一种头孢菌素c酰化酶的发酵方法
阅读说明：本技术 一种头孢菌素c酰化酶的发酵方法 (Fermentation method of cephalosporin C acylase ) 是由 何锡林 张云辉 李琨 韩原亮 蒋成辉 马利萍 王文静 尹凡钦 原振刚 于 2020-06-23 设计创作，主要内容包括：本发提供了一种头孢菌素C酰化酶的发酵方法,它包括补加乳糖和甘油的工艺；所述补加乳糖的工艺是：培养8h且40≤OD-(600)≤50时一次性补入1％乳糖,在6-60h随补料(甘油)流加1％的乳糖；所述补加甘油的工艺是：6-8h,流加补入甘油100L/h；8-18h,流加补入甘油75L/h；18-30h,流加补入甘油85L/h；30-40h,流加补入甘油90L/h；40-50h,流加补入甘油95L/h；50-60h,流加补入甘油100L/h。本发明的发酵方法得到的发酵产物酶活超过170U/ml,应用前景良好。(The invention provides a fermentation method of cephalosporin C acylase, which comprises a process of supplementing lactose and glycerol; the lactose supplementing process comprises the following steps: culturing for 8h and OD not less than 40 600 1% lactose is added at one time when the temperature is less than or equal to 50, and 1% lactose is added along with the feeding (glycerol) in 6-60 h; the process for supplementing the glycerol comprises the following steps: adding 100L/h of supplementary glycerol in a flowing manner for 6-8 h; adding supplemental glycerol for 75L/h after 8-18 h; adding supplemental glycerol at a ratio of 85L/h for 18-30 h; adding 90L/h of supplementary glycerol in a flowing manner for 30-40 h; adding 95L/h of supplementary glycerol in a flowing way for 40-50 h; adding 100L/h of glycerol in the feed for 50-60 h. The fermentation product obtained by the fermentation method has the enzyme activity of over 170U/ml and has good application prospect.)
技术领域
本发明涉及发酵工程领域，尤其涉及一种头孢菌素C酰化酶的发酵方法。
背景技术
7-氨基头孢氨酸(7-ACA)是合成头孢类抗生素的关键性中间体，在其活性基团连接不同的侧链就构成不同性质的头孢类抗生素。世界上医药工业发达的国家均十分重视7-ACA的研究和生产。
一步酶法是生产7-ACA的常用技术。头孢菌素C酰化酶(CPC酰化酶，CCA)是一步酶法生产7-ACA的关键酶，能够将原料头孢菌素C(CPC)直接催化，脱去7-位的D-d氨基己二酰侧链，生成7-ACA。作用分子式如下：
头孢菌素C酰化酶主要靠基因工程菌发酵培养获得。为了提高酶的表达量和活性，研究人员不断尝试筛选发酵性能优越的菌株，或者构建基因工程菌株(内源信号肽DSE4介导头孢菌素C酰化酶在毕赤酵母中的分泌表达，华东理工大学学报(自然科学版)，2015)。但目前鲜有对发酵工艺改进的报道，主要是因为头孢菌素C酰化酶的发酵过程非常复杂，涉及培养基、发酵温度调节控制(包括温度和对应时间)、补料种类、补料时机、补料速度等诸多条件相互配合，优化获得一个比较好的发酵方法较为困难。
发明内容
本发明的目的是，提供一种简单、高效的头孢菌素C酰化酶的发酵工艺，具体技术方案包括：
一种头孢菌素C酰化酶的发酵方法，包括：
(1)移种：将种子液移入发酵培养基中；
(2)发酵：发酵60h，维持pH值6.8-7.2，第0-7h控制发酵培养温度为37±1℃，第8-60h的发酵温度25±1℃；期间补料，并调整搅拌速度，控制溶氧量为20％-30％；
步骤(1)所述发酵培养基含有：酵母膏43.0-48.0g/1、氯化钠3.0-8.0g/l、磷酸氢二钠8.0-13.0g/l、磷酸氢二钾4.17-4.22g/l、硫酸钠0.71-1.10g/l、硫酸镁1.78-2.00g/l、硫酸铵2.68-2.98g/l、丙三醇19.4-20.8g/l、三氯化铁0.015-0.020g/l、消泡剂0.42-0.50g/l；
步骤(2)所述补料为补加乳糖和甘油；
所述补加乳糖的工艺是：培养8h且40≤OD600≤50时一次性补入占发酵培养基体积1％±0.1％的乳糖，在第6-60h随甘油流加占发酵培养基体积1％±0.1％的乳糖；
所述补加甘油的工艺是：第6-8h，流加补入甘油100±1L/h；第8-18h，流加补入甘油75±1L/h；第18-30h，流加补入甘油85±1L/h；第30-40h，流加补入甘油90±1L/h；第40-50h，流加补入甘油95±1L/h；第50-60h，流加补入甘油100±1L/h。
如前述的方法，步骤(2)中，第0-7h控制发酵培养温度为37℃，第8-60h的发酵温度25℃。
如前述的方法，所述补加乳糖的工艺是：培养8h且40≤OD600≤50时一次性补入占发酵培养基体积1％的乳糖，在第6-60h随甘油流加占发酵培养基体积1％的乳糖。
如前述的方法，所述补加甘油的工艺是：第6-8h，流加补入甘油100L/h；第8-18h，流加补入甘油75L/h；第18-30h，流加补入甘油85L/h；第30-40h，流加补入甘油90L/h；第40-50h，流加补入甘油95L/h；第50-60h，流加补入甘油100L/h。
如前述的方法，步骤(1)的菌体接种量为1.25％(v/v)。
如前述的方法，步骤(1)之前还包括种子制备步骤，所述摇瓶菌种制备的步骤为：
a.制备摇瓶菌悬液：取出甘油管，自然解冻后接种至无菌摇瓶中的培养基，pH7.0-7.2、37℃条件下摇床培养15-17h；
b.制备一级种子：将步骤a中的摇瓶菌悬液接种至一级种子罐中的一级培养基，在pH6.9-7.5、37℃条件下培养5-6h；
c.制备二级种子：将步骤b的一级种子接种至二级种子罐中的二级培养基，在pH6.9-7.5、37℃条件下培养5-6h；
步骤a所述培养基含有蛋白胨10g/l、酵母膏5g/l、氯化钠10g/l；
步骤b所述一级培养基含有蛋白胨12g/l、酵母膏6g/l、氯化钠10g/l；
步骤c所述二级培养基含有蛋白胨12g/l、酵母膏6g/l、氯化钠10g/l。
如前述的方法，步骤(3)之后还包括酶活检测步骤。
如前述的方法，所述酶活检测步骤为：
富集发酵菌体，加水定容至原体积，均质后，得到均质液，再使用头孢菌素C作为底物，使用电位滴定的方法测定酶活。
现有技术(CN105112392A)中，所得发酵产物中，细胞内头孢菌素C酰化酶的活性为5000U/L，即5U/mL。本发明的发酵方法，得到的发酵菌体的均质液的头孢菌素C酰化酶活性高达170U/mL以上。
另外，本发明的方法对应补料工艺无需参考发酵液的OD值，节省了由OD值实时监测所产生的成本。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过
具体实施方式
对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例中使用的生产菌种为BL21(DE3)大肠杆菌表达菌株，是外源基因表达头孢菌素C酰化酶的重组大肠杆菌。该大肠杆菌表达菌株是以T7RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主，T7RNA聚合酶表达受控于DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。
实施例1 CPC酰化酶发酵
1.方法
(1)制备摇瓶菌悬液
摇瓶培养基含有：蛋白胨10g/l酵母膏5g/l氯化钠10g/l，生产菌种由甘油管接种至装有摇瓶培养基的无菌摇瓶，在pH7.0-7.2、37℃摇床培养15-17h。
(2)制备一级种子
一级培养基配比：蛋白胨12g/l酵母膏6g/l氯化钠10g/l，纯种摇瓶菌悬液接种至一级种子罐，在pH6.9-7.5、37℃条件下培养5-6h。
(3)制备二级种子
二级培养基配比：蛋白胨12g/l酵母膏6g/l氯化钠10g/l，纯种摇瓶菌悬液接种至二级种子罐，在pH6.9-7.5、37℃条件下培养5-6h。
(4)发酵
发酵罐配比：酵母膏43.0-48.0g/l、氯化钠3.0-8.0g/l、磷酸氢二钠8.0-13.0g/l、磷酸氢二钾4.17-4.22g/l、硫酸钠0.71-1.10g/l、硫酸镁1.78-2.00g/l、硫酸铵2.68-2.98g/l、丙三醇19.4-20.8g/l、三氯化铁0.015-0.020g/l、消泡剂0.42-0.50g/l。
取步骤(3)所得的二级种子，按照1.25％(v/v)的移种量移种至发酵培养基中发酵60h，0-7h37℃，8-60h25℃pH6.80-7.20。
期间补入乳糖、甘油。
补入乳糖工艺：培养8h且40≤OD600≤50，时一次性补入1％乳糖，在6-60h随补料流加1％的乳糖。
补入甘油工艺：发酵培养周期为6-8h时溶氧会出现回升现象(1min之内溶氧从20％升至100％)，溶氧回升至100％，即开始流加补入甘油，流加速度100L/h；从第8h开始，流加甘油的速度为：第8-18h75L/h，第18-30h85L/h，第30-40h90L/h，第40-50h95L/h，第50-60h100L/h。补加甘油过程中，调节搅拌转速，控制溶氧20％-30％；
(5)发酵结束取1.5L发酵液，离心机6000rpm，离心25min收集细胞，纯化水定容至原体积后均质机80Mpa高压均质，均质2遍，得到头孢菌素C酰化酶均质液。
(6)取均质液1ml，10000rpm5min，离心后取适当上清，加入CPC底物，底物浓度为5mmol/I，使用电位滴定仪滴定，用0.1mol/L氢氧化钠标准滴定液滴定7min，滴定过程中始终保持溶液pH，弃去前2min，记录后5min氢氧化钠标准滴定液的消耗量；每消耗0.1mol/L氢氧化钠，相当于产生0.1mol/L的7-ACA，对应1U酶活，通过计算得到均质液酶活。
2.结果
表1展示了本发明补料方式的2组平行实验的发酵结果，本发明对应的放罐均质液酶活可以高达170U/ml以上。
表1实施例1发酵结果
乳糖用量(kg)
甘油加量(kg)
放罐OD<sub>600</sub>
放罐均质液酶活(U/ml)
240
2500
147±34.24
173±7.07
240
2500
153±34.24
187±107.07
实施例2 CPC酰化酶发酵
1.发酵方法
(1)制备摇瓶菌悬液
摇瓶培养基含有：蛋白胨10g/l酵母膏5g/l氯化钠10g/l，生产菌种由甘油管接种至装有摇瓶培养基的无菌摇瓶，在pH7.0-7.237℃摇床培养15-17h。
(2)制备一级种子
一级培养基配比：蛋白胨12g/l酵母膏6g/l氯化钠10g/l，计料体积30L。纯种摇瓶菌悬液接种至一级种子罐，在pH6.9-7.5、37℃条件下摇床培养5-6h。
(3)制备二级种子
二级培养基配比：蛋白胨12g/l酵母膏6g/l氯化钠10g/l，计料体积1500L，纯种摇瓶菌悬液接种至一级种子罐，在pH6.9-7.5、37℃条件下摇床培养5-6h。
(4)发酵
发酵罐配比：酵母膏43.0-48.0g/l、氯化钠3.0-8.0g/l、磷酸氢二钠8.0-13.0g/l、磷酸氢二钾4.17-4.22g/l、硫酸钠0.71-1.10g/l、硫酸镁1.78-2.00g/l、硫酸铵2.68-2.98g/l、丙三醇19.4-20.8g/l、三氯化铁0.015-0.020g/l、消泡剂0.42-0.50g/l，计料体积12000L。
取步骤(3)制备的二级种子，按照1.25％(v/v)的移种量移种至发酵培养基中发酵60h，0-7h37℃，8-60h25℃pH6.80-7.20。
期间补入乳糖、甘油。
补入乳糖工艺：培养8h且40≤OD600≤50时一次性补入1％乳糖(占发酵液体积12000L)，在6-60h随补料(甘油)流加1％的乳糖(占发酵液体积12000L)。
补入甘油工艺1：发酵培养周期为6-8h时溶氧会出现回升现象(1min之内溶氧从20％升至100％)，溶氧回升至100％，即开始流加补入甘油，流加速度100L/h；从第8h开始，流加甘油的速度为：第8-18h75L/h，第18-30h85L/h，第30-40h90L/h，第40-50h95L/h，第50-60h100L/h。补加甘油过程中，调节搅拌转速，控制溶氧20％-30％。
补入甘油工艺2：发酵培养周期为6-8h时溶氧会出现回升现象(1min之内溶氧从20％升至100％)，溶氧回升即开始以89L/h的速度流加补入甘油。补加甘油过程中，调节搅拌转速，控制溶氧20％-30％；
补入甘油工艺3：发酵培养周期为6-8h时溶氧会出现回升现象(1min之内溶氧从20％升至100％)，此时定搅拌转速85rpm，调整补料量，控制溶氧20％-30％，直至第18h。18h至补料结束放罐期间，根据OD600增长速度调整补料：若每小时增长1.5-2.0，维持前1小时的补料速度；若OD600增长速度小于1.5时，增加补料3-5L/h。对应调整搅拌转速，控制溶氧在20％-30％范围内。补料完毕即停车放罐。
(5)发酵结束取1.5L发酵液，离心机6000rpm，25min离心收集细胞，纯化水定容至原体积后均质机80Mpa高压均质，均质2遍，得到CPC酰化酶均质液。
(6)取均质液10000rpm5min，取离心后上清，加入CPC底物，底物浓度20mol/l，使用电位滴定仪滴定时间为5min，到达滴定终点，每0.1mol/l氢氧化钠消耗对应1U/ml酶活，通过计算得到均质液酶活。
2.结果
如表2所示，使用补料工艺三由于严格按照OD值调整补料，可以使放罐均质液酶活达到202U/ml；该过程需要时刻监控OD值，且要频繁的调整补料量，从而需要频繁的调整搅拌转速来控制溶氧量，使得溶氧满足工艺要求，该方法对与检测数据要求很高且控制过程精细要求高，过程繁琐，放罐指标不稳定且生产成本较高。
而补入甘油工艺1(本发明)可以使放罐均质液酶活达到176U/ml；补料方式相对确定，培养过程简单易操作。综合起来看，该补料工艺更适合工业生产。
表2三种补料工艺对比效果
综上所述，本发明的发酵方法中，补加甘油和乳糖，并对补加量及补加方式进行特殊选择，可以显著提高CPC酰化酶均质液酶活，降低生产成本，工业应用前景良好。
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