一种量子点增强型肿瘤灭活疫苗及制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种量子点增强型肿瘤灭活疫苗及制备方法和应用 (Quantum dot enhanced tumor inactivated vaccine and preparation method and application thereof ) 是由 曲松楠 汤子康 梁桃 于 2021-06-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种量子点增强型肿瘤灭活疫苗及制备方法和应用,在热作用下,肿瘤细胞上蛋白分子链的空间结构打开,蛋白分子链松散形成空隙,小尺寸量子点进入蛋白的空间构象中,并通过量子点表面的上述官能团与蛋白分子链上的基团形成氢键,进而形成量子点修饰后的灭活癌细胞复合物。本发明提供的灭活疫苗在保持癌细胞抗原一级结构,即氨基酸序列不被破坏的基础上,提高癌细胞抗原蛋白的被免疫系统捕获、递呈及诱导特异性抗肿瘤免疫反应。所提出的量子点增强型癌细胞灭活疫苗可以应用到个性化的癌症免疫治疗中。(Under the action of heat, the space structure of a protein molecular chain on a tumor cell is opened, the protein molecular chain is loosened to form a gap, small-size quantum dots enter a space conformation of protein, and hydrogen bonds are formed between the functional groups on the surfaces of the quantum dots and groups on the protein molecular chain, so that a quantum dot modified inactivated cancer cell compound is formed. The inactivated vaccine provided by the invention improves the capturing and presenting of cancer cell antigen protein by an immune system and induces specific anti-tumor immune response on the basis of keeping the primary structure of the cancer cell antigen, namely, the amino acid sequence is not damaged. The quantum dot enhanced cancer cell inactivated vaccine can be applied to personalized cancer immunotherapy.)
技术领域
本发明涉及纳米材料和生物医学
技术领域
，具体而言，涉及一种量子点增强型肿瘤灭活疫苗及制备方法和应用。背景技术
个性化癌症疫苗是目前比较受欢迎的癌症免疫疗法之一。其旨在调节先天性和适应性免疫系统，以广泛激活具有个别肿瘤特异性抗原(新抗原)的抗肿瘤免疫力。然而，大规模并行测序和机器学习何如鉴定新抗原的过程是非常昂贵且耗时的，而且在此期间新抗原的变化将导致无效的抗癌反应。
肿瘤细胞是多种肿瘤新抗原的天然来源，包括尚未鉴定的那些。但是，全肿瘤细胞疫苗接种始终缺乏强有力的免疫刺激，抗肿瘤反应非常有限。主要原因可能是肿瘤细胞中包含的大多数蛋白质是自身蛋白质，其自身的免疫原性很低，并且向巨噬细胞和树突状细胞等抗原呈递细胞表达微弱的“吃我”信号。源自正常细胞变异的肿瘤细胞包含多种免疫抑制蛋白，它们表达“不吃我”信号以防止自身吞噬作用。所有这些导致抗原呈递细胞对新抗原的细胞吸收效率低，并且它们在淋巴结中的低效率积累导致无效的抗肿瘤T细胞活化。在最近的进展中，提出了许多通过与佐剂偶联或阻断肿瘤细胞上免疫抑制蛋白的方法来增强肿瘤细胞的免疫原性的策略。然而，这些方法不能在很大程度上改变或增强肿瘤细胞的免疫原性。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种量子点增强型肿瘤灭活疫苗及制备方法和应用。
本发明是这样实现的：
本发明提供一种量子点增强型肿瘤灭活疫苗，包括肿瘤细胞和位于肿瘤细胞的蛋白空间结构中的量子点，且该量子点通过其表面的生物相容性官能团与肿瘤细胞上的蛋白分子链上的基团以氢键键合。
本发明还提供一种根据上述的量子点增强型肿瘤灭活疫苗的制备方法，包括：将量子点与肿瘤细胞混合，通过热作用，使量子点粒子表面的官能团与肿瘤细胞上的蛋白分子链上的基团相互作用，形成氢键。
发明还提供一种根据上述的量子点增强型肿瘤灭活疫苗作为个性化肿瘤免疫治疗及预防的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供一种量子点增强型肿瘤灭活疫苗及制备方法和应用，该量子点增强型肿瘤灭活疫苗包括肿瘤细胞和位于肿瘤细胞的蛋白空间结构中的量子点，且该量子点通过其表面的生物相容性官能团与肿瘤细胞上的蛋白分子链上的基团以氢键键合。量子点由于其表面尺寸小，能够进入肿瘤蛋白的蛋白空隙内，量子点表面的基团进一步和肿瘤细胞表面的蛋白发生作用产生氢键。量子点颗粒只是改变了蛋白的构象，并未破坏其一级结构，使其表达的“不吃我”信号降低，“吃我”信号增加。大幅度提高肿瘤蛋白的免疫原性，进而表现出更佳的免疫激活特性，以及能够应用到增强型的细胞疫苗中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例的碳量子点粒子与肿瘤细胞相互作用的结构示意图(蛋白①“不吃我”蛋白，蛋白②肿瘤特异性蛋白，蛋白③正常蛋白)；
图2为本发明实验例1的碳量子点粒子及其与牛血清蛋白灭活疫苗的zeta电位图；
图3为本发明实验例1的碳量子点粒子及其与牛血清蛋白灭活疫苗的电泳跑胶图；
图4为本发明实验例1的碳量子点粒子及其与细胞灭活疫苗的红外吸收光谱图；
图5为本发明实验例2的碳量子点粒子及其与细胞灭活疫苗的荧光电镜图；
图6为本发明实验例3的巨噬细胞的confocal对比图；
图7为本发明实验例4的小鼠腹股沟淋巴的对比图；
图8为本发明实验例5的注射肿瘤免疫激活剂治疗的小鼠以及对照组小鼠的肿瘤生长曲线；
图9为本发明对比例1的电泳跑胶图；
图10为本发明对比例2的荧光光谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明的目的在于克服现有技术中的新抗原难以筛选、肿瘤抗原免疫原性差等技术问题，提供了一种量子点增强型肿瘤灭活疫苗。
本发明的另一个目的在于提供一种量子点增强型肿瘤灭活疫苗的制备方法。
本发明的另一个目的在于提供一种量子点增强型肿瘤灭活疫苗的应用。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
第一方面，本发明实施例提供一种量子点增强型肿瘤灭活疫苗，包括肿瘤细胞和位于肿瘤细胞的蛋白空间结构中的量子点，且该量子点通过其表面的生物相容性官能团与肿瘤细胞上的蛋白分子链上的基团以氢键键合。
本发明实施例提供一种量子点增强型肿瘤灭活疫苗的结构示意图参见图1，可以看出，在生物材料的肿瘤细胞上包含有3种蛋白:①“不吃我”蛋白，②肿瘤特异性蛋白，③正常蛋白，在上述3种蛋白的空间结构中均含有量子点材料，小尺寸量子点进入蛋白的二级结构的空间构象中，并通过量子点表面的上述官能团与蛋白分子链上的基团形成氢键，进而形成量子点修饰后的灭活癌细胞复合物。量子点材料通过改变癌细胞上蛋白分子的构象，可使癌细胞表面免疫抑制蛋白(“不吃我”信号蛋白)功能的降低，并增强正常蛋白的免疫原性(“吃我”信号蛋白)，在保持癌细胞抗原一级结构，即氨基酸序列不被破坏的基础上，提高癌细胞抗原蛋白的被免疫系统捕获、递呈及诱导特异性抗肿瘤免疫反应。
在可选的实施方式中，量子点选自碳量子点，且量子点的粒径小于15nm；
优选地，生物相容性官能团为氨基、亚胺基、碳氮双键、吡啶氮、吡咯氮，石墨烯氮、羧基、羟基及羰基中的一种或多种。
在可选的实施方式中，肿瘤细胞上蛋白包括正常蛋白、免疫抑制蛋白，肿瘤抗原蛋白中的一种或多种。
在可选的实施方式中，肿瘤细胞来源于体外培养或者增殖的癌细胞系、体外消化或者增殖的肿瘤组织细胞中的一种或多种。
优选地，肿瘤细胞或细胞碎片为癌细胞或癌细胞碎片。
第二方面，本发明实施例还供一种上述量子点增强型肿瘤灭活疫苗的制备方法，包括：将量子点与肿瘤细胞混合，通过热作用，使量子点粒子表面的生物相容性官能团与肿瘤细胞上的蛋白分子链上的基团相互作用形成氢键。
将量子点粒子与生物材料的肿瘤细胞混合，在外加能量的作用下，通过热作用使量子点粒子表面的生物相容性官能团与肿瘤细胞表面的蛋白分子链上的基团相互作用，形成氢键。肿瘤细胞主要包括外培养或者增殖的癌细胞系、体外消化或者增殖的肿瘤组织细胞中的一种或多种。通过热作用，抗原蛋白的二级结构打开，蛋白质链松散形成空隙，方便量子点粒子进入形成氢键。
在可选的实施方式中，在热作用下，肿瘤细胞上蛋白空间结构打开，在保持肿瘤蛋白一级结构不破坏的基础上，使表面包含有生物相容性官能团的量子点进入肿瘤细胞上的二级结构蛋白空间结构中。
在可选的实施方式中，热作用包括热传导、热辐射、光热、磁热或微波加热中的任意一种；
优选地，热作用是在50-90℃条件下反应1-30min。
在可选的实施方式中，量子点和肿瘤细胞的质量比为1:0.1-10000。此处量子点和肿瘤细胞的质量比的范围较大的原因在于：由于细胞的中大部分是水，通过估算，本发明实施例中的可以在较大的质量比的范围内，实现本发明实施例提出的方案。
在可选的实施方式中，量子点的制备方法如下：将柠檬酸和尿素混合溶于二甲基亚砜中，放入高压反应釜中，在110-220℃条件下，加热反应2-10h，然后用甲醇或者乙醇对得到的碳量子点粒子进行离心清洗，离心转速优选为6000-10000rpm。
需要说明的是，上述量子点的制备方法仅是发明人提供的一种具体的碳量子点的制备方法，本发明中的量子点粒子的制备不限于上述制备方法。
第三方面，本发明实施例提供一种上述量子点增强型灭火肿瘤疫苗作为肿瘤免疫药物的应用。
在可选的实施方式中，量子点增强型灭火肿瘤疫苗作为肿瘤免疫药物。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
除特殊说明，本实施例中所用的设备均为常规实验设备，所用的材料、试剂若无特殊说明均为市售得到，无特殊说明的实验方法也为常规实验方法。
实施例1
将柠檬酸和尿素按质量比1:4溶解于DMSO溶剂中，得到透明溶液置于50ml聚四氟乙烯高压反应釜中，160℃下反应4h，反应后的溶液加入大量乙醇洗涤，得到黑色固体，将固体水洗，离心(8000rpm，5min)，干燥后得到深蓝色粉末。测定获得的碳量子点粒子的直径为3-5nm。碳量子点粒子的C、N、O、S元素质量比分别为59.6％，16.2％，23.0％和1.2％。
将得到的碳量子点粒子溶于去离子水中，配置浓度为(0.1-1.5)mg/mL溶液，将碳量子点粒子和牛血清蛋白的质量比以1:50混合，采用光照加热、热板加热、水浴(油浴)加热、烘箱加热或超声加热等加热方式升温至60℃，反应10min，并同时以100rpm转速搅拌。即得到碳量子点粒子的牛血清蛋白(CQD-BSA)灭活疫苗。
实施例2
将实施例1的碳量子点粒子溶于去离子水中，配置浓度为(0.1-1.2)mg/mL，在上述溶液中每毫升中加入1x104-1x1010个4T1乳腺癌细胞。采用烘箱加热方式升温至60℃，反应10min，并同时以100rpm转速搅拌。即得碳量子点粒子的乳腺癌细胞(CQD-cell)灭活疫苗。
实施例3
碳量子点增强型细胞灭活疫苗的制备同实施例2。
将0.05mL得到的碳量子点增强型细胞灭活疫苗(碳量子点浓度为200ppm，4T1细胞数为1x104-1x1010个)、纯的碳量子点(碳量子点浓度为200ppm)、DiD染色的灭活的4T1乳腺癌细胞(4T1细胞数为1x104-1x1010个，具体和实验组一样)以及PBS分别加入到6cm巨噬细胞RAW264.7的培养皿中，24h后用confocal观察巨噬细胞的形态变化。
实施例4
碳量子点增强型细胞灭活疫苗的制备同实施例2。
将0.1mL得到的碳量子点增强型细胞灭活疫苗(碳量子点浓度为200ppm，4T1细胞数为1x104-1x1010个)、纯的碳量子点(碳量子点浓度为200ppm)、DiD染色的灭活的4T1乳腺癌细胞(4T1细胞数为1x104-1x1010，具体和实验组一样)以及PBS分别皮下注射到balb/c小鼠中，4h和24h分别取出其第四对乳腺，进行成像，观察淋巴的荧光情况。
实施例5
碳量子点粒子的制备同实施例1。
将乳腺癌细胞转基因小鼠的肿瘤摘除，进行消化，增殖，得到癌细胞。
将得到的碳量子点粒子溶于去离子水中，配置浓度为(0.1-1.5)mg/mL溶液，将碳量子点粒子和消化的癌细胞的质量比以1.0:10混合，采用热板加热升温至60℃，反应10min，并同时以100rpm转速搅拌。即得到碳量子点粒子增强型肿瘤细胞疫苗。
实验例1
测定实施例获得的碳量子点粒子(CQD)以及得到的碳量子点粒子的牛血清蛋白(CQD-BSA)灭活疫苗的zeta电位，结果如图2所示。经过复合后得到的CQD-BSA，表现为zeta电位的增强。
测定实施例获得的碳量子点粒子(CQD)以及得到的碳量子点粒子的牛血清蛋白(CQD-BSA)灭活疫苗的电泳跑胶，结果如图3所示。经过复合后得到的CQD-BSA，在蛋白质对应一条电泳带，显示出荧光，表明碳点和蛋白的有效键合。
测定实施例获得的碳量子点粒子(CQD)以及得到的碳量子点粒子的牛血清蛋白(CQD-BSA)灭活疫苗的红外吸收光谱，结果如图4所示。经过复合后得到的CQD-BSA，在3300cm-1有明显的尖峰，证明碳量子点和肿瘤细胞上的蛋白之间是氢键键合。
实验例2
测定实施例获得的碳量子点粒子的细胞(CQD-cell)灭活疫苗的荧光电镜，结果如图5所示。经过复合后得到的CQD-cell，表现为强的荧光，说明碳点可以无差别复合细胞上的蛋白。
实验例3
将0.05mL得到的碳量子点增强型细胞灭活疫苗(碳量子点浓度为200ppm，4T1细胞数为1x104-1x1010个)、纯的碳量子点(碳量子点浓度为200ppm)、DiD染色的灭活的4T1乳腺癌细胞(4T1细胞数为1x104-1x1010个，具体和实验组一样)以及PBS分别加入到6cm巨噬细胞RAW264.7的培养皿中。24h后用confocal观察巨噬细胞的形态变化，如图6所示，经过碳量子点粒子的肿瘤细胞(CQD-cell)灭活疫苗培养的巨噬细胞有着明显的体积增大以及树突状细胞分化的情况，表明CQD-cell可以促进巨噬细胞的成熟以及对抗原的吞食。
实验例4
将实施例1中0.05mL得到的碳量子点增强型细胞灭活疫苗(碳量子点浓度为200ppm，4T1细胞数为1x104-1x1010个)、纯的碳量子点(碳量子点浓度为200ppm)、DiD染色的灭活的4T1乳腺癌细胞(4T1细胞数为1x104-1x1010个，具体和实验组一样)以及PBS，分别皮下注射进小鼠。4h和24h观察其淋巴情况，结果如图7所示。表明经过碳量子点粒子的肿瘤细胞(CQD-cell)灭活疫苗可以增加抗原的淋巴呈递。
实验例5
碳量子点粒子的制备同实施例1。
将乳腺癌细胞转基因小鼠的肿瘤摘除，进行消化，增殖，得到癌细胞。将得到的碳量子点粒子溶于去离子水中，配置浓度为(0.1-1.5)mg/mL溶液，将碳量子点粒子和消化的癌细胞的质量比是1.0:10混合，采用热板加热方式升温至60℃，反应10min，并同时以100rpm转速搅拌。即得到碳量子点粒子增强型肿瘤细胞疫苗。
将一定计量的碳量子点粒子增强型肿瘤细胞疫苗注射回该转基因小鼠体内。优选注射计量为200ul，注入方法为静脉注入、皮下注入和腹水注入的一种，优选皮下注入。
测量小鼠的肿瘤生长曲线，结果如图8所示。图8发现，实验组a肿瘤生长显著受到抑制进而治愈，而对照组b肿瘤逐渐增大。说明碳量子点粒子增强型肿瘤细胞疫苗制剂有效地激活了小鼠的肿瘤免疫功能，抑制并灭杀了小鼠体内的肿瘤。
对比例1
与实施例2的步骤相似，不同之处仅在于：热作用的温度为25℃，发现荧光未能增强，在蛋白质对应一条电泳带未显示出荧光，结果如图9所示。
对比例2
与实施例1的步骤相似，不同之处仅在于：热作用的温度为120℃，发现荧光大幅度减弱，结果如图10所示。
从以上的对比例1-2的实验结果可以看出，热复合温度是量子点和肿瘤细胞能否复合的关键，热复合的温度不能过低，温度太低蛋白结构不能打开，两者无法复合。热复合的温度也不能过高，大于100℃且长时间加热，蛋白完全变性，荧光也不会增强，得不到所述的疫苗。即在不让蛋白变性的情况下，让量子点和蛋白结合，才可以成功制取本发明实施例所提供的量子点增强型癌细胞灭活疫苗。
综上，本发明实施例提供了一种量子点增强型癌细胞灭活疫苗及制备方法和应用，该量子点增强型癌细胞灭活疫苗具有以下的特征：量子点粒子粒径小于15nm，表面包含有多个生物相容性的官能团，官能团为氨基、亚胺基、碳氮双键、吡啶氮、吡咯氮，石墨烯氮，羧基，羟基，羰基中的一种或多种；在热作用下，癌细胞上蛋白分子链的空间结构打开，蛋白分子链松散形成空隙，小尺寸量子点进入蛋白的空间构象中，并通过量子点表面的上述官能团与蛋白分子链上的基团形成氢键，进而形成量子点修饰后的灭活癌细胞复合物。量子点材料通过改变癌细胞上蛋白分子的构象，可使癌细胞表面免疫抑制蛋白(“不吃我”信号蛋白)功能的降低，并增强正常蛋白的免疫原性(“吃我”信号蛋白)，在保持癌细胞抗原一级结构，即氨基酸序列不被破坏的基础上，提高癌细胞抗原蛋白的被免疫系统捕获、递呈及诱导特异性抗肿瘤免疫反应。所提出的量子点增强型癌细胞灭活疫苗可以应用到个性化的癌症免疫治疗中。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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