靶标RNA)，或者在某些情况下，生物学样品可以直接与PCR反应组分和合适的寡核苷酸接触。在一些例子中，生物学样品是全血。通常收集全血时，经常将其收集在含有抗凝剂(例如肝素、柠檬酸盐或EDTA)的容器中，这样可以将全血储存在合适的温度。然而，在这种情况下，全血中的核酸会发生大量降解。因此，将血液收集在将溶解、变性和稳定全血组分(包括核酸)的试剂中可能是有利的，例如核酸稳定溶液。在这种情况下，可以更好地保存和稳定核酸以用于后续的分离和分析，例如通过核酸测试，例如PCR。此类核酸稳定溶液是本领域众所周知的，包括但不限于，PCR培养基，其含有4.2M胍盐(GuHCl)和50mM Tris，pH为7.5。

样品可以通过任何设计用于在分析前充分保持和储存样品的方法或设备来收集。此类方法和设备在本技术领域中是众所周知的。在样品是生物学样品例如全血的情况下，该方法或装置可以包括血液收集容器。这种血液收集容器在本领域中是众所周知的，并且可以包括例如血液收集管。在许多情况下，使用这样的血液收集管可能是有利的，其中血液收集管在用于样品摄取的空间中处于压力之下，例如具有真空室的血液容器，例如真空血液收集管。这种具有真空室的血液收集管，例如真空血液收集管在本领域中是众所周知的。将血液收集在具有或不具有真空室的血液收集容器中可能是进一步有利的，该容器包含将溶解、变性和稳定全血组分(包括核酸)的溶液，例如核酸-稳定溶液，使得被抽取的全血立即接触血液收集容器中的核酸稳定溶液。

解链曲线分析是可包含在循环曲线中的附加步骤。解链曲线分析基于DNA/RNA在称为解链温度(T_m)的特征温度解链的事实，该温度定义为一半核酸双链体分离成单链时的温度。DNA/RNA的解链温度主要取决于其核苷酸组成。因此，富含G和C核苷酸的核酸分子比具有大量A和T核苷酸的核酸分子具有更高的Tm。通过检测信号丢失的温度，可以确定探针的解链温度。类似地，通过检测产生信号的温度，可以确定探针的退火温度。来自靶标RNA扩增产物的靶标RNA探针的解链温度可以确认样品中靶标RNA的存在或不存在。

在每个热循环仪运行中，也可以循环控制样品。阳性对照样品可以使用例如对照引物和对照探针扩增靶标核酸对照模板(不同于所述靶标基因的扩增产物)。阳性对照样品也可以扩增，例如，含有靶核酸分子的质粒构建体。此类质粒对照可在内部(例如，在样品内)扩增，或在与患者样品并排运行的单独样品中使用与用于检测预期靶标的相同的引物和探针进行扩增。此类对照是扩增、杂交和/或FRET反应成功或失败的指标。每个热循环仪运行还可以包括一个阴性对照，例如，缺少靶标模板DNA。阴性对照可以测量污染。这确保系统和试剂不会产生假阳性信号。因此，对照反应可以很容易地确定，例如，引物以序列特异性退火和启动延伸的能力，以及探针以序列特异性杂交和发生FRET的能力。

在一个实施例中，该方法包括避免污染的步骤。例如，美国专利号5,035,996、5,683,896和5,945,313中描述了一种利用尿嘧啶-DNA糖基化酶的酶促方法，以减少或消除一次热循环仪运行和下一次运行之间的污染。

可以使用结合FRET技术的常规PCR方法来实践这些方法。在一个实施例中，使用仪器。以下专利申请描述了如技术中使用的实时PCR：WO 97/46707、WO 97/46714和WO 97/46712。

可以使用PC工作站进行操作，并且可以使用Windows NT操作系统。当机器将毛细管按顺序放置在光学单元上时，可以获得来自样品的信号。软件可以在每次测量后立即实时显示荧光信号。荧光采集时间为10-100毫秒(msec)。在每个循环步骤之后，荧光与循环次数的定量显示可以针对所有样品不断更新。生成的数据可以存储以供进一步分析。

作为FRET的替代，使用双链DNA结合染料诸如荧光DNA结合染料(例如，Green或Gold(Molecular Probes))，可以检测扩增产物。在与双链核酸相互作用时，这样的荧光DNA结合染料在用合适波长的光激发后发射荧光信号。还可以使用双链DNA结合染料(诸如核酸)嵌入染料。当使用双链DNA结合染料时，通常执行解链曲线分析用于证实扩增产物的存在。

本领域技术人员会理解，也可以采用其他核酸或信号放大方法。此类方法的实例包括但不限于分支DNA信号扩增、环介导等温扩增(LAMP)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、自持序列复制(3SR)、链置换扩增(SDA)或智能放大过程版本2(SMAP 2)。

应当理解，本公开的实施例不受一种或多种市售仪器的配置的限制。

制品/试剂盒

本公开的实施例还提供了优先性和/或选择性地检测和/或定量靶标RNA(相对于DNA)的制品或试剂盒。制品可包括用于优先性和/或选择性地检测和/或定量靶标RNA的引物和探针，以及合适的包装材料，包括dNTP(包括dATP、dCTP、dTTP、dGTP和dITP)。用于优先性和/或选择性检测和/或定量靶标RNA(相对于DNA)的代表性引物和探针能够与靶标RNA分子杂交。此外，试剂盒还可包括适当包装的DNA固定、杂交和检测所需的试剂和材料，例如固体支持物、缓冲液、酶和DNA标准品。本文公开了设计引物和探针的方法，并提供了优先性和/或选择性扩增并与RNA靶标分子杂交的引物和探针的代表性实例。

制品还可以包括一种或多种用于标记探针的荧光部分，可替代地，可以标记随试剂盒提供的探针。例如，制品可以包括用于标记靶标RNA探针的供体和/或受体荧光部分。上文提供了合适的FRET供体荧光部分和相应受体荧光部分的实例。

制品还可包含包装插页或包装标签，其上具有使用靶标RNA引物和探针检测样品中的靶标RNA的说明。制品可另外包括用于实施本文公开的方法的试剂(例如，缓冲液、聚合酶、辅因子、或防止污染的试剂)。此类试剂可以专用于本文所述的市售仪器之一。

本公开的实施例还提供了用于优先性和/或选择性地检测和/或定量样品中的靶标RNA的一组引物和一个或多个可检测探针。

本公开的实施例将进一步在以下实例中描述，这些实例不限制权利要求中描述的本发明的范围。

实例

提供以下实例和附图以帮助理解本发明，本主题的真正范围在所附权利要求书中阐明。应当理解的是，在不脱离本发明精神的前提下，可以对阐明的程序进行修改。在以下所有实例中，所使用的聚合酶是Z05D聚合酶，其是Z05聚合酶的D580G突变体，例如描述于美国专利号US 8,962,293、US 9,102,924和US 9,738,876中。

实例1：测试dITP在乙型肝炎病毒(HBV)测定中的作用的方法

HBV是一种部分双链DNA病毒，它包装了逆转录的单链RNA前基因组(pgRNA)。目前对慢性HBV感染的治疗包括核苷(酸)类似物(NA)，它破坏pgRNA的逆转录以抑制DNA合成。已经表明HBV pgRNA是cccDNA(共价闭合环状DNA)的替代物，即使在抑制HBV DNA产生时也能在血浆中检测到。由于在不到一半的接受治疗的患者中看到了严重的副作用和长期益处，因此对患者进行治疗中断监测至关重要。目前的监测方法涉及HBV DNA定量或HBV抗原检测，这两种方法都被认为有局限性。这些标志物可能不足以反映cccDNA的活性，因为NA疗法不会直接消除cccDNA库。因此，停止NA治疗可能会使得HBV感染反弹。由于HBV RNA颗粒的持续存在可能表明cccDNA的转录活跃，因此HBV pgRNA可能是一种潜在的生物标志物，用于识别可能成为治疗中断候选者的长期病毒抑制患者。

因此，HBV pgRNA定量测定可用于监测患者治疗中断。然而，开发HBV pgRNA测定的关键挑战之一是区分HBV RNA与病毒DNA扩增。由于与可靶向的HBV pgRNA的序列和结构差异数量有限，因此难以排除HBV DNA。因此，HBV定量测定的发展提供了一个平台来评估dITP的效用，以有用方式确保RNA选择性。

为了评估dITP的效果，在HBV区域7开发了一种HBV测定。HBV区域7扩增子称为插入片段3。为了避免二价金属离子调节(Mn(OAc)₂)，2.0mM的总dNTP浓度保持恒定，仅改变dGTP和dITP的比例以确定HBV区域7和通用内部对照(GIC)测定的最佳浓度。GIC测定与HBV区域7测定一起进行评估，因为GIC测定检测作为在所有6800/8800测定中的全过程对照(FPC)、内部对照(IC)和内部定量标准(IQS)的通用内部对照。最佳dGTP∶dITP比率取决于引物、探针和扩增子的GC含量。确定选择性RNA扩增的理想变性温度取决于掺入的dIMP量和扩增子的长度。需要注意的是，dIMP是一种dITP衍生物，是掺入DNA的dITP单体形式。HBV区域7和GIC测定序列、T_m(℃)和GC含量分别列于下表1和2。

表1：HBV区域7测定序列

表2：GIC测定序列

最初的实验是用SYTO 9嵌入染料进行的，以观察解链产物、和dITP对扩增子T_m的影响。SYTO 9实验是在HBV插入片段3转录物、HBV插入片段3 DNA gBlock(与HBV转录物序列相同的双链DNA片段)和GIC转录物上进行的。随后，使用TaqMan探针的HBV和GIC双链反应在变性和退火温度梯度中使用各种dGTP∶dITP比率进行评估，以确定最佳dITP浓度和热循环参数。对掺有HBV插入片段3 DNA gBlock的HBV插入片段3转录物进行性能评估，以检查与HBV DNA gBlock相比，HBV RNA靶标的扩增效率和特异性。在确定dITP浓度和热循环温度后，使用优化的dITP条件评估由6800/8800提取的不同病毒载量的临床HBV血浆样品。

实例2：dITP的使用使得T_m降低

因此，采用SYTO 9使用dITP滴定进行HBV区域7测定。使用SYTO 9染料(1μM/反应)评估dITP对HBV插入片段3扩增子T_m的影响。使用不同比例的dGTP∶dITP测试HBV区域7测定，以优化测定。主混合物中的最终dNTP浓度为2.0mM，由400μM dATP、400μM dCTP、800μM dUTP和400uM(dGTP+dITP)组成。在主干6800/8800主混合物上测试了以下五种不同dGTP和dITP比率的配方，如下表3所示：

表3：测试了五种不同dGTP和dITP比率的配方在主干6800/8800主混合物上。

在0.1、0.01和0.001ng/反应下测试了HBV插入片段3转录物的滴定。在实验中测试了通用6800/8800热曲线(包括95℃和91℃的变性温度)，列于下表4。

通用6800/8800热循环曲线

表4：通用6800/8800热曲线。

结果在图2A和2B中示出。扩增曲线在图2A中示出。图2B中显示的解链曲线表明，在所有配方中，除了不存在dGTP主混合物外，均产生了扩增曲线。这表明至少需要一些dGTP才能在测试的热循环条件下扩增靶标。扩增子的Tm随着反应中dITP浓度的增加而降低。无dITP反应的平均扩增子Tm为87.2℃。含有300μM dITP的配方的扩增子Tm显著降低至74.1℃。从该实验中，dITP对HBV插入片段3扩增子的影响由Tm降低13℃证实。因此，这些研究表明，随着dITP浓度的增加，扩增子的Tm会降低。

实例3：对HBV区域7和gBlock以及通用内部对照(GIC)转录物的dITP性能评估

评估了与HBV区域7转录物具有相同序列的gBlock双链DNA片段。由于病毒HBV RNA和HBV DNA具有非常相似的序列，因此对HBV gBlock和HBV转录物靶标池的评估对于确定HBV RNA扩增效率和特异性很重要。SYTO 9染料的初始实验使用HBV区域7转录物、HBV区域7DNA gBlock和GIC转录物进行测试，以观察扩增子解链曲线和T_m。在Roche96上评估了包含100μM和200μM dITP的两种主混合物配方，其中所有三个靶标在79.0至87.0℃的变性温度梯度范围内进行了评估。SYTO 9染料在1μM下进行测试，并在热曲线结束时包括解链步骤。由于SYTO 9嵌入染料存在于反应中，因此所有靶标均按单重方式测试。HBV插入片段3转录物、gBlock和GIC转录物以一种浓度进行测试。

结果表明，与仅含100μM dITP(和300μM dGTP)的预混液(图3A)相比，含200μMdITP(和200μM dGTP)的预混液(图3B)在较低的变性温度对所有三个靶标的性能均显著提高。含有200μM dITP(和200μM dGTP)的预混液可靠地将HBV区域7转录物扩增至81.1℃的变性温度，这比通用6800/8800热曲线的变性温度至少低10℃，如上表3所示，如图3A-3C所示。如图4A-4C和5A-5C所示，它还可以放大HBV区域7gBlock的单重反应，大概是由于长度短(318bp)，并可靠地检测到变性温度低至约79.0℃的GIC转录物。

实例4：使用dITP进行HBV区域7和GIC形成双链性能评估

大多数评估是用SYTO 9染料进行的，以检查dITP对Tm的影响。在该实验中，HBV和GIC测定与TaqMan探针形成双链，并在79至84.0℃的变性温度梯度下进行评估。在HBV插入片段3(图6A)和GIC转录物(图6B)的靶标池上测试了具有100μM dITP和200μM dITP的两种主混合物配方。本次评估中存在HEX和Cy5.5 TaqMan探针。

结果表明，两种配方在整个变性温度梯度上存在相当大的性能差异，如图6A和6B所示。200μM dITP浓度在较低的变性温度恢复了性能，并且能够在79.0℃成功可靠地检测HBV RNA靶标，该温度比通用6800/8800热曲线(图6A)中使用的变性温度低至多16℃。在通道Cy5.5中的GIC转录物中观察到类似的趋势(图6B)。

实例5：dITP在临床HBV血浆样品上的性能

在进一步滴定和温度梯度实验之后，确定最佳核苷酸浓度和热循环参数为300μMdITP(和100μM dGTP)、78℃变性(在PCR循环期间)和UNG失活保持以及55℃退火温度保持(未显示优化数据)。不同于指定的温度变化，通用6800/8800热曲线保持不变。最终的dITP热循环曲线列于下表5中。

有dITP的反应

(最终的dITP热循环曲线)

无dITP的反应

(通用6800/8800热循环曲线)

表5：在实验中测试的热曲线(+RT保持)。

热循环曲线中的逆转录(RT)PCR步骤包括在表4中列出的UNG灭活步骤之后的55、60和65℃三个温度保持。RT-PCR发生在RT步骤中，其中从RNA合成互补DNA。评估有和没有RT保持的目的是比较DNA(无RT保持)和RNA(有RT保持)扩增。表4中的热曲线在有和没有RT保持的情况下进行了测试，以比较临床HBV血浆洗脱液中的RNA和DNA扩增，此处描述。使用6800/8800和Roche高纯病毒核酸试剂盒提取了六个临床HBV血浆样品。临床样品取自已接受或未接受治疗的患者。这些临床样品中的HBV病毒载量范围从非常高的5.7E9降到4.8E4，如下表6所示。

*正接受HBV治疗或治疗前筛查的患者

表6：测试的HBV临床血浆样品清单。

对所有样品进行评估±dITP(优化浓度为300μM)和±RT保持，以评估总核酸纯化样品中的RNA和DNA扩增。dITP优化的热曲线(包括78℃变性/UNG失活和55℃退火温度)通过有dITP的反应进行测试。使用通用6800/8800通用热曲线(包括95℃和91℃变性保持)测试无dITP的反应以进行比较。

6800/8800提取的HBV血浆

无dITP平均ΔCp：1.9 有dITP平均ΔCp：6.2

Roche高纯病毒核酸试剂盒提取的HBV血浆

无dITP平均ΔCp：1.9 有dITP平均ΔCp：5.7

表7：临床HBV血浆样品平均Cps

结果表明，在所有测试的临床血浆样品(总共六个样品)中，有dITP的反应产生了显著更高的荧光信号和与±RT保持的反应之间的显著更大的ΔCp，如图7A-7F所示。表6显示了临床HBV血浆样品的平均Cps。表6显示，在两种提取方法中，有dITP的反应产生的平均ΔCps为6.2和5.7，与无dITP的反应(平均ΔCp为1.9)相比，这明显更大，如表7所示。

这证明了HBV RNA特异性的提高，并表明在dITP的存在下，相对于DNA的RNA靶标的优先性和/或选择性扩增。无dITP的反应在±RT保持之间产生最小的Cp延迟，这表明HBVDNA扩增效率等于或接近HBV RNA靶标的扩增效率。

在Cy5.5通道中，有dITP的反应通常会延迟GIC扩增曲线并产生低荧光信号。使用dITP可能需要调整GIC靶标浓度。正如预期的那样，GIC转录物有dITP/无RT保持不会产生任何Cp调用，如图8D所示。有dITP/无RT保持的反应生成扩增曲线和Cp调用。这可能是由于这些反应中存在RT活性，即使没有RT保持。较高温度的热循环可能会导致这一结果。

综上所述，这些实例表明，通过掺入dITP化学和通过有限改变6800/8800主混合物配方，HBV区域7测定证明了HBV RNA靶标相对于HBV DNA的优先性和/或选择性扩增。这些实例证明了将这种方法应用于RNA靶标的选择性RNA扩增的潜力，这些RNA靶标不易从天然DNA靶标中辨别出来，也不能利用poly-A尾或内含子/外显子连接进行靶向。

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