阅读说明：本技术 一种超敏分子锁钥免疫聚合酶链式反应检测方法 (Hypersensitive molecule lock-key immune polymerase chain reaction detection method ) 是由 朱应竹 谢正顺 于 2020-06-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种超敏分子锁钥免疫聚合酶链式反应检测方法,包括下列步骤：(1)利用生物大分子之间的特异的结合识别目标生物大分子,生物大分子之间的特异的结合会形成夹心复合物,夹心复合物的一个单体上连接有DNA片段；(2)使用聚合酶链式反应扩增夹心复合物连接的DNA片段对目标蛋白定量；(3)使用分子锁钥来消除DNA气溶胶对测试系统的干扰,使信噪比提高了3～4个数量级,灵敏度也提高了3个数量级。本发明属于医学检验学技术领域,具体是提供了一种高灵敏度检测医学样本中的蛋白质目标生物大分子的超敏分子锁钥免疫聚合酶链式检测方法,该检测方法在诊断和监测病原体、肿瘤、神经退行性疾病和遗传病等领域有比较高的使用价值。(The invention discloses a hypersensitive molecule lock key immune polymerase chain reaction detection method, which comprises the following steps: (1) recognizing target biological macromolecules by utilizing specific binding among the biological macromolecules, wherein the specific binding among the biological macromolecules can form a sandwich compound, and a DNA fragment is connected to one monomer of the sandwich compound; (2) quantifying the target protein using polymerase chain reaction amplification sandwich complex-linked DNA fragments; (3) the molecular lock key is used for eliminating the interference of the DNA aerosol on a test system, so that the signal to noise ratio is improved by 3-4 orders of magnitude, and the sensitivity is also improved by 3 orders of magnitude. The invention belongs to the technical field of medical inspection, and particularly provides a hypersensitive molecular lock-key immune polymerase chain type detection method for detecting protein target biomacromolecules in a medical sample with high sensitivity, wherein the detection method has higher use value in the fields of diagnosis and monitoring of pathogens, tumors, neurodegenerative diseases, genetic diseases and the like.)

一种超敏分子锁钥免疫聚合酶链式反应检测方法

技术领域

本发明属于医学检验学技术领域，具体是指一种超敏分子锁钥免疫聚合酶链式反应检测方法。

背景技术

蛋白质分子标记物的检测是医学检验的重要课题。常见的检测蛋白质的方法包括酶联免疫实验(ELSIA)、放射性免疫技术(RIA)、化学发光免疫实验(CLIA)和免疫荧光(IF)等等。另外，质谱、流式技术、蛋白质芯片等亦可用于蛋白的检测。上述方法的灵敏度可以满足常见的应用场景，但是，对于一些对灵敏度要求极高的蛋白质检测应用却不适用。

TakeshiSano等在1992报导了使用免疫PCR法可以测检到数量为10^-23mole的蛋白；Suman Sharma等在2019年报导了可以使用实时免疫PCR法，测试结核分枝杆菌MPT64和PstS1的浓度，检测范围可达0.95pg/mL-95ng/mL。然而免疫PCR法尚不适合在临床中使用，原因是免疫反应中开放式操作会引入大量的DNA气溶胶，而免疫PCR法具有极高的灵敏度，这些气溶胶会污染阴性样本，造成大量假阳性结果出现。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种检测医学样本中的生物大分子的超敏分子锁钥免疫聚合酶链式反应检测方法，该检测方法在诊断和监测病原体、肿瘤、神经退行性疾病(包括阿尔兹海默症)和遗传病等领域有比较高的使用价值。

本发明采取的技术方案如下：本发明为一种超敏分子锁钥免疫聚合酶链式反应检测方法，包括下列特征：

(1)利用生物大分子之间的特异的结合识别目标生物大分子：生物大分子之间的特异的结合会形成夹心复合物，所述夹心复合物的一个单体上连接有DNA片段，所述单体连接DNA片段的方式包括共价偶联方式和非共价偶联方式；

(2)使用聚合酶链式反应扩增夹心复合物连接的DNA片段对目标生物大分子定量；

(3)使用分子锁钥来消除DNA气溶胶对测试系统的干扰：所述分子锁钥包括锁分子DNA片段和钥分子DNA片段，所述锁分子DNA片段和钥分子DNA片段为两条部分互补的DNA片段，单独的锁分子DNA片段和钥分子DNA片段本身均不能被扩增，只有两条DNA片段通过互补的区域结合形成锁钥复合物时，才能被扩增并检测出来。

进一步地，步骤(1)所述的目标生物大分子包括但不限于抗原、抗体、脂多糖、脂蛋白或者核酸中的一种或者多种有机分子。

进一步地，步骤(1)所述的非共价偶联方式包括但不限于生物素亲合素连接、抗原抗体反应、核酸适体和以氢键为主的DNA互补结构。

进一步地，步骤(2)所述的聚合酶链式反应是以指数增长的方式复制目标DNA片段的方式，所述聚合酶链式反应包括但不限于普通聚合酶链式反应、荧光定量聚合酶链式反应或者恒温聚合酶链式反应。

采用上述结构本发明取得的有益效果如下：本方案为一种超敏分子锁钥免疫聚合酶链式反应检测方法，利用生物大分子之间的特异的结合识别目标生物大分子，并通过特异性的结合(如抗原抗体间的免疫反应)形成连接有DNA片段的夹心复合物，然后通过聚合酶链式反应扩增夹心复合物连接的DNA片段，并通过两条含有互补DNA片段的分子锁钥消除DNA气溶胶对测试系统的干扰，使信噪比提高了3～4个数量级，灵敏度也提高了3个数量级，实现了医学样本中的蛋白质目标生物大分子的高灵敏度检测。该检测方法在检测和诊断病原体、肿瘤、神经退行性疾病(包括阿尔兹海默症)和遗传病等领域有比较高的使用价值。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为本发明一种超敏分子锁钥免疫聚合酶链式反应检测方法分子锁钥反应的原理图；

图2为以检测PstS1为例本发明一种超敏分子锁钥免疫聚合酶链式反应检测方法与普通

免疫聚合酶链式反应的效果对比图；

图3为本发明一种超敏分子锁钥免疫聚合酶链式反应检测方法检测重组培养滤液蛋白10(CFP10)参考品的线性范围曲线图；

图4为本发明一种超敏分子锁钥免疫聚合酶链式检测反应方法检测早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT6)参考品的线性范围曲线图；

图5为本发明一种超敏分子锁钥免疫聚合酶链式反应检测方法检测PstS1蛋白参考品的线性范围曲线图；

图6和图7为本发明一种超敏分子锁钥免疫聚合酶链式反应检测方法以培养滤液蛋白10(CFP10)为标识物时检测临床样本的性能表征图；

图8和图9为本发明一种超敏分子锁钥免疫聚合酶链式反应检测方法以早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT6)为标识物时检测临床样本的性能表征图；

图10和图11为本发明一种超敏分子锁钥免疫聚合酶链式反应检测方法以PstS1蛋白为标识物时检测临床样本的性能表征图。

其中，1、固相载体；2、抗原；3、抗体；4、锁分子；5、钥分子。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，下面描述中使用的词语“前”、“后”、“左”、“右”、“上”和“下”指的是附图中的方向，词语“内”和“外”分别指的是朝向或远离特定部件几何中心的方向。

图1为以抗原抗体双抗夹心复合物为基本结构的分子锁钥的反应原理图：固相载体可以是磁微粒、聚苯乙烯微粒、聚苯乙烯材质的微孔反应板，将抗体包被或连接到固相载体上，用来捕获抗原；随后加入连接有锁分子的配对抗体，反应完成后洗涤；之后加入钥分子，反应完成后洗涤；将洗涤产物加入到PCR反应体系中。反应过程过不可避免地形成核酸的气溶胶，气溶胶主要是由单独的锁分子和钥分子组成。单独的锁分子和钥分子因为没有与引物互补的区域，不能被扩增；由于核酸气溶胶浓度低，形成复合物浓度极低，到检测不出的程度，故核酸气溶胶对PCR反应的干扰可以忽略；而锁钥分子复合物在PCR反应体系中会延长成标准的PCR反应模板，可以被扩增。以上原因使反应体系具有较高的信噪比，可以检测到浓度很低的生物大分子对象。

如图1～11所示，本发明一种超敏分子锁钥免疫聚合酶链式反应检测方法，包括下列特征：

(1)利用生物大分子之间的特异的结合识别目标生物大分子：目标生物大分子包括抗原、抗体、脂多糖、脂蛋白、核酸其他有机分子，目标生物大分子与其他生物大分子(如抗原或抗体)的特异性结合会形成夹心复合物，夹心复合物连接有DNA片段，夹心复合物连接DNA片段的方式包括共价偶联方式和非共价偶联方式，非共价偶联方式包括生物素亲合素连接、抗原抗体反应、核酸适体和以氢键为主的DNA互补结构以及其他的连接方式，特异免疫反应连接可以发生在免疫反应之前或之后，或与免疫反应同时发生；

(2)使用聚合酶链式反应扩增夹心复合物连接的DNA片段，对目标蛋白定量，聚合酶链式反应包括普通聚合酶链式反应、荧光定量聚合酶链式反应、恒温聚合酶链式反应等以指数增长的方式复制目标DNA的方式；

(3)使用分子锁钥来消除DNA气溶胶对测试系统的干扰：分子锁钥包括锁分子DNA片段和钥分子DNA片段，锁分子DNA片段和钥分子DNA片段为两条部分互补的DNA片段，单独的锁分子DNA片段和钥分子DNA片段本身均不能被扩增，只有两条DNA片段通过互补的区域结合形成锁钥复合物时，才能被扩增并检测出来。

实施例：

使用超敏分子锁钥免疫聚合酶链式反应检测方法测试血样、胸腹水、脑脊液中结核分枝杆菌的抗原。

(一)准备实验组分及实验用具

(1)制作实验所需组份：

①重组结核分枝杆菌早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT6)参考品、培养滤液蛋10(CFP10)参考品、PstS1蛋白参考品的制作：将ESAT6参考品、CFP10参考品和PstS1蛋白参考品的基因序列克隆到大肠杆菌表达载体PET28a上；

其中，ESAT6的基因序列：

ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAGGCCGCGGCAAGCGCAATCCAGGGAAATGTCACGTCCATTCATTCCCTCCTTGACGAGGGGAAGCAGTCCCTGACCAAGCTCGCAGCGGCCTGGGGCGGTAGCGGTTCGGAGGCGTACCAGGGTGTCCAGCAAAAATGGGACGCCACGGCTACCGAGCTGAACAACGCGCTGCAGAACCTGGCGCGGACGATCAGCGAAGCCGGTCAGGCAATGGCTTCGACCGAAGGCAACGTCACTGGGATGTTCGCATAG

CFP10的基因序列：

ATGGCAGAGATGAAGACCGATGCCGCTACCCTCGCGCAGGAGGCAGGTAATTTCGAGCGGATCTCCGGCGACCTGAAAACCCAGATCGACCAGGTGGAGTCGACGGCAGGTTCGTTGCAGGGCCAGTGGCGCGGCGCGGCGGGGACGGCCGCCCAGGCCGCGGTGGTGCGCTTCCAAGAAGCAGCCAATAAGCAGAAGCAGGAACTCGACGAGATCTCGACGAATATTCGTCAGGCCGGCGTCCAATACTCGAGGGCCGACGAGGAGCAGCAGCAGGCGCTGTCCTCGCAAATGGGCTTCTGA

PstS1的基因序列：

ATGGTGAAAATTCGTTTGCATACGCTGTTGGCCGTGTTGACCGCTGCGCCGCTGCTGCTAGCAGCGGCGGGCTGTGGCTCGAAACCACCGAGCGGTTCGCCTGAAACGGGCGCCGGCGCCGGTACTGTCGCGACTACCCCCGCGTCGTCGCCGGTGACGTTGGCGGAGACCGGTAGCACGCTGCTCTACCCGCTGTTCAACCTGTGGGGTCCGGCCTTTCACGAGAGGTATCCGAACGTCACGATCACCGCTCAGGGCACCGGTTCTGGTGCCGGGATCGCGCAGGCCGCCGCCGGGACGGTCAACATTGGGGCCTCCGACGCCTATCTGTCGGAAGGTGATATGGCCGCGCACAAGGGGCTGATGAACATCGCGCTAGCCATCTCCGCTCAGCAGGTCAACTACAACCTGCCCGGAGTGAGCGAGCACCTCAAGCTGAACGGAAAAGTCCTGGCGGCCATGTACCAGGGCACCATCAAAACCTGGGACGACCCGCAGATCGCTGCGCTCAACCCCGGCGTGAACCTGCCCGGCACCGCGGTAGTTCCGCTGCACCGCTCCGACGGGTCCGGTGACACCTTCTTGTTCACCCAGTACCTGTCCAAGCAAGATCCCGAGGGCTGGGGCAAGTCGCCCGGCTTCGGCACCACCGTCGACTTCCCGGCGGTGCCGGGTGCGCTGGGTGAGAACGGCAACGGCGGCATGGTGACCGGTTGCGCCGAGACACCGGGCTGCGTGGCCTATATCGGCATCAGCTTCCTCGACCAGGCCAGTCAACGGGGACTCGGCGAGGCCCAACTAGGCAATAGCTCTGGCAATTTCTTGTTGCCCGACGCGCAAAGCATTCAGGCCGCGGCGGCTGGCTTCGCATCGAAAACCCCGGCGAACCAGGCGATTTCGATGATCGACGGGCCCGCCCCGGACGGCTACCCGATCATCAACTACGAGTACGCCATCGTCAACAACCGGCAAAAGGACGCCGCCACCGCGCAGACCTTGCAGGCATTTCTGCACTGGGCGATCACCGACGGCAACAAGGCCTCGTTCCTCGACCAGGTTCATTTCCAGCCGCTGCCGCCCGCGGTGGTGAAGTTGTCTGACGCGTTGATCGCGACGATTTCCAGCCATCATCATCATCATCACTAA

②将质粒经测序确定序列后，转化到LB21(DE3)型大肠杆菌中，之后接种到LB培养基中，在37℃以220rpm的转速振荡培养至OD值为0.5-0.6，加入终浓度为50ug/mL的IPTG，在37℃以220rpm的速度振荡培养1.5小时，以5000g离心10分钟，弃上清，用PBS重悬，以5000g离心10分钟，用PBS重悬，加入终浓度为5μL/mL的溶菌酶，室温放置2小时，用镍柱纯化所得的蛋白，并用紫外法给测定收集到的蛋白的浓度。

(2)抗体与磁珠的偶联：将50mg羧基标记的四氧化三铁磁微粒用标记缓冲液(pH6.0，50mM MES)洗涤三次、用1mL标记缓冲液重悬，加入30mgEDC，室温放置40分钟，用标记缓冲液洗涤三次；将100ug欲标记的抗本用超滤法将缓冲液置换为标记缓冲液中，将磁珠的缓冲液去掉，将抗体加入其中，室温220rpm振荡过夜，加入PBS(含有50mM的L-谷氨酸，5％脱脂牛奶)，2～8℃放置过夜。用PBS洗涤5次即可使用。

(3)核酸标记物：将100ug欲标记的抗体用超滤法将缓冲液置换为标记缓冲液；

(4)增补液：磷酸盐缓冲液，寡核苷酸；

(5)洗液：三羟甲基氨基甲烷，Triton-100，氯化钠，亮蓝；

(6)96孔深孔板：聚丙烯；

(7)磁力套：聚丙烯；

(8)酶液：Taq聚合酶、甘油、三羟甲基氨基甲烷，氯化钠；

(9)PCR反应液：寡核苷酸，dNTPs，荧光标记核苷酸探针；

(10)聚乙烯PCR反应管；

(11)设备：ABI7500荧光定量PCR仪。

(二)实验操作步骤如下：

(1)将样本见底颠倒6次，加入到96孔深孔板中，每份样本加入1mL；

(2)将抗体偶联磁珠摇匀，加入深孔板，每孔加入5μL，同时加入50μL核酸标记物，室温220rpm振荡30分钟；

(3)将磁力套上加磁，将磁微粒回收，用洗液洗3遍，将磁力套去磁；

(4)加入50μL增补液，室温振荡30分钟；

(5)将磁力套上加磁，将磁微粒回收，用洗液清洗5遍，将磁珠转移到干净的EP管上，将磁力套去磁；

(6)用50μL纯化水将磁珠冲洗下来；

(7)取12.5μL洗涤下来的样本，置于PCR管中，加入12.5μL PCR反应液和0.5μL酶液，上机测试，反应程序为：72℃，10min；94℃，15s，60℃，30s(收集信号)，40circles；20℃，1min。

实验结果如图2～11所示：

如图2所示，由图可以看出，普通免疫聚合酶链式反应的本底Ct值达到24～25，而分子锁钥免疫聚合酶链式反应的本底Ct值只有>38。对于200,000fM的样本，普通免疫聚合酶链式反应的信噪比为S/N＝2^(40-20)/2^(40-24)＝16,分子锁钥免疫聚合酶链式反应的信噪比为S/N＝2^(40-20)/2^(40-38)＝262144。对于2000fM的样本，普通免疫聚合酶链式反应是不能与本底区分的，而分子锁钥免疫聚合酶链式反应可以明显地将20和2000fmole/mL的样本与本底信号做区分。

如图3～5所示，使用重组培养滤液蛋白10(CFP10)的参考品、早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT6)参考品、PstS1蛋白参考品的线范围分别为2～10000fM、4～50000fM和4～50000fM。

如图6～11所示，使用本发明测试临床样本，以培养滤液蛋白10(CFP10)为标识物，AUC为0.9804(90％CI，0.9567-1.000)，灵敏度为100％(90％CI，94.87％-100.0％)，特异度为96.00％(90％CI，88.61％-98.94％)。

以早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT6)为标识物，AUC为0.9844(90％CI，0.9647-1.000)，灵敏度为98.00％(90％CI，91.52％-99.79％)，特异度为96.00％(90％CI，88.61％-98.94％)；

以PstS1蛋白为标识物，AUC为1.00(90％CI，1.00-1.00)，灵敏度为100.0％(90％CI，94.87％-100.0％)，特异度为100.0％(90％CI，94.87％-100.0％)。

要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物料或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物料或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。