阅读说明：本技术 一种植物脲酶保护剂及其使用方法 (Plant urease protective agent and use method thereof ) 是由 周云东 严柏杨 张燚 叶至韬 蒋超 于 2020-07-13 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种植物脲酶保护剂及其使用方法,植物脲酶保护剂主要由抗氧化剂、缓冲剂和保护成分组成,其中保护成分为半胱氨酸和甘氨酸的混合物,可以保护重金属环境下植物脲酶活性,诱导碳酸钙沉淀。植物脲酶保护剂的使用方法包括以下步骤：1)制备土样；2)检测土样重金属离子浸出液中重金属离子的浓度；3)配制保护成分浓度为4g/L～20g/L的保护剂,并与植物脲酶溶液等体积混合得到改良后的植物脲酶溶液；4)含不同保护成分浓度的改良后的植物脲酶溶液与土样重金属离子浸出液反应,通过电导率法测定植物脲酶活性,筛选保护成分浓度；5)以筛选所得保护成分浓度配制改良后的植物脲酶溶液,并与尿素、钙盐混合,共同处理土体。(The invention provides a plant urease protective agent and a use method thereof, wherein the plant urease protective agent mainly comprises an antioxidant, a buffering agent and a protective component, wherein the protective component is a mixture of cysteine and glycine, and can protect the activity of plant urease in a heavy metal environment and induce calcium carbonate precipitation. The use method of the plant urease protective agent comprises the following steps: 1) preparing a soil sample; 2) detecting the concentration of heavy metal ions in the soil sample heavy metal ion leaching solution; 3) preparing a protective agent with the concentration of the protective component of 4 g/L-20 g/L, and mixing the protective agent with the plant urease solution in equal volume to obtain an improved plant urease solution; 4) reacting the improved plant urease solution containing different protective component concentrations with the soil sample heavy metal ion leaching solution, measuring the plant urease activity by a conductivity method, and screening the protective component concentrations; 5) preparing improved plant urease solution with the screened concentration of the protective components, mixing the plant urease solution with urea and calcium salt, and treating soil body together.)

一种植物脲酶保护剂及其使用方法

技术领域

本发明属于环境岩土技术领域，具体涉及一种植物脲酶活性的保护剂及其使用方法。

背景技术

植物脲酶诱导碳酸钙沉淀技术是岩土工程领域的一种新兴技术，通过向土体中增添一定比例的尿素、钙源和植物脲酶，可以诱导生成具有胶结能力的碳酸钙，使土颗粒相互胶结，从而达到改良土体的目的。目前，国内外学者专家对植物脲酶诱导碳酸钙沉淀技术进行了大量实验研究，证实其能有效增强土体强度、改善土体渗透性能、增强土体抗风蚀和抗水流侵蚀的能力。此外，该技术施工简便，工期短，经济性好，已经被应用于地基的抗液化处理、沙漠的防风固沙、边坡加固等多种工程领域，取得了良好的效果。

但植物脲酶诱导碳酸钙沉淀技术同样也有需要完善的地方，其中一项就是植物脲酶的活性易受外界环境影响，温度、PH值、土质条件均会对植物脲酶的活性产生影响，进而干扰碳酸钙沉淀的生成，最终影响到土体改良效果。在环境因素中，重金属离子对植物脲酶活性的最为强烈，镉、铅、铜、锌等多种重金属离子的存在会严重干扰到此技术的效果，实验表明，微量浓度的重金属离子也会严重干扰植物脲酶的活性，导致碳酸钙生成量无法达到预期的成果。因此，为了保证植物脲酶诱导碳酸钙技术在重金属浓度超标的土体中正常应用，需要找到一种植物脲酶保护剂，保护其活性不受到外界重金属的影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物脲酶保护剂及其使用方法，使植物脲酶的活性不受土体环境中重金属的影响，能够保持正常的尿素分解活性，生成预期数量的碳酸钙。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：一种植物脲酶保护剂，主要由抗氧化剂、缓冲剂和保护成分组成，所述抗氧化剂为抗坏血酸和柠檬酸的混合物，所述缓冲剂为磷酸盐缓冲液，所述保护成分为半胱氨酸（2-氨基-3-巯基丙酸）和甘氨酸（氨基乙酸）的混合物。

进一步的，所述抗坏血酸在保护剂中的浓度为5g/L～15g/L，所述柠檬酸在保护剂中的浓度为1g/L～10g/L。

进一步的，所述磷酸盐缓冲液浓度为0.1mol/L～0.2mol/L，pH值为7.6。

进一步的，所述保护成分浓度为4g/L～20g/L，其中半胱氨酸和甘氨酸的质量比为1：1。

一种植物脲酶保护剂的使用方法，包括以下步骤：

步骤一：取土料烘干，研磨，过筛，制成试验用土样。

步骤二：将土样加水配制成土样悬浊液，提取其中重金属离子，离心获得土样重金属离子浸出液，通过火焰原子吸收法检测其中重金属离子的浓度。

步骤三：将抗氧化剂和不同用量的保护成分溶于缓冲剂中，分别配制保护成分浓度为4g/L～20g/L的植物脲酶保护剂，并与植物脲酶溶液等体积混合，搅拌均匀后得到改良后的植物脲酶溶液。

步骤四：将步骤三中含不同保护成分浓度的改良后的植物脲酶溶液分别与步骤二中的土样重金属离子浸出液混合，磁力搅拌均匀后静置，采用电导率法分别测试植物脲酶活性，筛选保护成分浓度。

植物脲酶水解尿素会产成碳酸根离子与铵根离子，溶液内的离子变化则会引起电导率的变化。而溶液电导率变化量与尿素水解量成正相关，因此单位时间内的尿素水解量可以作为衡量植物脲酶活性的指标。电导率法步骤如下：从各个试验组内取3 mL混合溶液，加入体积为27 mL浓度为1.11 mol/L的尿素溶液，在室温条件下利用电导率仪测量其每5分钟的电导率变化情况，连续测量3次取均值，将均值换算成每分钟植物脲酶催化尿素水解量。

步骤五：依据步骤四筛选所得保护成分浓度配制改良后的植物脲酶溶液，并与尿素、钙盐混合，共同处理土体。

进一步的，所述步骤三中的植物脲酶溶液是以豆科植物为原料制成的脲酶。

进一步的，所述步骤四中的植物脲酶保护剂中保护成分浓度的筛选标准为：在植物脲酶活性恢复率S≥0.6的基础上，选用单位质量保护剂对植物脲酶活性的提升值K最大值对应的保护成分浓度；其中S=M_3n/M₁，M₁为普通植物脲酶溶液在常温常规环境下的酶活性，M_3n为改良后的植物脲酶溶液在重金属溶液下的活性；K=（M_3n-M₂）/Δm，M₂为普通植物脲酶溶液在重金属溶液中的酶活性，Δm为添加保护剂的质量，以S值最大K值的标准筛选保护成分用量。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：

1）本发明提供的植物脲酶保护剂，其组分特异性适用于植物脲酶，不会对植物脲酶活性产生不良影响。同时，所添加的保护剂无毒无害，环境友好，成本低廉，经济性好。

2）本发明提供的植物脲酶保护剂与植物脲酶溶液混合使用，可以消除土壤重金属对植物脲酶活性的不利影响，在植物脲酶保护剂中保护成分浓度4g/L～20g/L范围内植物脲酶活性恢复率可达0.28~0.74，为不加植物脲酶保护剂的2.8~7.4倍。使植物脲酶诱导碳酸钙沉淀技术在重金属环境中可以正常进行，操作简便，施工难度低。

具体实施方式

下面通过实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，目的是帮助本领域的技术人员对本发明的构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解，并有助于其实施。

实施例1

步骤一：从重金属污染土地区取样，将土样放入100℃烘箱内12小时。将烘干后的土样反复研磨，过0.25mm筛后收集起来。

步骤二：取1g土样粉末置于烧杯，倒入500mL去离子水，放入一个磁力转子，将烧杯放在磁力搅拌机上，搅拌均匀后用稀盐酸和氢氧化钠溶液将其pH值调至7.6。

将土样混合液分装入5支离心管中，将离心管编号后放入恒温摇床，温度保持在25℃，以200rpm转速振荡24小时。将离心管放入小型平衡离心机中，以4000rpm转速离心15分钟，离心后取得上清液，即为土样重金属浸出液。通过火焰原子吸收法获得浸出液重金属离子浓度为Cu²⁺= 96mg/L。

步骤三：称取大豆放入60℃烘箱中2个小时，将干燥的大豆磨成粉末，以2：25的固液比配制成豆粉溶液，将搅拌均匀的豆粉溶液放入低速冷冻离心机中，以4000rpm转速离心15分钟，离心后过滤即得植物脲酶溶液（制备方法参考文献《大豆脲酶基本特性与粉质砂土的固化研究》杨丰，何稼，亓永帅，等.河南科学，2019，37（1）：118-124.）。

取五个1L容积的烧杯，将10g抗坏血酸、5g柠檬酸和2g、4g、6g、8g、10g保护成分（甘氨酸与半胱氨酸的混合物，混合质量比为1:1）分别溶于500mL磷酸盐缓冲液（浓度0.15mol/L，pH=7.6）中,搅拌均匀即得五组保护成分浓度分别为4g/L、8g/L、12g/L、16g/L、20g/L的植物脲酶保护剂。再向每个烧杯中添加500ml植物脲酶溶液，搅拌均匀后即得改良后的植物脲酶试剂。

步骤四：将步骤三中的五组改良后的植物脲酶溶液分别于和步骤二中的土样重金属浸出液等体积混合，用磁力搅拌机搅拌均匀。各组溶液内取3 mL混合溶液，加入体积为27mL浓度为1.11 mol/L的尿素溶液，在室温条件下测量电导率，并换算成酶活性M31~35。

对照组1（普通植物脲酶溶液在常温常规环境下的酶活性）：取步骤三中的植物脲酶溶液与去离子水按体积比1:3混合后获得稀释后的豆酶溶液，取3 mL稀释豆酶溶液，加入体积为27 mL浓度为1.11 mol/L的尿素溶液，在室温条件下测量电导率，并换算成酶活性M₁。

对照组2（普通植物脲酶溶液在重金属环境下的酶活性）：取步骤三中的植物脲酶溶液与去离子水等体积混合后获得稀释的豆酶溶液 ，将稀释的豆酶溶液与步骤二中的重金属浸出液等体积混合，取3 mL混合溶液，加入体积为27 mL浓度为1.11 mol/L的尿素溶液，在室温条件下测量电导率，并换算成酶活性M₂。

植物脲酶活性恢复率S=M₂ or M_3n/M₁（M₁为普通植物脲酶溶液在常温常规环境下的酶活性，M_3n为改良后的植物脲酶溶液在重金属溶液下的活性）；单位质量保护剂对植物脲酶活性的提升值K=（M_3n-M₂）/Δm（M₂为普通植物脲酶溶液在重金属溶液中的酶活性，Δm为添加保护剂的质量，即为半胱氨酸的质量与甘氨酸的质量之和），以S值≥0.6的基础上选用最大K值对应用量的标准筛选保护成分用量。

步骤五：依据步骤四筛选出植物脲酶保护剂中保护成分浓度为16g/L（其中甘氨酸8g/L、半胱氨酸8g/L），以此用量与20g/L抗坏血酸、10g/L柠檬酸共同溶于磷酸盐缓冲液（浓度0.15mol/L，pH=7.6）中大量配制植物脲酶保护剂，与植物脲酶溶液等体积混合后配制改良后的植物脲酶溶液。改良后的植物脲酶溶液与0.3mol/L的尿素-钙盐溶液等体积混合，共同用于重金属污染地区土体的施工。

本发明可以消除土壤重金属对植物脲酶的不利影响，使植物脲酶诱导碳酸钙沉淀技术在重金属环境中可以正常进行，操作简便，施工难度低。同时，所添加的保护剂无毒无害，环境友好，成本低廉，经济性好。