Obatoclax在制备HIV-1潜伏感染逆转剂中的应用
阅读说明：本技术 Obatoclax在制备HIV-1潜伏感染逆转剂中的应用 (Application of Obatoclax in preparation of HIV-1 latent infection reversal agent ) 是由 李琳 周晨亮 梁太珍 赖芳圆 郑腾羿 陈佩 李楚玉 刘叔文 于 2019-11-12 设计创作，主要内容包括：本发明提供Obatoclax及其药学上可接受的衍生物在制备HIV-1潜伏感染逆转剂中的应用,Obatoclax具有良好的激活HIV-1潜伏细胞库的活性,同时是Bcl-2家族蛋白的抑制剂,可防止HIV潜伏库的补充、促进再活化细胞的死亡,有望实现对HIV真正的“功能性治愈”。(The invention provides an application of Obatoclax and pharmaceutically acceptable derivatives thereof in preparation of HIV-1 latent infection reversal agents, wherein Obatoclax has good activity of activating HIV-1 latent cell banks, is an inhibitor of Bcl-2 family proteins, can prevent the supplement of HIV latent banks and promote the death of reactivated cells, and is expected to realize real 'functional cure' of HIV.)
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及现有化合物的新应用，具体涉及Obatoclax在制备HIV-1潜伏感染逆转剂中的应用。
背景技术
艾滋病是由人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)引起的人类最严重的单一病因性疾病，以全身免疫系统严重损害为特征。截至2018年，全球感染HIV人数已达到3690万，严重威胁着人类的健康和生存。1996年，高效抗逆转录病毒疗法(Highlyactive antiretroviral therapy，HAART)或称抗逆转录病毒联合疗法(Combinationantiretroviral therapy，cART)的成功应用将艾滋病从一种致死性疾病转变为一种慢性可控性疾病，极大地延长了艾滋病人的生存时间。截至2018年，全球已有2170万人接受cART治疗。然而，cART发展至今，也有其不可克服的局限性，如长期服药的毒副作用、HIV易产生抗药性及患者高额的治疗费用等。更为重要的是，该疗法并不能彻底治愈病人，一旦停药，患者体内潜伏的HIV会迅速反弹，造成再次感染，因此cART需要终身服药，无法实现“斩草除根”。
研究发现，当接受cART治疗的患者血浆中病毒滴度已经降低到检出限以下时，患者体内仍然存在着低水平的病毒复制，HIV不能被彻底清除的主要原因是患者体内存在HIV潜伏感染细胞所构成的病毒潜伏储存库。HIV潜伏储存库主要由一群HIV潜伏感染的静止期记忆性CD4+T细胞构成，其主要特征为：1)整合后潜伏，即整合在宿主免疫细胞基因组中的HIV前病毒发生基因沉默，从而躲过了宿主免疫系统的破坏和cART药物的攻击，一旦条件适合，病毒又将恢复其感染力；2)感染个体携带潜伏感染细胞数量虽少，但其衰减率极低，以至于仅靠cART疗法将其彻底清除是不可能的。因此，HIV潜伏病毒储存库的存在是目前临床治疗不能彻底清除HIV的巨大障碍。
那么，HIV病毒是如何潜伏在患者体内，其又是如何躲开抗病毒药物的攻击的呢？HIV由其包膜蛋白、宿主靶细胞上的CD4受体及趋化因子受体CCR5或CXCR4介导进入宿主细胞后，就开始了病毒的复制周期。首先，经过膜融合进入到靶细胞内的HIV前整合复合物经逆转录酶作用生成线状及环状两种双链互补DNA；随后，线状双链DNA和病毒整合酶进入细胞核，进而整合入宿主免疫细胞的基因组中；整合的HIV前病毒DNA，不仅在感染细胞中被作为病毒基因转录的模板，也是HIV潜伏整合的关键。
由于HIV的基因组与宿主记忆性CD4+T细胞的基因组整合到一起，因此如何靶向清除宿主体内免疫细胞中潜伏感染的HIV前病毒，防止疾病反弹，成为研究者极为头痛的难点之一。另外，HIV潜伏储存库可以逃脱免疫系统的监控，且cART也无法对已整合的HIV前病毒起作用，这就成为从感染者体内彻底根除HIV的最大障碍。
近年来，研究者普遍认为采用“引蛇出洞”(Shock and Kill)的方法，即先使用HIV潜伏感染逆转剂(latency reversing agents,LRAs)诱导静息记忆性CD4+T细胞活化，释放HIV，之后再联合cART将HIV病毒一网打尽。同时，随着静止期CD4+T细胞的活化，由细胞病变效应和/或其诱导的天然或获得性HIV特异性免疫反应，也能使得该群细胞的半衰期显著缩短，进而迅速死亡，从而实现HIV“功能性”治愈，即，使HIV病毒在检测限以下，且停用抗病毒药物，患者也不会出现疾病反弹。
目前，处于临床研究阶段的潜伏感染逆转剂LRAs主要有以下六大类，包括：1)正性转录延伸因子b(Positive transcription elongation factor b，P-TEFb)激活剂：以溴结构域及其外域(Bromodomain extraterminal,BET)抑制剂为主，如JQ1，1-BET151等，其可增强Tat和PTEF-b的结合进而激活HIV潜伏感染病毒；2)组蛋白去乙酰化酶(Histonedeacetylase,HDAC)抑制剂：Vorinostat(SAHA)、Givinostat(ITF2357)和Panobinostat等，其是染色质的解旋剂，促进病毒转录因子与HDAC一起结合到HIV长末端重复序列(LTR)，并通过促进组蛋白上的赖氨酸残基去乙酰化，进而抑制前病毒转录；3)蛋白激酶C(Proteinkinase C，PKC)激活剂：Prostratin、大环内脂类藓苔抑制素(bryostatin-1)等，其对潜伏HIV基因的转录起始产生非常关键作用；4)DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)抑制剂：Decitabine，可抑制前病毒的DNA甲基化过程；5)组蛋白甲基转移酶(Histonemethyltransferase，HMT)抑制剂：EPZ5676等，抑制细胞HMT的活性，从而抑制前病毒DNA的甲基化；6)细胞因子免疫功能调节剂：如IL-2、IL-7、IL-15和GM-CSF等。
但遗憾的是，目前上述候选LRAs对于HIV潜伏感染的治疗还仅处于临床试验阶段，尚未取得突破性的进展，它们或多或少存在着一定的缺陷，限制了它们在临床上的广泛应用。主要问题如下：1)某些表观基因治疗药物在激活病毒的同时，也可引起诸多副作用，如HDAC抑制剂的机制存在较多争议，其在临床中也报道有恶心、呕吐、血液系统异常及影响基因正常功能等；2)PKC激活剂可影响正常T细胞活化的转录因子信号通路，从而导致导致潜伏病毒库的机体免疫及化学药物清除复杂化；3)某些药物作用特异性差，作用广泛，毒副作用较大，不适于长期应用等。4)上述很多LRAs仍处于临床试验阶段，甚至一些药物仅是在体外细胞实验中证实有激活潜伏病毒的作用，距离临床上的广泛应用尚有很长的一段路要走。
B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2)简称为Bcl-2，对维持人体正常新陈代谢发挥重要作用，是目前研究最广泛的凋亡调控基因之一。Bcl-2家族按照功能分类主要分为抗凋亡蛋白(如MCL-1、Bcl-2、Bcl-w、Bcl-xl和A1)及促凋亡蛋白(Bak、Bak、Bok和BH3-only蛋白)。其中，Bax可以导致膜电位的降低和细胞色素C及凋亡诱导因子(apoptosis inducingfactor，AIF)的外流，从而引起凋亡，而Bcl-2可以与Bax结合形成二聚体，从而抑制细胞凋亡。现有研究表明，Bcl-2对维持HIV存在的感染细胞系的稳态增殖和原发性CD4T细胞急性感染的传播具有一定的促进作用，对HIV治疗造成阻碍。因此若能够对Bcl-2进行抑制则可防止HIV潜伏库的补充，并直接促进再活化细胞的死亡，有益于HIV的治疗。
在此基础上，若能找到进一步满足“激活”效应的Bcl-2抑制剂，达到“减库存”、“激活”、“杀灭”三效合一的作用，对于HIV的“功能性治愈”将有极大的临床研究价值。
Obatoclax(别名：GX15-070，Obatoclax Mesylate)是Bcl-2家族蛋白的抑制剂，其甲磺酸盐化学结构式如式I所示：
Obatoclax一般用于治疗肺癌，已经进入晚期小细胞肺癌临床3期试验研究，不过尚未有研究报道Obatoclax在其他疾病治疗中的药理活性。
发明内容
本发明的目的在于解决上述问题，提供一种新型HIV-1潜伏感染逆转剂，能够激活HIV潜伏感染细胞，促使其释放HIV病毒，并对Bcl-2进行抑制，防止HIV潜伏库的补充，有望实现对HIV的“功能性治疗”。
本发明所采取的技术方案是：
Obatoclax及其药学上可接受的衍生物在制备HIV-1潜伏感染逆转剂中的应用。
进一步，Obatoclax的起效浓度为0.01～2.5μM。
进一步，Obatoclax药学上可接受的衍生物选自其药用盐或药用酯。
进一步，所述HIV-1潜伏感染逆转剂的药物剂型为口服给药剂型或非口服给药剂型。
进一步，所述的口服给药剂型为片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、乳剂或糖浆剂。
进一步，所述的非口服给药剂型是注射剂。
相对于现有技术，本发明将Obatoclax及其药学上可接受的衍生物应用于制备HIV-1潜伏感染逆转剂，经实验证明，Obatoclax具有良好的激活HIV-1潜伏细胞库的活性；同时Obatoclax是Bcl-2家族蛋白的抑制剂，可防止HIV潜伏库的补充、促进再活化细胞的死亡，有望实现对HIV真正的“功能性治愈”。
附图说明
图1为Obatoclax对J-Lat 10.6潜伏感染细胞系的P24蛋白表达的影响；
图2为Obatoclax对ACH2潜伏感染细胞系的P24蛋白表达的影响；
图3为Obatoclax对HIV-1潜伏感染细胞模型ACH2细胞的HIV-1p24蛋白表达的影响；
图4为Obatoclax对J-Lat 10.6细胞的细胞毒性；
图5为Obatoclax对ACH2细胞的细胞毒性；
图6为Obatoclax对J-Lat A2细胞的细胞毒性。
具体实施方式
发明人发现Obatoclax存在激活潜伏HIV的新的药理作用，以下结合具体实验来说明本发明的技术方案。
实施例1
本实施例1研究了Obatoclax对HIV-1潜伏感染细胞模型J-Lat 10.6和Ach2细胞P24蛋白表达的影响，证明Obatoclax可以有效促进J-Lat 10.6和Ach2细胞P24蛋白表达。具体过程如下：
(1)HIV-1潜伏感染细胞株培养和激活
1)收集J-Lat 10.6和Ach2细胞液于离心管，800rpm离心5min，弃上清，留细胞沉淀。
2)加5ml培养基，吹匀细胞后吸取20μl细胞液于细胞计数板中，计数。
3)调整细胞浓度至1×106个/ml，以2ml/孔铺于6孔板中。
4)加入系列稀释的不同浓度Obatoclax(0～2.5μM)以及对应的阳性药Prostratin。
5)在37℃，含5％CO2的培养箱中孵育48h后，将6孔板中的细胞收集于EP管中，800rpm离心5min。去除培养基，每支EP管中加入1ml PBS重悬细胞，800rpm离心5min，弃上清，保留细胞沉淀。
(2)Western Blot试验
1)蛋白样品收集：在细胞沉淀中加入40-100μl RIPA裂解液(含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)，吹吸均匀后，置于冰上裂解20min，期间每隔5min斡旋5s以使细胞充***解。细胞充***解后，于4℃，12000rpm离心15min，收集上清于新的EP管，以待下一步操作或直接速冻，存放于-80℃。
2)蛋白样品定量：
①制作蛋白标准曲线。在24孔板中按照以下表格来配制每孔试剂(加样过程中避免产生气泡影响吸光度的测定)。
②混匀后，室温放置2min，然后在酶标仪上检测OD570值。并求得标准方程(x，吸光度；y，蛋白量)。再根据蛋白样品吸光度值计算对应蛋白浓度，并添加5×上样缓冲液、调整各样品RIPA裂解液补充量。
③将蛋白样品浓度调整一致后，斡旋样品2～5s，并轻轻离心。最后将样品置于100℃金属加热器中加热10～15min使之充分变性。处理完毕后，样品可直接用于Western Blot检测或者冻存于-80℃。
3)聚丙烯酰胺凝胶配制：
混合液A：10ml 10％的分离胶：4.0ml dd H2O，3.3ml 30％聚丙烯酰胺，2.5ml的1.5M Tris-HC1(pH 8.8)，0.1ml 10％SDS，0.1ml 10％APS，0.004ml TEMED。
混合液B：3ml 5％浓缩胶：2.1ml dd H2O，0.5ml 30％聚丙烯酰胺，2.5ml的1.5MTris-HC1(pH 6.8)，0.06ml 10％SDS，0.06ml 10％APS，0.003ml TEMED。
洗净玻璃板并装配好，检测是否漏液。检测无漏液情况发生后，将配制好的混合液A加入玻璃板间隙，所加量以距短玻板1cm为准。剩余部分，补加无水乙醇至页面最高处，以消除气泡和使凝胶页面平整。置于室温30min，凝胶若已出现分界线，即可倒去上层乙醇，加上层浓缩胶B。加浓缩胶之前，用滤纸充分吸去残留乙醇，然后加至最高，轻轻***梳子，避免产生气泡。15min后，即可使用。
4)蛋白上样：蛋白样品上样前短暂震荡混匀并轻微离心。将配好的聚丙烯酰胺凝胶安装于垂直电泳模块上，添加电泳缓冲液，并轻轻拔去梳子。用20μl枪头小心将样品缓慢加于指定泳道，在指定泳道加入蛋白Marker。
5)蛋白分离：设置好电泳电压和时间程序：80V，20min；120V，75min。电泳1.5h后，直至溴酚蓝条带迁移至距分离胶底部0.5cm，即可停止电泳。
6)蛋白转印：提前配制好转膜缓冲液置于4℃冰箱预冷，并分别将海绵垫浸泡于转膜缓冲液中和6×8cm2的PVDF膜浸泡于甲醇中。海绵垫连同钢丝网、转膜夹从上到下的顺序摆放整齐，浸泡于转膜缓冲液中。电泳停止后，取下胶板，撬开薄玻板，割去浓缩胶，并将分离胶剥离玻板，平整摊开于海绵垫上(在转膜缓冲液中操作更利于此步骤的顺利进行)。将PVDF膜从甲醇中取出，在转膜缓冲液中清洗两边去除残留甲醇。在膜上做好标记后，将其覆盖于凝胶之上。采用轻轻按压的方式赶走凝胶和膜之间的气泡，并按顺序盖上海绵垫、钢丝网。合上转膜夹后，确定好正负极，并将其安装于转膜电泳模块之间(尽量避免产生气泡)。转膜程序设定为：100V，90min。
7)蛋白封闭。蛋白转印完毕后，去除膜置于TBST中清洗3min。随后，将膜置于5％脱脂牛奶中，室温摇晃孵育1h。此步骤可封闭非特异性抗原，减少抗体非特异性结合位点。
8)一抗孵育：根据转印于膜上蛋白Marker条带位置，切割不同蛋白条带并做好标记。将各条带置于按比例添加相应一抗抗体的离心管，使之完全浸没于液体之中。随后，4℃翻滚孵育过夜。
9)洗膜：取出膜，置于一定量TBST中，放置在摇床上摇晃清洗，每次10min，共三次。
10)二抗孵育：将不同一抗种源抗体的蛋白条带分别置于抗鼠和抗兔二抗的抗体稀释液中，室温继续孵育1h。
11)洗膜：TBST清洗6次，每次5min。
12)曝光：按比例配置好ECL发光液，并将其均匀滴加至膜蛋白面，使用ProteinSimple曝光机进行曝光。
Western Blot试验结果如图1和图2所示，其中图1表示Obatoclax对J-Lat 10.6潜伏感染细胞系的P24蛋白表达的影响，图2表示Obatoclax对ACH2潜伏感染细胞系的P24蛋白表达的影响，其中Prostratin为阳性对照组。图1反映，Obatoclax能够促进J-Lat 10.6潜伏感染细胞系的P24蛋白表达，且J-Lat 10.6潜伏感染细胞系的P24蛋白表达随着Obatoclax浓度梯度的递增而递增，呈明显的浓度梯度依赖性。图2反映，Obatoclax也能够促进ACH2潜伏感染细胞系的P24蛋白表达，ACH2潜伏感染细胞系的P24蛋白表达也随着Obatoclax浓度梯度的递增而递增。
实施例2
本实施例通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Obatoclax对HIV-1潜伏感染细胞模型ACH2细胞的HIV-1p24蛋白表达的影响，具体试验过程如下：
1)收集ACH2细胞液于离心管，800rpm离心5min，弃上清，留细胞沉淀。
2)加5ml培养基，吹匀细胞后吸取20μl细胞液于细胞计数板中，计数。
3)调整细胞浓度至1×106个/ml，以100μl/孔铺于96孔板中。
4)加入系列稀释的不同浓度Obatoclax(0.01～2.5μM)。
5)在37℃，5％CO2培养箱中孵育48h后，收取细胞培养上清100μl于另一块96孔板中，加入等体积的5％Triton X-100，4℃孵育过夜。
6)使用ELISA p24蛋白检测试剂检测样品的p24蛋白含量。
实验结果图3所示，其中SAHA为阳性对照组。从图3可以看出，在ACH2细胞中加入Obatoclax 48h后，其病毒的p24含量比空白对照组明显增加，并且在0.01～2.5μM范围内随着Obatoclax浓度的增高。病毒的p24含量也逐渐升高，表明Obatoclax可呈浓度依赖性地激活ACH2潜伏感染细胞HIV-1的表达。
实施例3
本实施例通过MTT法分析Obatoclax对J-Lat 10.6，ACH2，J-Lat A2潜伏感染细胞系的细胞毒性，具体操作如下：
1)收集J-Lat 10.6，ACH2，J-Lat A2细胞液于离心管，以1×106个/ml，100μl/孔加入至96孔细胞培养板中；
2)加入系列稀释的空白培养基配制的Obatoclax，100μl/孔。
3)在37℃，5％CO2培养箱中孵育48h后，加入MTT溶液(5mg/ml，PBS配制，pH＝7.4)20μl/孔，继续37℃，5％CO2孵育4h。3000rpm离心5min，小心吸弃孔内培养上清，每孔加入100μl DMSO，振荡15min，使结晶物溶解；
4)使用酶标仪检测每孔570nm处吸光度。
结果如图4～6所示，其依次表示Obatoclax对J-Lat 10.6、ACH2、J-Lat A2细胞的细胞毒性，图4～6反映，Obatoclax对J-Lat 10.6、ACH2、J-Lat A2细胞的CC50依次为6.523±0.329、4.307±0.264、2.768±0.339μM，说明当Obatoclax的工作浓度选取在0～2.5μM范围内对细胞是安全有效的。
以上各种实验证明Obatoclax具有促进HIV-1潜伏感染细胞的蛋白表达的性能，从而可激活HIV-1潜伏感染细胞，释放病毒，且在一定浓度范围内对细胞安全有效，无毒副作用；另外，Obatoclax还是Bcl-2抑制剂，能防止HIV潜伏库的补充、缩小潜伏库。因此Obatoclax有望彻底清除HIV潜伏感染库，有望发展为HIV功能治愈的潜在新型安全HIV-1潜伏感染逆转剂，其药学上可接受的衍生物如其药用盐、药用酯等也可用于制备HIV-1潜伏感染逆转剂，并可根据实际情况制成口服给药型，如片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、乳剂、糖浆剂等，或制成非口服给药型，如注射剂。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。