替加色罗在制备抗肿瘤药物中的应用
阅读说明：本技术 替加色罗在制备抗肿瘤药物中的应用 (Application of tegaserod in preparing anti-tumor medicine ) 是由 杨金波 宋巧玲 赵晨阳 吴丽娟 赵俊 唐宇 徐锡明 于 2020-04-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了替加色罗或其药学上可接受的盐作为JAK-STAT3信号通路抑制剂、免疫调节剂及其在制备抗肿瘤药物中的应用。替加色罗及其药学上可接受的盐在体内外对多种肿瘤细胞的生长有非常好的抑制效果,可望用于多种癌症的治疗。(The invention discloses tegaserod or pharmaceutically acceptable salts thereof serving as a JAK-STAT3 signal pathway inhibitor and an immunomodulator and application thereof in preparing antitumor drugs. The tegaserod and the pharmaceutically acceptable salt thereof have very good inhibition effects on the growth of various tumor cells in vitro and in vivo, and are expected to be used for treating various cancers.)
技术领域
本发明属于医药应用领域，涉及替加色罗的一种医药新用途，具体地说，是其作为JAK-STAT3信号通路抑制剂、免疫调节剂，可用于制备抗肿瘤药物。
背景技术
肿瘤是目前人类健康和生命的头号杀手，现临床用药远难满足患者需求，抗肿瘤药 物研发是当前药物研发领域中极为重要的研究方向。
细胞中JAK-STATs信号对细胞信号的传导及各项生理活动至关重要，该家族信号的异常会导致众多疾病的发生，包括癌症和免疫相关疾病。JAKs家族包括JAK1、 JAK2、JAK3和Tyk2四个成员。而JAKs下游的STATs家族包含7个成员，其中 STAT3是一个重要的家族成员，它在大量的肿瘤细胞系及人类肿瘤中被上游异常的酪氨 酸激酶组成性激活。异常的STAT3信号通过刺激细胞增殖、促进血管生成，抑制凋亡而 参与人类肿瘤的发生和发展。因此，抑制JAK-STAT3信号通路是一类具有潜在可行性 的瘤临床治疗策略。
目前抑制JAK-STAT3信号通路的临床治疗策略主要有以下几类：一是针对STAT3上游信号分子的酪氨酸激酶抑制剂，其中包括JAK激酶家族抑制剂；二是阻断STAT3 基因表达或蛋白功能，如通过显性-负向STAT蛋白或针对STAT3进行RNAi干扰；三 是利用小分子抑制STAT3激活及二聚化。
近年来，随着新药开发成本的快速上升，而药物开发成功率的逐步下滑，大部分药物专利到期，后备新药难以跟进的情况下，制药公司纷纷在现有药物基础上开发新的专 利保护药物。“老药新用”已成为国际药物研发的一个热点。
替加色罗(式I)，化学命名为2-[(5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)亚甲基]-N-戊基卡巴胼，是一种选择性5-羟色胺4(5-HT4)受体激动剂，其马来酸盐于2002年经FDA批准 上市，用于治疗肠易激综合症。此外，替加色罗对多种胃肠道障碍有治疗作用，包括如 胃灼热、胃气胀、手术后肠梗阻、腹部疼痛和不适、上腹部痛、恶心、呕吐、反胃、假 性肠梗塞和胃食管反流等。
发明内容
本发明意外地发现替加色罗对JAK-STAT3信号通路活性具有抑制活性，并能抑制肿瘤生长，同时能激活外周的免疫反应和肿瘤微环境中的免疫反应，具有对多种肿瘤的 体内、体外抗肿瘤效果。
基于以上发现，本发明提供了替加色罗或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中 的应用。
作为本发明优选的一种形式，所述肿瘤为存在JAK-STAT3信号通路异常激活的肿瘤。
作为本发明更优选的一种形式，所述JAK-STAT3信号通路异常激活的形式为JAK1、JAK2、JAK3、Tyk2或STAT3的磷酸化水平提升，优选地，为JAK1 Tyr1022/1023位点、JAK2 Tyr1007/1008位点、TYK2 Tyr1054/1055位点或STAT3 Tyr705位点的磷酸化水平提升。
作为本发明优选的一种形式，所述抗肿瘤药物还激活和/或增强免疫反应。
作为本发明较优选的一种形式，所述免疫反应为哺乳动物的免疫反应。
作为本发明较优选的一种形式，所述免疫反应包括外周的免疫反应和/或肿瘤微环境 中的免疫反应；更优地，激活和/或增强外周的免疫反应包括机体外周血中白细胞、中性 粒细胞、淋巴细胞和血小板中一种或多种的数量增加；激活和/或增强肿瘤免疫微环境中 的抗肿瘤免疫反应，包括增加肿瘤内部免疫细胞(CD45+)的浸润，或者部分或全部增 加杀伤性T细胞(CD8+)、辅助T细胞(CD4+)、活化T细胞(CD4+CD69+和 CD8+CD69+)、肿瘤浸润炎性中性粒细胞(CD11b+Ly6G+)、单核/巨噬细胞 (CD11b+Ly6C+)、自然杀伤细胞(CD335+)中的一种或多种的比例。
作为本发明优选的一种形式，所述药学上可接受的盐为替加色罗马来酸盐。
作为本发明优选的一种形式，所述肿瘤为以下任一种：脑瘤、生殖***肿瘤、淋巴系统肿瘤、胃癌、喉癌、鼻咽癌、皮肤癌、骨癌、血癌、白血病、乳腺癌、组织细 胞性淋巴癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、胰腺癌、***癌、宫颈 癌、肝癌、皮肤癌、上皮细胞癌等，优选地，为***癌、肺癌或者结肠癌。
此外，所述替加色罗或其药学上可接受的盐还可以通过与目前应用的或正处开发阶 段的抗肿瘤药物联合用药增加其临床效果。
替加色罗及其药学上可接受的盐在体内外对多种肿瘤细胞的生长有非常好的抑制效 果，可望用于多种癌症的治疗。本发明为肿瘤患者提供了新的治疗候选药物，可能进一 步提高对患者的疗效，改善其预后。
附图说明
图1为在STAT3荧光素酶药物筛选系统中替加色罗马来酸盐的对报告基因表达的抑制作用。
图2为通过免疫印迹实验表明替加色罗可抑制组成型活化和IL-6诱导的STAT3激活的示意图。
图3为通过免疫印迹实验表明替加色罗可选择性地抑制JAK激酶的磷酸化的示意图。
图4为替加色罗体外抑制肿瘤细胞生长的示意图。
图5为通过A549裸小鼠移植瘤模型表明腹腔给替加色罗可抑制移植瘤的生长的示意图。
图6口服替加色罗可以有效抑制非小细胞肺癌A549裸鼠移植瘤的生长。
图7口服替加色罗抑制***癌DU145裸鼠移植瘤的生长。
图8口服低剂量低频率替加色罗可以有效抑制DU145裸鼠移植瘤的生长。
图9口服替加色罗激活外周的和肿瘤微环境中的免疫反应。
图10替加色罗激活免疫系统抑制结直肠癌MC38同种移植瘤的生长。
具体实施方式
本发明提供包括替加色罗、替加色罗的游离形式、其药学上可接受的盐、前药、活性代谢产物在制备抗肿瘤药物中的应用。
可使用本领域已知技术分离替加色罗特定盐的游离形式。例如，可通过用适当的碱 稀水溶液例如NaOH稀水溶液、碳酸钾稀水溶液、稀氨水及碳酸氢钠稀水溶液处理该盐使游离形式再生。游离形式在某些物理性质例如在极性溶剂中溶解度上与其各自盐形式多少有些区别，但是为发明的目的这种酸盐及碱盐在其它药学方面与其各自游离形式相当。
可通过常规化学方法由替加色罗合成本发明的药学上可接受的盐。通常，通过离子 交换色谱或通过游离碱和化学计算量或过量的所需盐形式的无机或有机酸在适当溶剂或 多种溶剂的组合中反应制备。因此，本发明替加色罗的药学上可接受的盐包括通过替加色罗和无机或有机酸反应形成的本发明化合物的常规无毒盐。例如，常规的无毒盐包括 得自无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等的盐，也包括自有机酸 例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血 酸、扑酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2 一乙酰氧基一苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙基磺酸、 三氟乙酸等制备的盐，优选地为马来酸盐。
本发明涉及替加色罗或其药学上可接受的盐作为JAK-STAT3信号通路小分子抑制剂，及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
在一个实施方案中，本申请提供了一种利用替加色罗或其药学可接受的盐治疗人或 其它哺乳动物肿瘤等过度增殖性疾病或症状。
在一个实施方案中，本申请所涉及的化合物及其药学可接受的盐可以用于治疗或控 制组织细胞性淋巴癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、胰腺癌、乳腺 癌、***癌、肝癌、皮肤癌、上皮细胞癌、***癌、鼻咽癌、表皮细胞癌、宫颈 癌、口腔癌、人纤维肉瘤、白血病等过度增殖性疾病。
本申请所涉及的替加色罗及其药学可接受的盐可根据下面的方法用于治疗下列的疾 病以及下面没有列出的其它疾病：
1)一种利用替加色罗或其药学可接受的盐的药用组合物治疗人或其它哺乳动物的乳 腺癌的方法。包括但不局限于侵袭性导管癌、侵袭性小叶癌、原位管癌和原位小叶癌。
2)一种利用替加色罗或其药学可接受的盐的药用组合物治疗人或其它哺乳动物的呼 吸道癌的方法。包括但不局限于小细胞、非小细胞肺癌以及支气管腺瘤和胸膜肺母细胞 瘤。
3)一种利用替加色罗或其药学可接受的盐的药用组合物治疗人或其它哺乳动物的脑 癌的方法。包括但不局限于脑干和眼下神经胶质瘤、小脑和大脑星形细胞瘤、室管膜细 胞瘤以及神经外胚层和松果瘤体。
4)一种利用替加色罗或其药学可接受的盐的药用组合物治疗人或其它哺乳动物的 雄、雌性生殖器官的肿瘤的方法。雄性生殖器官的肿瘤包括但不限于***和睾丸癌。雌性生殖器官的肿瘤包括但不限于子宫内膜癌、***、卵巢癌、***癌和外阴癌以及 子宫内瘤。
5)一种利用替加色罗或其药学可接受的盐的药用组合物治疗人或其它哺乳动物的消 化道的肿瘤的方法。包括但不限于***癌、结肠癌、结肠直道癌、食道癌、胃癌、胰腺癌直肠癌、小肠癌或唾腺癌。
6)一种利用替加色罗或其药学可接受的盐的药用组合物治疗人或其它哺乳动物的尿 道的肿瘤的方法。包括但不限于膀胱癌、***癌、肾癌、肾盂癌、输尿管癌、膀胱浸润性***状尿路上皮癌或尿道癌。
7)一种利用替加色罗或其药学可接受的盐的药用组合物治疗人或其它哺乳动物的眼 癌的方法。包括但不限于眼内黑素瘤和视网膜细胞瘤。
8)一种利用替加色罗或其药学可接受的盐的药用组合物治疗人或其它哺乳动物肝癌 的方法。包括但不限于肝细胞瘤(具有或不具有纤维板变化的干细胞癌)，胆管癌(肝内胆 管癌)以及混合的肝细胞性胆管癌。
9)一种利用替加色罗或其药学可接受的盐的药用组合物治疗人或其它哺乳动物皮肤 癌的方法。包括但不限于扁平细胞癌、卡波济氏肉瘤、恶性黑素瘤、默克氏细胞皮肤癌以及非黑素瘤细胞癌。
10)一种利用替加色罗或其药学可接受的盐的药用组合物治疗人或其它哺乳动物头颈 癌的方法。包括但不限于喉、下咽、鼻咽、口咽癌以及唇和口腔癌。
11)一种利用替加色罗或其药学可接受的盐的药用组合物治疗人或其它哺乳动物淋巴 瘤的方法。包括但不限于AIDS相关淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、何 杰森病和中枢神经系统淋巴瘤。
12)一种利用替加色罗或其药学可接受的盐的药用组合物治疗人或其它哺乳动物肉瘤 的方法。包括但不限于软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维性组织细胞瘤、林把肉瘤和横纹肌肉瘤。
13)一种利用替加色罗或其药学可接受的盐的药用组合物治疗人或其它哺乳动物白血 病的方法。包括但不限于急性髓样白血病、急性林细胞白血病、慢性淋细胞白血病、慢性骨髓性白血病以及多毛细胞白血病。
根据标准药学技术，本发明替加色罗或其药学可接受的盐可单独或在药用组合物中 与药学上可接受的受体、辅料或稀释剂组合给予哺乳动物，优选人。可口服或皮下、肌注、腹膜内、静脉、直肠及局部、眼睛、肺部、鼻腔、胃肠外给药。
本申请所涉及的替加色罗或其药学可接受的盐的活性代谢产物，以及可以在体内转 变为本申请所涉及的化合物及其药学可接受的盐的结构的前药，也包含在本申请的权利 要求中。
术语“免疫反应”是指机体对于异己成分或者变异的自体成分做出的防御和识别反 应。根据在机体中发生或作用的位置，免疫反应通常包括系统性免疫反应和局部免疫反应。
术语“外周的免疫反应”属于系统性免疫反应，涉及离肿瘤本身很远“地方”的免疫系统的广泛激活，包括在血流中循环的免疫细胞对于异己或者变异的自体或者自体细胞释放的DAMP(Danger associated Molecular Pattern)所引起的激活、表型改变或增殖等的反应，也包括***节、脾或肠相关的淋巴样组织中的免疫反应。
肿瘤微环境是由肿瘤细胞和肿瘤浸润免疫细胞、新生血管及其内皮细胞、肿瘤相关 成纤维细胞和细胞外基质共同构成，能够促进肿瘤恶化，增加肿瘤侵袭力，规避宿主免疫作用以及对抗治疗反应。术语“肿瘤微环境中的免疫反应”，属于局部免疫反应，通 常包括肿瘤微环境中免疫细胞的组成、活性和功能。本发明中，肿瘤微环境中的免疫反 应包括肿瘤内部免疫细胞(CD45+)、杀伤性T细胞(CD8+)、辅助T细胞 (CD4+)、活化T细胞(CD4+CD69+和CD8+CD69+)，和肿瘤浸润炎性中性粒细胞 (CD11b+Ly6G+)、单核/巨噬细胞(CD11b+Ly6C+)、自然杀伤细胞(CD335+)等的水 平变化。激活和/或增强免疫肿瘤微环境中的免疫反应，指上述细胞全部或部分的数量或 比例增加。
替加色罗可以与已知的治疗或改进相似病状的其它药物联用。联合给药时，原来药 物的给药方式和剂量保持不变，而同时或随后服用替加色罗。当替加色罗与其它一种或几种药物同时服用时，优选使用同时含有一种或几种已知药物和替加色罗的药用组合 物。药物联用也包括在重叠的时间段服用替加色罗与其它一种或几种已知药物。当替加 色罗与其它一种或几种药物进行药物联用时替加色罗或已知药物的剂量可能比它们单独 用药时的剂量较低。
可以与替加色罗进行药物联用以***的药物或活性成分包括但不局限为：
***受体调节剂、雄激素受体调节剂、视网膜样受体调节剂、细胞毒素/细胞抑制 剂、抗增殖剂、蛋白转移酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、HIV蛋白激酶抑制剂、 逆转录酶抑制剂、血管生成抑制剂、细胞增殖及生存信号抑制剂、干扰细胞周期关卡的 药物和细胞凋亡诱导剂、细胞毒类药物、酪氨酸蛋白抑制剂、EGFR抑制剂、VEGFR抑 制剂、丝氨酸/苏氨酸蛋白抑制剂、Bcr-Abl抑制剂、c-Kit抑制剂、Met抑制剂、Raf抑 制剂、MEK抑制剂、MMP抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、组氨酸去乙酰化酶抑制剂、蛋 白酶体抑制剂、CDK抑制剂、Bcl-2家族蛋白抑制剂、MDM2家族蛋白抑制剂、IAP家 族蛋白抑制剂、STAT家族蛋白抑制剂、PI3K抑制剂、AKT抑制剂、整联蛋白阻滞剂、 干扰素-α、白介素-12、COX-2抑制剂、p53、p53激活剂、VEGF抗体、EGF抗体等。
在一个实施方案中，可以与替加色罗进行药物联用以***的药物或活性成分包 括但不局限为：阿地白介素、阿仑膦酸、干扰素、阿曲诺英、别嘌醇、别嘌醇钠、帕洛 诺司琼盐酸盐、六甲蜜胺、氨基格鲁米特、氨磷汀、氨柔比星、安丫啶、阿纳托唑、多 拉司琼、aranesp、arglabin、三氧化二砷、阿诺新、5-氮胞苷、硫唑嘌呤、卡介苗或tice 卡介苗、贝他定、醋酸倍他米松、倍他米松磷酸钠制剂、贝沙罗汀、硫酸博来霉素、溴 尿甘、bortezomib、白消安、降钙素、阿来佐单抗注射剂、卡培他滨、卡铂、康士得、 cefesone、西莫白介素、柔红霉素、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、克拉屈滨、氯屈磷 酸、环磷酰胺、阿糖胞昔、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素脂质体、***、磷酸 ***、戊酸***、地尼白介素2、狄波美、地洛瑞林、地拉佐生、己烯雌酚、大 扶康、多西他奇、去氧氟尿苷、阿霉素、屈***酚、钦-166-壳聚糖复合物、eligard、拉 布立酶、盐酸表柔比星、阿瑞吡坦、表阿霉素、阿法依伯汀、红细胞生成素、依铂、左 旋咪唑片、***制剂、17-β-***、雌莫司汀磷酸钠、炔雌醇、氨磷汀、羟磷酸、凡 毕复、依托泊甙、法倔唑、他莫昔芬制剂、非格司亭、非那司提、非雷司替、氟尿苷、 氟康唑、氟达拉滨、5-氟脱氧尿嘧啶核苷一磷酸盐、5-氟尿嘧啶、氟***、氟他胺、 福麦斯坦、1-β-D-阿糖呋喃糖胞噻啶-5’-硬脂酰磷酸酯、福莫司汀、氟维司群、丙种球蛋 白、吉西他滨、吉妥单抗、甲磺酸伊马替尼、卡氮芥糯米纸胶囊剂、戈舍瑞林、盐酸格 拉尼西隆、组氨瑞林、和美新、氢化可的松、赤型-羟基壬基腺嘌呤、羟基脲、替坦异贝 莫单抗、伊达比星、异环磷酰胺、干扰素α、干扰素-α2、干扰素α-2A、干扰素α-2B、 干扰素α-n1、干扰素α-n3、干扰素β、干扰素γ-1a、白细胞介素-2、内含子A、易瑞 沙、依立替康、凯特瑞、硫酸香菇多糖、来曲唑、甲酰四氢叶酸、亮丙瑞林、亮丙瑞林 醋酸盐、左旋四咪唑、左旋亚叶酸钙盐、左甲状腺素钠、左甲状腺素钠制剂、洛莫司 汀、氯尼达明、屈***酚、氮芥、甲钴胺、甲羟孕酮醋酸酯、醋酸甲地孕酮、美法仑、 酯化***、6-琉基嘌呤、美司钠、氨甲蝶呤、氨基乙酰丙酸甲酯、米替福新、美满霉 素、丝裂霉素C、米托坦、米托葱醌、曲洛司坦、柠檬酸阿霉素脂质体、奈达铂、聚乙 二醇化非格司亭、奥普瑞白介素、neupogen、尼鲁米特、三苯氧胺、NSC-631570、重组 人白细胞介素1-β、奥曲肽、盐酸奥丹西隆、去氢氢化可的松口服溶液剂、奥沙利铂、 紫杉醇、***磷酸钠制剂、培门冬酶、派罗欣、喷司他丁、溶链菌制剂、盐酸匹鲁卡 品、毗柔比星、普卡霉素、卟吩姆钠、泼尼莫司汀、司替***龙、***、倍美力、 丙卡巴脐、重组人类红细胞生成素、雷替曲塞、利比、依替膦酸铼-186、美罗华、力度 伸-A、罗莫肽、盐酸毛果芸香碱片剂、奥曲肽、沙莫司亭、司莫司汀、西佐喃、索布佐 生、唬钠甲强龙、帕福斯酸、干细胞治疗、链佐星、氯化锶-89、左旋甲状腺素钠、他莫 昔芬、坦舒洛辛、他索那明、tastolactone、泰索帝、替西硫津、替莫唑胺、替尼泊苷、 丙酸睾酮、***、硫鸟嘌呤、噻替哌、促甲状腺激素、替鲁膦酸、拓扑替康、托瑞米 芬、托西莫单抗、曲妥珠单抗、曲奥舒凡、维A酸、甲氨喋呤片剂、三甲基密胺、三甲 曲沙、乙酸曲普瑞林、双羟萘酸曲普瑞林、优福定、尿苷、戊柔比星、维司力农、长春 碱、长春新碱、长春酰胺、长春瑞滨、维鲁利秦、右旋丙亚胺、净司他丁斯酯、枢复 宁、紫杉醇蛋白质稳定制剂、acolbifene、干扰素r-lb、affinitak、氨基喋呤、阿佐昔芬、 asoprisnil、阿他美坦、阿曲生坦、BAY43-9006、阿瓦斯丁、CCI-779、CDC-501、西乐 葆、西妥昔单抗、克立那托、环丙孕酮醋酸酯、地西他滨、DN-101、阿霉素-MTC、 dSLIM、度他雄胺、edotecarin、依氟鸟氨酸、依喜替康、芬维A胺、组胺二盐酸盐、组 氨瑞林水凝胶植入物、钬-166DOTMP、伊班膦酸、干扰素γ、内含子-PEG、
ixabepilone、匙孔形血蓝蛋白、L-651582、兰乐肽、拉索昔芬、libra、lonafamib、米泼昔 芬、米诺屈酸酯、MS-209、脂质体MTP-PE、MX-6、那法瑞林、奈莫柔比星、新伐司 他、诺拉曲特、奥利默森、onco-TCS、osidem、紫杉醇聚谷氨酸酯、帛米酸钠、PN-
401、QS-21、夸西洋、R-1549、雷洛昔芬、豹蛙酶、13-顺维A酸、沙铂、西奥骨化 醇、T-138067、tarceva、二十二碳六烯酸紫杉醇、胸腺素α1、嘎唑呋林、tipifarnib、替 拉扎明、TLK-286、托瑞米芬、反式MID-lo7R、伐司朴达、伐普肽、vatalanib、维替泊 芬、长春氟宁、Z-100和唑来麟酸或它们的组合。
以下结合具体实施例进一步阐述本发明，所提供的实施例的目的是帮助进一步理解 本发明，其中所用到的特定材料、方式等是为描述本发明，而不构成对本发明适用范围上的限制。
实施例中所用到的实验材料以及通用的实验方法如下，若无特殊说明，均按制造商 的说明使用。
1.抗体及试剂
p-Tyr705-STAT3，p-Tyr1022/1023-JAK1，p-Tyr1007/1008-JAK2，p-Tyr1054/1055-Tyk2等抗体购自Cell Signaling Technology，α-Tubulin抗体购自Santa Cruz。 重组人IL-6细胞因子购自Peprotech。CD11b-PE-Cyanine 7、CD8a-PerCP-eFluorTM 710、CD45-APC-eFluor 780、Rat IgG1 kappa Isotype Control(eBRG1)、Anti-Mo CD32/CD16antibody抗体购买自Invitrogen。CD11b-AF488、CD4-Brilliant Violet 510 TM、CD206-PE-Cyanine 7、CD69-PE抗体购买自Biolegend。Ly-6G-FITC、Ly-6C-APC 抗体、红细胞裂解液、小鼠肿瘤解离试剂盒和人肿瘤解离试剂盒购买自美天妮。 Fixable Viability Dye(eFluorTM 506)和Ki67抗体购买自BD。IDEXX Procyte Dx* Reagent kit和ProCyte Dx*Stain Pack购自爱德士小动物公司。p-Tyr705-STAT3抗 体购买自Cell SignalingTechnology。Matrigel基底膜基质购买自Corning。
2.细胞培养
HeLa和SKA细胞(用STAT3-荧光素酶报告基因构建的A549细胞)使用DMEM 培养液培养，DU145，A549，DLD1，H460,MC38使用RPMI 1640培养液培养。常规培 养时，培养液中均添加10％胎牛血清(FBS)、100IU/ml青霉素和100mg/ml链霉素。 所有细胞均培养于37℃，5％CO2环境下。
3.STAT3依赖的荧光素酶报告基因检测
将SKA细胞以1×104/孔密度接种至白色96孔板中，于37℃，5％CO2培养过夜。 按待测试浓度加入待测药物，作用细胞24小时。使用荧光素酶试剂盒(购自Promega) 在酶标仪上测定荧光素酶活性。
4.蛋白免疫印迹
使用RIPA缓冲液裂解收获细胞，裂解液中经SDS-PAGE胶分离后，将蛋白转移至 硝酸纤维素膜(购自GE Healthcare)。加入一抗结合膜上待检测蛋白，随后用辣根过氧 化物酶偶联的二抗(购自爱必信)孵育，最后使用ImmobilonTM Western化学发光HRP 底物(Millipore)检测形成的免疫复合物，并用Tanon 5200成像系统上拍照成像。
5.流式细胞术分析肿瘤细胞周期
将DU145细胞以5×105/孔密度接种到6孔板中，按需求加入不同浓度的待测药物或换用无血清培养基培养。对于细胞周期测定实验，处理24小时后收获细胞，用细胞周 期染色试剂盒(购自Lianke Bio.货号：CCS012)染色；对于细胞凋亡测定实验，处理 48小时后，eBioscienceTM Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒(购自Invitrogen)染色。最 后通过流式细胞仪检测染色后的细胞。
6.细胞活性测定
细胞以3,000个/孔密度接种至96孔板中。18小时后，加入不同浓度的待测药物作用与细胞。72小时后，向每个孔中加入10μl刃天青(1mg/ml)并再温育3小时，随后 使用
7.裸小鼠抑制瘤动物模型和药物体内抗肿瘤活性测定
雌性NRMI nu/nu无胸腺裸鼠(SPF级，6周龄，体重17-20g)购自购买自集萃生 物，按标准要求饲养于恒温恒湿环境内，并有12小时明暗循环控制。动物实验经中国海 洋大学实验动物委员会批准，并符合美国国立卫生研究院出版的“实验动物护理和使用 指南”(NIH出版物第85-23号，1996年修订)。
裸鼠皮下植入A549细胞悬液(雌鼠)或者DU145 matrigel细胞悬液(雄鼠)，待 其生长形成可触及的实体肿瘤后，将造模小鼠随机分组，每组内含7-10只小鼠，根据实 验分组进行给药处理。整个试验过程中，定期测量动物体重。肿瘤体积的计算方式为： 肿瘤体积＝0.5×长度×宽度×宽度。
8.流式细胞分析免疫细胞表面标志物
实验终止后，小鼠CO2处死，取适量肿瘤组织，放入含有小鼠肿瘤解离试剂 (MC38移植瘤)或人肿瘤解离试剂(DU145移植瘤)的解离管中，利用组织解离器 (美天妮)进行解离，分离的单细胞进行红细胞裂解和死细胞染色后，使用封闭液4℃ 对细胞进行孵育，加入相应抗体，FACSAriaIII流式细胞分选仪上机检测分析结果。
9.血细胞分析
荷瘤小鼠CO2处死后，心脏取血，放入EDTA抗凝管中，通过爱德士ProCyte Dx 全自动血细胞分析仪进行血液细胞成分检测。
10.免疫组化
石蜡切片用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗，抗原修复，使用封闭液37℃恒温箱孵育后一抗处理、二抗处理，DAB染色液，使用苏木素、分化液、氨水处理，经各级乙醇 和二甲苯处理后中性树脂封固。
11.转录组测序
取适量肿瘤组织，液氮速冻后由美吉生物公司进行真核mRNA测序。基于IlluminaNovaseq 6000测序平台，对真核生物特定组织或细胞在某个时期转录出来的所有mRNA 进行测序，测序实验采用Illumina TruseqTM RNA sample prep kit方法进行建库。原始数据进行质控、序列比对、转录本组装、功能注释和表达量分析。利用DESeq2差异分析 软件进行显著性差异基因分析(p-value<0.05)，针对显著差异基因进行KEGG信号通 路分析。
实施例1替加色罗在组成型STAT3激活荧光素酶细胞模型中表现出抑制活性。
利用基于组成型STAT3激活的荧光素酶表达细胞模型(参见中国专利1407357)，发现替加色罗马来酸盐对STAT3有显著抑制作用，IC50为5.06μM(图1)。
实施例2替加色罗抑制STAT3的激活
在正常培养的细胞中加入不同浓度的替加色罗，作用2小时时间后，收取细胞蛋白裂解液进行蛋白免疫印记检测，通过STAT3 Tyr705位点的磷酸化状态来观察STAT3的 激活状态。
结果显示，替加色罗在DU145(图2A)和A549(图2B)这两株STAT3组成型激 活的细胞中，均能在药物处理2小时后呈剂量依赖地抑制STAT3的激活。
IL-6是激活STAT3信号的主要细胞因子。Hela细胞先用不同浓度替加色罗处理2个小时后，加入5ng/ml的IL-6刺激10分钟后，收取细胞，提取总蛋白，Western检测 STAT3的磷酸化(Y705)。如图2C所示，在HeLa细胞中，替加色罗同样呈剂量依赖 地抑制由IL-6诱导产生的STAT3的激活。
实施例3替加色罗抑制JAK激酶家族活性。
STAT3通常是由其上游的JAK激酶自身磷酸化后被JAK激酶磷酸化激活。在 DU145细胞中加入不同浓度的替加色罗，孵育2小时后，发现替加色罗在7.5μM浓度 水平下，可抑制DU145细胞中JAK1 Tyr1022/1023位点和JAK2 Tyr1007/1008位点的磷 酸化，并在较高浓度下(15μM)，对TYK2 Tyr1054/1055位点的磷酸化也有抑制作用 (图3)。这表明替加色罗为JAK激酶家族抑制剂，其中，对JAK1和JAK2表现出比 对TYK2更高的亲和力。替加色罗通过特异性地抑制JAK激酶的活化，从而下调肿瘤细 胞中的STAT3磷酸化。
实施例4替加色罗对肿瘤细胞的细胞生长抑制作用。
替加色罗对多种不同来源的肿瘤细胞生长具有抑制作用(图4)。替加色罗作用72小时后，测定细胞活性以反映药物对细胞生长的抑制作用。替加色罗各细胞生长抑制的IC50值分别为：***癌DU145细胞2.5μM，肺癌H460细胞3.1μM，肺癌A549细胞 5.7μM，DLD1结肠癌细胞8.7μM。
实施例5腹腔注射替加色罗抑制裸鼠移植瘤生长。
在裸小鼠A549肺癌移植瘤动物模型上，腹腔注射替加色罗可以抑制模型动物体内移植瘤细胞的生长(图5A和5B)。与对照组相比，5mg/kg替加色罗(i.p.)可有效抑 制A549肿瘤细胞生长，其抑瘤效果与100mg/kg吉非替尼(p.o.)用药组相当。整个试 验过程中，所有试验小鼠体重均无显著变化(图5C)，到达试验终点后，解剖后也均未 观察到明显器官损伤，表明替加色罗没有明显毒性，具有良好的用药安全性。
实施例6口服替加色罗可以有效抑制非小细胞肺癌A549裸鼠移植瘤的生长。
鉴于替加色罗在治疗便秘型肠易激综合征中是通过口服方式给药，我们测试了替加 色罗口服给药是否可以有效抑制体内肿瘤的生长。图6A和图6B的肿瘤重量和肿瘤体积结果均表明口服替加色罗可以有抑制A549裸鼠移植瘤的生长，并且图6C数据表明在口 服给药剂量下小鼠均未发生体重的下降，说明用药剂量安全，没有观察到明显的药物毒 性。
实施例7口服替加色罗抑制***癌DU145裸鼠移植瘤的生长。
此外，我们又选取了具有STAT3组成型活化的人***癌细胞系DU145，也检测 了替加色罗对其裸鼠移植瘤生长的影响。图7A和7B结果表明口服替加色罗可以有效抑 制DU145裸鼠移植瘤的生长，并且没有明显的药物毒性(图7C)。图7D和7E的磷酸 化STAT3免疫组化结果表明，替加色罗可以有效抑制DU145裸鼠移植瘤中STAT3的磷 酸化水平，在体内具有靶向JAK/STAT3信号通路的能力。
实施例8口服低剂量低频率替加色罗可以有效抑制DU145裸鼠移植瘤的生长。
在A549和DU145裸鼠移植瘤模型中，我们均观察到抑瘤率与替加色罗的使用剂量之间没有剂量依赖性，高剂量替加色罗并没有增强其肿瘤抑制活性。接下来我们尝试了 不同的给药频率，检测是否进一步降低高剂量组的给药频率后，口服替加色罗仍可以有 效抑制肿瘤生长。图8A和8B结果均表明降低给药频率为两天一次口服给药后，替加色 罗的肿瘤抑制能力更强，并且图8C小鼠体重结果表明此浓度和给药频率下替加色罗没 有明显的药物毒性。图8D和8E的细胞增殖标志物Ki67的免疫组化结果也表明，在 1.25mg/kg口服两天一次的替加色罗处理后肿瘤的增殖能力下降。以上结果均表明，替 加色罗低剂量低频率口服给药可以有效抑制肿瘤的生长。
实施例9口服替加色罗激活外周的和肿瘤微环境中的免疫反应。
鉴于替加色罗在低剂量低频率给药下的有效性以及其非浓度依赖的抗肿瘤活性，我 们推测替加色罗可能类似于免疫调节剂，在体内也调节了肿瘤的免疫微环境，从而产生了双效调节抑制肿瘤生长的效果。为了验证这一假设，我们首先检测了替加色罗给药后 外周血中免疫细胞的组成变化。图9A的血液分析仪数据表明，类似于阳性药吉非替 尼，替加色罗可以刺激外周血中白细胞总数、中性粒细胞、淋巴细胞和血小板的增加， 有力地刺激了外周的免疫反应。
进一步我们通过流式细胞术检测了DU145裸鼠移植瘤内部免疫细胞的组成和比例， 图9B结果表明，替加色罗给药后可以增加肿瘤内部免疫细胞(CD45+)的比例，增加 肿瘤浸润炎性中性粒细胞(CD11b+Ly6G+)、单核/巨噬细胞(CD11b+Ly6C+)和自然 杀伤细胞(CD335+)的比例，从而产生抑制肿瘤细胞生长的作用。阳性药吉非替尼也有类 似的免疫调节作用。
为了进一步探究替加色罗在抗肿瘤过程中的免疫调节作用，我们利用转录组测序技 术，针对DU145裸鼠移植瘤进行了mRNA测序，并且通过与小鼠参考基因组比对得到DU145裸鼠移植瘤中鼠源细胞总体的mRNA表达情况。如图9C所示，替加色罗处理组 肿瘤样本的小鼠基质细胞中存在大量发生显著变化的基因，通过KEGG信号通路分析可 以看到(图9D)，在细胞因子受体相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)以 及抗原递呈过程中(antigen processing and presentation)均发生了显著上调。这一结果与 图9B的流式细胞分析结果相一致，均证明替加色罗可以通过调节肿瘤免疫微环境发挥 抗肿瘤的效果。
以上结果表明，替加色罗可以激活全身性和肿瘤微环境中的免疫细胞组成和功能， 从而发挥双效抗肿瘤的效果。
实施例10替加色罗激活免疫系统抑制结直肠癌MC38同种移植瘤的生长。
在裸鼠移植瘤模型中，我们发现替加色罗具有免疫激活功能和抗肿瘤效果。裸鼠体 内部分获得性免疫细胞缺陷，其免疫系统不健全，因此我们进一步在免疫健全鼠中检测了替加色罗的抗肿瘤效果以及免疫调节作用。结果表明替加色罗可以有效抑制结直肠癌MC38移植瘤的生长(图10A和10B)，并且没有明显的药物毒性(图10C)。通过图 10D流式细胞检测结果显示，替加色罗促进肿瘤内部免疫细胞(CD45+)的浸润。这一 结果与DU145裸鼠移植瘤模型结果相一致，均表明替加色罗的免疫激活作用。同时替加 色罗组肿瘤内部杀伤性T细胞(CD8+)和辅助T细胞(CD4+)浸润增加，活化T细胞 比例增加(CD4+CD69+和CD8+CD69+)(图10D)。这些结果表明，替加色罗可以激 活获得性免疫细胞的肿瘤杀伤作用，进一步发挥抗肿瘤作用。
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