一种用于检测生物酶的比率型单苯环荧光探针及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种用于检测生物酶的比率型单苯环荧光探针及其制备方法和应用 (Ratio type single benzene ring fluorescent probe for detecting biological enzyme and preparation method and application thereof ) 是由 袁智勤 张凯 田明策 于 2020-12-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于检测生物酶的比率型单苯环荧光探针及其制备方法和应用。本发明利用分子内氢键的断裂/生成所引起的荧光发射的变化,通过对单苯环分子上的羟基基团进行化学修饰,得到了具有良好水溶性的单苯环荧光探针。荧光探针与酶反应后,释放出羟基并与相邻基团生成分子内氢键,从而产生荧光发射红移。本发明制备的单苯环荧光探针具有高选择性,高稳定性,高灵敏度,较低的检出限和良好的生物相容性,可用于内源性酶的检测。此外,本发明设计的单苯环荧光探针,制备方法简单,原料廉价易得,成本低,制备的产品产率高,适合大规模推广应用。(The invention discloses a ratio type single benzene ring fluorescent probe for detecting biological enzyme and a preparation method and application thereof. The invention utilizes the change of fluorescence emission caused by the breakage/generation of intramolecular hydrogen bonds, and obtains the single benzene ring fluorescent probe with good water solubility by chemically modifying hydroxyl groups on the single benzene ring molecules. After the fluorescent probe reacts with enzyme, hydroxyl is released and generates intramolecular hydrogen bond with adjacent groups, thereby generating fluorescence emission red shift. The single-benzene-ring fluorescent probe prepared by the invention has high selectivity, high stability, high sensitivity, lower detection limit and good biocompatibility, and can be used for detecting endogenous enzymes. In addition, the single-benzene-ring fluorescent probe designed by the invention is simple in preparation method, cheap and easily available in raw materials, low in cost, high in yield of prepared products, and suitable for large-scale popularization and application.)
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，特别涉及一种用于检测生物酶的比率型单苯环荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
细胞代谢的调控是生命活动的基础，其中大部分都是由酶来催化控制的。生物酶通过调节细胞内生化反应的速率，控制多种生理过程的进行，在维持正常的细胞生理活动中起着关键作用。如果没有酶的存在，许多重要的生化反应将以无法维持生命的速率进行。研究表明，某些酶的活性异常与一些重大疾病如癌症等的发生密切相关，常常被作为相关疾病诊断和药物发现的生物标志物。因此，发展快速、灵敏、准确的检测生物酶活性的分析方法，对于疾病的早期诊断和精确治疗具有重要的意义。基于有机小分子荧光探针具有高灵敏度、高选择性、快速的响应时间以及对生物无破坏性等优点，在生物酶的检测中受到了广泛关注。
目前报道的有机小分子荧光探针多是一些多苯环的有机小分子荧光探针，与多苯环分子相比，具有易制备，高稳定性和低成本等优点的单苯环有机小分子却由于其荧光发射大都在紫外区而不适用于荧光传感。但单苯环分子具有的较小尺寸可能会与目标(如：蛋白质和DNA)结合的更加灵敏。换句话说，单苯环分子可能作为一类新型有机探针，对分析物的检测提供新的途径。因此，设计和合成具有可见或近红外荧光发射的单苯环分子至关重要。
发明内容
本发明利用分子内氢键来调控单苯环分子的荧光性质，从而提供一种用于检测生物酶的比率型单苯环荧光探针及其制备方法，并且将该类单苯环荧光探针成功的应用于HeLa细胞中碱性磷酸酶的生物成像，探针光稳定性好，在活细胞成像中光信号稳定。
本发明所述的用于检测生物酶的比率型单苯环荧光探针的结构式如下：
本发明所述的用于检测生物酶的比率型单苯环荧光探针的制备方法为：
(1)将4,6-二羟基间苯二甲酸或2,5-二羟基对苯二甲酸分别进行羧基保护反应；
(2)将步骤(1)得到的羧基保护产物分别进行磷酸化反应、酰胺化反应、酯化反应；
(3)将步骤(2)得到的产物分别进行解保护反应，相应得到式(Ⅰ)、式(Ⅱ)、式(Ⅲ)、式(Ⅳ)、式(Ⅴ)、式(Ⅵ)所示的用于检测生物酶的比率型单苯环荧光探针。
上述各步骤反应如下反应式所示：
步骤(1)所述的羧基保护反应的具体操作步骤为：向含有4,6-二羟基间苯二甲酸或2,5-二羟基对苯二甲酸的圆底烧瓶中加入无水DMF和NaHCO3，室温下搅拌10-30分钟；然后加入苄基溴，55-60℃下搅拌反应2-8小时后用水淬灭反应，用DCM萃取有机化合物，合并有机层，用饱和盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，最后旋转蒸发除去溶剂得到羧基保护产物；其中4,6-二羟基间苯二甲酸或2,5-二羟基对苯二甲酸、NaHCO3和苄基溴的摩尔比为1:2-4:3-5。
步骤(2)所述的磷酸化反应的具体操作步骤为：向步骤(1)得到的羧基保护产物的THF溶液中加入CCl4，冷却至0℃，然后在N2下滴加N,N-二异丙基乙胺，混合搅拌10-30分钟后逐滴加入4-二甲基氨基吡啶和膦酸二苄基酯的THF溶液，滴加完成后加热至室温搅拌反应2-8小时；用磷酸二氢钠的磷酸盐缓冲液淬灭反应，继续搅拌10-50分钟，最后用DCM萃取，用盐水洗涤有机层，无水Na2SO4干燥，过滤，蒸发除去溶剂，使用洗脱剂纯化残余物；其中步骤(1)得到的羧基保护产物、CCl4、N,N-二异丙基乙胺、4-二甲基氨基吡啶和膦酸二苄基酯的摩尔比为1:8-12:0.5-1.5:0.08-0.2:1-3。
步骤(2)所述的酰胺化反应的具体操作步骤为：在0-(-20)℃，向步骤(1)得到的羧基保护产物的THF溶液中加入4-二甲基氨基吡啶和二乙基氨基甲酰氯，然后加热至室温并搅拌反应2-8小时，用磷酸二氢钠的磷酸盐缓冲液淬灭反应，继续搅拌10-50分钟，最后用DCM萃取，用盐水洗涤有机层，无水Na2SO4干燥，过滤，蒸发除去溶剂，使用洗脱剂纯化残余物；其中步骤(1)得到的羧基保护产物、4-二甲基氨基吡啶和二乙基氨基甲酰氯的摩尔比为1:1-3:1-2。
步骤(2)所述的酯化反应的具体操作步骤为：向步骤(1)得到的羧基保护产物的THF溶液中滴加N,N-二异丙基乙胺，搅拌10-50分钟后继续滴加含有4-二甲基氨基吡啶和乙酸酐的THF溶液，搅拌反应2-8小时，用磷酸二氢钠的磷酸盐缓冲液淬灭反应，继续搅拌10-50分钟，最后用DCM萃取，用盐水洗涤有机层，无水Na2SO4干燥，过滤，蒸发除去溶剂，使用洗脱剂纯化残余物；其中步骤(1)得到的羧基保护产物、N，N-二异丙基乙胺、4-二甲基氨基吡啶和乙酸酐的摩尔比为1:0.5-2:1-3:1-3。
步骤(3)所述的解保护反应的具体操作步骤为：向磷酸化反应产物的甲醇溶液中添加催化剂，在室温下搅拌反应1-5天，过滤除去催化剂，甲醇洗涤，蒸发除去溶剂，最后用乙醚洗涤。
步骤(3)所述的解保护反应的具体操作步骤为：向酰胺化反应产物的甲醇溶液中添加催化剂，在室温下搅拌反应1-5天，过滤除去催化剂，甲醇洗涤，蒸发除去溶剂，最后用二氯甲烷洗涤。
步骤(3)所述的解保护反应的具体操作步骤为：向酯化反应产物的异丙醇溶液中添加催化剂，在室温下氢气氛围中搅拌反应1-5天，过滤除去催化剂，甲醇洗涤，蒸发除去溶剂，最后用二氯甲烷洗涤。
所述的洗脱剂为体积比为1:(1.5-2.0)的EA和己烷混合溶剂。
所述的催化剂为Pd/C。
上述的用于检测生物酶的比率型单苯环荧光探针在检测生物酶中的应用。
上述的用于检测生物酶的比率型单苯环荧光探针用于筛选酶活性抑制剂的应用。
本发明利用分子内氢键的断裂/生成所引起的荧光发射的变化，通过对单苯环分子上的羟基基团进行化学修饰，得到了具有良好水溶性的单苯环荧光探针，荧光探针与酶反应后，释放出羟基并与相邻基团生成分子内氢键，从而产生荧光发射红移。本发明制备的单苯环荧光探针具有高选择性，高稳定性，高灵敏度，较低的检出限和良好的生物相容性，可用于内源性酶的检测。此外，本发明设计的单苯环荧光探针，制备方法简单，原料廉价易得，成本低，制备的产品产率高，适合大规模推广应用。
附图说明
图1为实施例1制备的单苯环荧光探针PDHTA的荧光激发光谱和荧光发射光谱。
图2为实施例2制备的单苯环荧光探针probe 2的荧光激发光谱和荧光发射光谱。
图3为实施例3制备的单苯环荧光探针Esterase-probe的荧光激发光谱和荧光发射光谱。
图4为应用例4中向单苯环荧光探针PDHTA溶液加入碱性磷酸酶前后的荧光发射光谱。
图5为应用例7中单苯环荧光探针PDHTA的发射光谱随着碱性磷酸酶活性增加的变化曲线以及荧光比值图。
图6为应用例10中单苯环荧光探针PDHTA用于碱性磷酸酶及干扰物检测的荧光比值图。
图7为应用例13中单苯环荧光探针PDHTA的发射光谱随着酶活性抑制剂浓度增加的变化曲线以及荧光比值图。
图8为不同浓度的单苯环荧光探针PDHTA的细胞毒性。
图9为单苯环荧光探针PDHTA对活细胞中碱性磷酸酶共聚焦成像检测图。
具体实施方式
为了更清楚的说明本发明，列举如下实施例，但本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
实施例1
单苯环荧光探针PDHTA其结构如下：
单苯环荧光探针PDHTA的合成包括以下步骤：
(1)向含有2,5-二羟基对苯二甲酸(500mg,2.52mmol)的圆底烧瓶中加入无水DMF(5.0mL)和NaHCO3(530mg,6.31mmol)，将混合物在室温下搅拌10分钟。然后，加入苄基溴(1.29g,7.57mmol)，将反应混合物加热至60℃，并搅拌5h。用水(10mL)淬灭反应，并用DCM(50mL×3)萃取有机化合物。随后将合并的有机层用饱和食盐水洗涤，并用无水Na2SO4干燥，过滤，通过旋转蒸发除去溶剂，得到羧基保护产物(800mg,84％)。
羧基保护产物的质谱及核磁表征：
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):10.07(s,2H),7.52(s,2H),7.46-7.38(m,10H),5.39(s,4H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:168.93,153.12,134.84,128.89,128.53,118.56,117.97,67.76.
MS(ESI-):m/z＝377.1,calcd 377.1.
(2)向含有羧基保护产物(500mg,1.32mmol)的THF溶液(10mL)中加入CCl4(1.27mL,13.21mmol)，并将反应冷却至0℃。然后，在N2下将N,N-二异丙基乙胺(0.75mL,0.92mmol)滴加到溶液中，并将反应混合物搅拌10分钟。将含有4-二甲基氨基吡啶(16mg,0.132mmol)和膦酸二苄基酯(0.43mL,1.92mmol)的THF(3mL)溶液逐滴加入反应混合物中，之后将溶液加热至室温并搅拌3小时。用磷酸二氢钠(30mL,1M)的磷酸盐缓冲液淬灭反应。再搅拌30分钟，混合物用DCM(30mL×3)萃取，并用盐水洗涤有机层，用无水Na2SO4干燥。过滤后，蒸发除去溶剂，并将残余物纯化，使用EA和己烷(1/2)作为洗脱剂，得到磷酸化反应产物(700mg,83％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:10.46(s,2H),7.69(d,J＝1.52,2H),7.33(s,1H)7.29-7.11(m,20H),5.23(s,2H),5.16(s,2H),4.97(s,2H),4.95(s,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:168.68,163.71,158.26,140.85,140.78,135.62,135.56,135.44,134.86,130.31,130.26,129.18,128.91,128.74,128.71,128.67,128.64,128.58,128.56,128.54,128.37,128.20,127.81,127.13,125.44,122.85,122.82,120.68,115.45,115.44,70.32,70.26,67.77,67.53.31P NMR(162MHz,CDCl3)δ:6.12.
MS(ESI-):m/z＝637.2,calcd 637.2.
(3)向含有磷酸化反应产物(400mg,0.626mmol)的甲醇溶液(50mL)中添加催化剂Pd/C(15mg,Pd的质量分数5％)，将反应混合物在室温下搅拌2天后，过滤除去催化剂，并用甲醇洗涤。蒸发除去溶剂，再用乙醚(20mL)洗涤，得到荧光探针PDHTA(150mg,90％)。
1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ:7.73(s,1H),7.13(s,1H).13C NMR(100MHz,d6-DMSO)δ:170.45,166.01,156.28,141.03(d),132.43(d),122.67,118.11,115.60.31P NMR(162MHz,CDCl3)δ:5.40.
MS(ESI-):m/z＝277.0,calcd 277.0.
实施例2
单苯环荧光探针probe2其结构如下：
单苯环荧光探针probe 2的合成包括以下步骤：
(1)在0℃下，向实施例1步骤(1)得到的羧基保护产物(500mg,1.32mmol)的THF溶液(10mL)中加入4-二甲基氨基吡啶(156mg,1.98mmol)和二乙基氨基甲酰氯(0.2mL,1.59mmol)。然后，将所得溶液加热至室温并搅拌3小时后，用磷酸二氢钠(30mL,1M)的磷酸盐缓冲液淬灭反应。再搅拌30分钟，混合物用DCM(30mL×3)萃取，并用盐水洗涤有机层，在用无水Na2SO4干燥。过滤后，蒸发除去溶剂，并将残余物纯化，使用EA和己烷(1/2)为洗脱剂，得到酰胺化反应产物(250mg,40％)。
1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ:13.26(bs,1H),7.46(s,1H),7.30(s,1H),3.39(bs,2H),3.25(bs,2H),1.19(bs,3H),1.08(bs,3H).13C NMR(100MHz,d6-DMSO)δ:170.17,165.30,157.35,153.40,141.58,131.09,124.85,118.73,117.15,41.65,41.33,13.91,13.27.
MS(ESI-):m/z＝476.2,calcd 477.2.
(2)向含有酰胺化反应产物(100mg,0.21mmol)的甲醇溶液(50mL)中添加催化剂Pd/C(15mg,5％)，将反应混合物在室温下搅拌2天后，过滤除去催化剂，并用甲醇洗涤。蒸发除去溶剂，再用二氯甲烷洗涤，得到probe 2(55mg,88％)。
1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ:13.26(bs,1H),7.46(s,1H),7.30(s,1H),3.39(bs,2H),3.25(bs,2H),1.19(bs,3H),1.08(bs,3H).13C NMR(100MHz,d6-DMSO)δ:170.17,165.30,157.35,153.40,141.58,131.09,124.85,118.73,117.15,41.65,41.33,13.91,13.27.
MS(ESI-):m/z＝296.1,calcd 297.1.
实施例3
单苯环荧光探针Esterase-probe其结构如下：
单苯环荧光探针Esterase-probe的合成包括以下步骤：
(1)向实施例1步骤(1)得到的羧基保护产物(500mg,1.32mmol)的THF溶液(10mL)中滴加N,N-二异丙基乙胺(0.75mL,0.92mmol)，并将反应混合物搅拌10分钟。将含有4-二甲基氨基吡啶(156mg,1.98mmol)和乙酸酐(196mg,1.92mmol)的THF溶液(10mL)逐滴加入反应混合物中，之后搅拌3小时。用磷酸二氢钠(30mL,1M)的磷酸盐缓冲液淬灭反应。再搅拌30分钟，混合物用DCM(30mL×3)萃取，并用盐水洗涤有机层，在用无水Na2SO4干燥。过滤后，蒸发除去溶剂，并将残余物纯化，使用EA和己烷(1/2)为洗脱剂，得到酯化反应产物(92％)。
(2)向酯化反应产物(500mg,0.98mmol)的异丙醇溶液(50mL)中添加催化剂Pd/C(15mg,5％)，将反应混合物在氢气氛围下搅拌2天后，过滤除去催化剂，并用甲醇洗涤。蒸发除去溶剂，再用二氯甲烷洗涤，得到Esterase-probe(70％)。
应用例1
实施例1制备的分子PDHTA荧光性质的研究：
在4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲溶液中(pH＝7.4)中，加入初始浓度为1mM的PDHTA，使得溶液中PDHTA的终浓度为10μM。然后用荧光分光光度计测定其荧光激发光谱和发射光谱，其结果如图1所示。由结果可以看出，所述分子PDHTA与分子2,5-二羟基对苯二甲酸(DHTA)存在明显的光学差异，说明所制备的分子PDHTA存在用作荧光探针的可行性。
应用例2
实施例2制备的分子probe 2荧光性质的研究：
在PBS缓冲溶液中(pH＝7.4)中，加入初始浓度为1mM的probe 2，使得溶液中probe2的终浓度为10μM。然后用荧光分光光度计测定其荧光激发光谱和发射光谱，其结果如图2所示。由结果可以看出，所述分子probe 2与分子DHTA存在明显的光学差异，说明所制备的分子probe 2存在用作荧光探针的可行性。
应用例3
实施例3制备的分子Esterase-probe荧光性质的研究：
在PBS缓冲溶液中(pH＝7.4)中，加入初始浓度为1mM的Esterase-probe，使得溶液中Esterase-probe的终浓度为10μM。然后用荧光分光光度计测定其荧光激发光谱和发射光谱，其结果如图3所示。由结果可以看出，所述分子Esterase-probe与分子DHTA存在明显的光学差异，说明所制备的分子Esterase-probe存在用作荧光探针的可行性。
应用例4
实施例1的荧光探针PDHTA对碱性磷酸酶检测的可行性研究：
在HEPES缓冲溶液中(pH＝7.4)中，加入初始浓度为1mM的PDHTA，使得溶液中PDHTA的终浓度为5μM。然后，加入碱性磷酸酶使得溶液中碱性磷酸酶的浓度为3U/L。在37℃下孵育50min，然后在激发波长353nm下，用荧光分光光度计测定荧光发射光谱，其结果如图4所示，由结果可以看出，所述PDHTA探针可以用来检测碱性磷酸酶。
应用例5
实施例2的荧光探针probe 2对乙酰胆碱酯酶检测的可行性研究：
在HEPES缓冲溶液中(pH＝7.4)中，加入初始浓度为1mM的probe 2，使得溶液中probe 2的终浓度为5μM。然后，加入乙酰胆碱酯酶使得溶液中乙酰胆碱酯酶的浓度为5U/L。在37℃下孵育40min，然后在激发波长353nm下，用荧光分光光度计测定荧光发射光谱，由结果可以看出，所述probe 2可以用来检测乙酰胆碱酯酶。
应用例6
实施例3的荧光探针Esterase-probe对酯酶检测的可行性研究：
在HEPES缓冲溶液中(pH＝7.4)中，加入初始浓度为1mM的Esterase-probe，使得溶液中Esterase-probe的终浓度为5μM。然后，加入酯酶使得溶液中酯酶的浓度为4U/L。在37℃下孵育40min，然后在激发波长353nm下，用荧光分光光度计测定荧光发射光谱，由结果可以看出，所述Esterase-probe可以用来检测酯酶。
应用例7
实施例1的荧光探针PDHTA对不同浓度碱性磷酸酶的检测：
在HEPES缓冲溶液中(pH＝7.4)中，加入初始浓度为1mM的PDHTA，使得溶液中PDHTA的终浓度为5μM。然后，依次加入碱性磷酸酶使得溶液中碱性磷酸酶的浓度分别为0U/L,0.005U/L,0.01U/L,0.04U/L,0.08U/L,0.1U/L,0.2U/L,0.4U/L,0.6U/L,0.8U/L,1U/L,2U/L,3U/L,4U/L。在37℃下孵育50min，然后在激发波长353nm下,用荧光分光光度计测定在463nm和533nm下的荧光发射强度的变化，从而实现比率检测碱性磷酸酶.其结果如图5A和图5B所示，由结果可以看出，所述PDHTA探针对碱性磷酸酶有很好的响应。
应用例8
实施例2的荧光探针probe 2对不同浓度乙酰胆碱酯酶的检测：
在PBS缓冲溶液中(pH＝7.4)中，加入初始浓度为1mM的probe 2，使得溶液中probe2的终浓度为5μM。然后，依次加入乙酰胆碱酯酶使得溶液中乙酰胆碱酯酶的浓度分别为0U/L,0.01U/L,0.04U/L,0.06U/L,0.1U/L,0.2U/L,0.4U/L,0.6U/L,0.8U/L,1U/L,2U/L,3U/L,4U/L,5U/L,6U/L。在37℃下孵育40min，然后在激发波长353nm下,用荧光分光光度计测定在441nm和533nm下的荧光发射强度的变化，从而实现比率检测乙酰胆碱酯酶.由结果可知，所述probe 2对乙酰胆碱酯酶有很好的响应。
应用例9
实施例3的荧光探针Esterase-probe对不同浓度酯酶的检测：
在PBS缓冲溶液中(pH＝7.4)中，加入初始浓度为1mM的Esterase-probe，使得溶液中Esterase-probe的终浓度为5μM。然后，依次加入酯酶使得溶液中酯酶的浓度分别为0U/L,0.005U/L,0.01U/L,0.02U/L,0.04U/L,0.08U/L,0.1U/L,0.2U/L,0.4U/L,0.6U/L,0.8U/L,1U/L,2U/L,4U/L,6U/L。在37℃下孵育40min，然后在激发波长353nm下,用荧光分光光度计测定在435nm和533nm下的荧光发射强度的变化，从而实现比率检测酯酶.由结果可知，所述Esterase-probe对酯酶有很好的响应。
应用例10
实施例1的荧光探针PDHTA的选择性测试：
如应用例7所述，在同样测试条件下，向HEPES缓冲溶液中(pH＝7.4)中，加入初始浓度为1mM的PDHTA，使得溶液中PDHTA的浓度为5μM。然后，依次向溶液中加入终浓度为1mM的K+,Ca2+,Mg2+,Zn2+,L-丙氨酸(Ala),L-天冬氨酸(Asp),精氨酸(Arg),丝氨酸(Ser),甘氨酸(Gly),谷胱甘肽(GSH)和葡萄糖(glucose)以及终浓度为100mg/L的牛血清蛋白(BSA)和溶菌酶(LZM)。在激发波长353nm下，用荧光分光光度计测定在有/无碱性磷酸酶(5U/L)的条件下，463nm和533nm下的荧光发射强度的变化。结果如图6所示，由结果可以看出，其他金属离子和有机生物小分子不对检测结果产生干扰，说明本发明制备的单苯环荧光探针PDHTA对碱性磷酸酶具有较高的选择性。
应用例11
实施例2的荧光探针probe 2的选择性测试：
如应用例8所述，在同样测试条件下，PBS缓冲溶液中(pH＝7.4)中，加入初始浓度为1mM的probe 2，使得溶液中probe 2的浓度为5μM。然后，依次向溶液中加入终浓度为1mM的K+,Ca2+,Mg2+,Zn2+,Ala,Asp,Arg,Ser,Gly,GSH和glucose以及终浓度为100mg/L的BSA和LZM。在激发波长353nm下，用荧光分光光度计测定在有/无乙酰胆碱酯酶(5U/L)的条件下，441nm和533nm下的荧光发射强度的变化。由结果可知，其他金属离子和有机生物小分子不对检测结果产生干扰，所述probe 2对乙酰胆碱酯酶具有较高的选择性。
应用例12
实施例3的荧光探针Esterase-probe的选择性测试：
如应用例9所述，在同样测试条件下，PBS缓冲溶液中(pH＝7.4)中，加入初始浓度为1mM的Esterase-probe，使得溶液中Esterase-probe的浓度为5μM。然后，依次向溶液中加入终浓度为1mM的K+,Ca2+,Mg2+,Zn2+,Ala,Asp,Arg,Ser,Gly,GSH和glucose以及终浓度为100mg/L的BSA和LZM。在激发波长353nm下，用荧光分光光度计测定在有/无酯酶(5U/L)的条件下，435nm和533nm下的荧光发射强度的变化。由结果可知，其他金属离子和有机生物小分子不对检测结果产生干扰，所述Esterase-probe对酯酶具有较高的选择性。
应用例13
实施例1的荧光探针PDHTA对酶活性抑制剂抑制效率的研究：
将ALP(3U/L)与不同浓度的正钒酸钠(Na3VO4)(0、2、4、6、8、10、25、50、75、100、250、500和1000μM)在37℃下放置30min。然后，将经Na3VO4处理过的ALP添加到含有PDHTA(5μM)的HEPES缓冲溶液中(10mM，pH 7.4)。在37℃下孵育50min后，在激发波长353nm下，用荧光分光光度计测定在463nm和533nm下的荧光发射强度的变化。结果如图7所示，由结果可以看出，其有较低的IC50，证明了所述PDHTA探针具有较高的灵敏度。
应用例14
实施例1的荧光探针PDHTA细胞毒性的研究：
在37℃和含有CO2(5％)的空气中，将HeLa细胞在含有10％胎牛血清(FBS)，链霉素(100μg/mL)和青霉素(100μg/mL)的培养基中培养。再将HeLa细胞接种到96孔板中过夜，加入浓度为5至20μM的PDHTA之后，向每个孔中添加10μL噻唑兰(MTT)溶液(5mg/mL)。孵育4小时后，添加100μL二甲基亚砜(DMSO)，之后再使用多模式读板器在570nm处测量吸光度，并计算细胞活性。其结果如图8所示：由结果可以看出，所述PDHTA探针具有较低的细胞毒性。
应用例15
实施例2的荧光探针probe 2细胞毒性的研究：
在37℃和含有CO2(5％)的空气中，将HeLa细胞在含有10％胎牛血清(FBS)，链霉素(100μg/mL)和青霉素(100μg/mL)的培养基中培养。再将HeLa细胞接种到96孔板中过夜，加入浓度为5至20μM的probe 2之后，向每个孔中添加10μL MTT溶液(5mg/mL)。孵育4小时后，添加100μL DMSO，之后再使用多模式读板器在570nm处测量吸光度，并计算细胞活性。由结果可以看出，所述probe 2具有较低的细胞毒性。
应用例16
实施例3的荧光探针Esterase-probe细胞毒性的研究：
在37℃和含有CO2(5％)的空气中，将HeLa细胞在含有10％胎牛血清(FBS)，链霉素(100μg/mL)和青霉素(100μg/mL)的培养基中培养。再将HeLa细胞接种到96孔板中过夜，加入浓度为5至20μM的Esterase-probe之后，向每个孔中添加10μL MTT溶液(5mg/mL)。孵育4小时后，添加100μL DMSO，之后再使用多模式读板器在570nm处测量吸光度，并计算细胞活性。由结果可以看出，所述Esterase-probe具有较低的细胞毒性。
应用例17
实施例1的荧光探针PDHTA对HeLa细胞中碱性磷酸酶的检测：
首先将HeLa细胞分为三组培养，第一组HeLa细胞作为空白组，只加入培养基；在第二组中，将溶有荧光探针PDHTA(5μM)的培养基加入到HeLa细胞中；然后在第三组中，先将HeLa细胞与酶抑制剂Na3VO4孵育30分钟然后再将荧光探针PDHTA(5μM)加入到HeLa细胞中；之后均在37℃条件下孵育30分钟，并用PBS缓冲溶液洗涤三次，最后均在激光共聚焦显微镜下成像。在405nm激光源激发下，在蓝色通道(425-475nm)和绿色通道(520-625nm)同时观察荧光成像，结果如图9所示：对于第一组可观察到绿色通道和蓝色通道均无荧光，对于第二组可观察到绿色通道有明显的荧光，而蓝色通道几乎无荧光；对于第三组可观察到绿色通道几乎无荧光，而蓝色通道存在明显的荧光。说明本发明制备的单苯环荧光探针PDHTA具有良好的细胞内碱性磷酸酶成像的潜力。