阅读说明：本技术 谷胱甘肽还原酶检测试剂盒及应用 (Glutathione reductase detection kit and application ) 是由 万蒙 周惠良 于 2019-11-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒,包括以下组分：第一试剂,包括磷酸盐缓冲液、EDTA-NA2、抗坏血酸氧化酶、高铁氰化钾、防腐剂和氧化型谷胱甘肽；第二试剂,包括三羟甲基胺基甲烷缓冲液、EGTA、防腐剂和还原型辅酶。第一试剂和第二试剂均为液态,可在2～8℃环境下保存12个月；高铁氰化钾能氧化血红蛋白,生成稳定的氰化高铁血红蛋白,减小检测结果的影响；第二试剂采用EGTA能提高检测结果与吸光度变化率的线性关系,便于采用二点定标。本发明还公开了一种采用上述谷胱甘肽还原酶检测试剂盒的应用,步骤为：分别向样本液中加入第一试剂和第二试剂,放入生化分析仪内孵育,读取吸光度并计算吸光度变化率△A1,再计算样本的谷胱甘肽还原酶活性。(The invention discloses a glutathione reductase detection kit which comprises reagent, including phosphate buffer solution, EDTA-NA2, ascorbic acid oxidase, potassium ferricyanide, preservative and oxidized glutathione, second reagent, including tris buffer solution, EGTA, preservative and reduced coenzyme, reagent and the second reagent are both in liquid state and can be stored for 12 months at 2-8 ℃, potassium ferricyanide can oxidize hemoglobin to generate stable ferrihemoglobin cyanide and reduce the influence of the detection result, EGTA adopted by the second reagent can improve the linear relation between the detection result and the absorbance change rate, and two-point calibration is convenient to adopt.)

谷胱甘肽还原酶检测试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及生化检测技术领域，特别是涉及一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒及应用。

背景技术

谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase，GR)是一种黄素酶，可使含巯基(-SH)的酶处于还原状态与活性状态，维持红细胞的完整性，防止血红蛋白氧化。

目前，测定谷胱甘肽还原酶的方法主要有Elisa法和紫外酶法，前者需要手工操作，耗时较长，步骤繁琐，成本较高，后者步骤简单，成本较低，被广泛推广应用。

现有的紫外酶法谷胱甘肽还原酶的试剂盒主要为进口干粉试剂，使用前需用缓冲液和蒸馏水溶解，溶解后的试剂液只能在2～8℃环境下保存两天，用不完就会造成浪费。

发明内容

本发明的一个目的在于提出一种不易造成浪费的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，其试剂为液态。

一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，包括以下组分：

第一试剂，包括磷酸盐缓冲液、EDTA-NA2、抗坏血酸氧化酶、高铁***、防腐剂和氧化型谷胱甘肽；

第二试剂，包括三羟甲基胺基甲烷缓冲液、EGTA、防腐剂和还原型辅酶。

本发明的有益效果是：第一试剂和第二试剂均为液态，经热稳定性试验用热加速考察，可在2～8℃环境下保存12个月；高铁***能氧化血红蛋白中的亚铁离子(Fe2+)为高铁离子(Fe3+)，生成稳定的氰化高铁血红蛋白，减小对试剂检测结果的影响；第二试剂采用EGTA能提高检测结果与吸光度变化率的线性关系，便于采用二点定标。

另外，根据本发明提供的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，还可以具有如下附加的技术特征：

进一步地，所述磷酸盐缓冲液的浓度为50～400mmol/L，所述EDTA-NA2的浓度为1～5mmol/L，所述抗坏血酸氧化酶的浓度为0.5～5KU/L，所述高铁***0.01～0.3mmol/L，所述防腐剂的浓度均为0.1～1g/L，所述氧化型谷胱甘肽的浓度为1.5～8mmol/L，所述三羟甲基胺基甲烷缓冲液的浓度为50～300mmol/L，所述EGTA的浓度为1～8mmol/L，所述还原型辅酶的浓度为0.2～2.0mmol/L。

进一步地，所述防腐剂为叠氮钠或生物防腐剂。

进一步地，所述第一试剂采用盐酸调节PH值为6.5～7.5，所述第二试剂采用氢氧化钠调节PH值为9.0～10.0。

本发明的另一个目的在于提出一种采用所述的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒的应用，包括以下步骤：

取新鲜血液，制成样本液；

向所述样本液中加入所述第一试剂混合均匀，得混合液；

将混合液置于生化分析仪内，调节温度为30～40℃，孵育300秒；

加入第二试剂，调节温度为30～40℃，孵育60秒；

设定所述生化分析仪的主波长为340nm，副波长为546nm，读取吸光度，计算所述样本液的吸光度的平均变化率△A1；

获得预设的校准品的吸光度的平均变化率△A2和活性B2，计算样本的活性B1＝△A1÷△A2×B2×k，其中k为经验参数，以样本的活性B1作为评价样本液中谷胱甘肽还原酶的指标。

进一步地，所述样本液为血清样本、血浆样本或红血球样本，当所述样本液为血清样本或血浆样本时，k＝1，当所述样本液为红血球样本时，k＝20÷M，其中M为所述样本液的血红蛋白水平。

进一步地，所述红血球样本的制备步骤包括：

取V体积的新鲜血液，离心去血浆，得红血球；

对所述红血球采用0.3～0.9％氯化钠溶液进行悬浮清洗；

离心分层，去除上层清液，加蒸馏水至V体积；

在2～8℃的环境下静置10分钟，离心分层，取上层的溶解产物液，去除所述溶解产物液的管底基质，得样本液；

向所述样本液中加入所述氯化钠溶液，得所述红血球样本，所述样本液和加入的所述氯化钠溶液的体积比为5:15～20。

进一步地，所述蒸馏水的温度为0～5℃。

进一步地，所述读取吸光度的的步骤为：

连续读取6次吸光度，每次间隔20秒。

进一步地，所述氯化钠溶液的浓度为0.9％。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是本发明不同浓度的氯化钠清洗红血球的效果对比图；

图2是本发明对照例1的试剂酶活性320U/L反应曲线；

图3是本发明实施例1的试剂酶活性320U/L反应曲线；

图4是本发明实施例2的试剂酶活性320U/L反应曲线；

图5是本发明实施例3的试剂酶活性320U/L反应曲线；

图6是本发明实施例4的试剂酶活性320U/L反应曲线。

具体实施方式

为使本发明的目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。附图中给出了本发明的若干实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。

实施例1

一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，包括以下组分：

第一试剂，包括磷酸盐缓冲液、EDTA-NA2、抗坏血酸氧化酶、高铁***、防腐剂和氧化型谷胱甘肽；

第二试剂，包括三羟甲基胺基甲烷缓冲液、EGTA、防腐剂和还原型辅酶。

本发明的优势在于：

(1)第一试剂和第二试剂均为液态，经热稳定性试验用热加速考察，可在2～8℃环境下保存12个月；

(2)第一试剂中的高铁***能氧化血红蛋白中的亚铁离子(Fe2+)为高铁离子(Fe3+)，血红蛋白转化成高铁血红蛋白。高铁血红蛋白与氰离子(CN-)结合，生成稳定的氰化高铁血红蛋白，对谷胱甘肽还原酶的检测没有影响；

(3)第二试剂采用EGTA能提高谷胱甘肽还原酶的检测结果与吸光度变化率的线性关系，便于采用二点定标。

具体的，所述磷酸盐缓冲液的浓度为200mmol/L，所述EDTA-NA2的浓度为3mmol/L，所述抗坏血酸氧化酶的浓度为3KU/L，所述高铁***0.2mmol/L，所述防腐剂的浓度均为0.5g/L，所述氧化型谷胱甘肽的浓度为5mmol/L，所述三羟甲基胺基甲烷缓冲液的浓度为150mmol/L，所述EGTA的浓度为2mmol/L，所述还原型辅酶的浓度为1.5mmol/L。

其中，所述防腐剂为叠氮钠，所述还原型辅酶为NADPH。

另外，所述第一试剂采用盐酸调节PH值为7，所述第二试剂采用氢氧化钠调节PH值为9.5。调节PH能确保酶反应有一个最适PH值，在这个PH值时酶反应效果最好，速度最快，另外，原料在该PH值环境下最稳定。

上述的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒的应用，包括以下步骤：

(1)取新鲜血液，制成样本液；

(2)向所述样本液中加入所述第一试剂混合均匀，得混合液；

(3)将混合液置于生化分析仪内，调节温度为37℃，孵育300秒；

(4)加入第二试剂，调节温度为37℃，孵育60秒；

(5)设定所述生化分析仪的主波长为340nm，副波长为546nm，连续读取6次吸光度，每次间隔20秒，计算所述样本液的吸光度的平均变化率△A1；

(6)获得预设的校准品的吸光度的平均变化率△A2和活性B2，计算样本的活性B1＝△A1÷△A2×B2×k，其中k为经验参数，以样本的活性B1作为评价样本液中谷胱甘肽还原酶的指标。

在本实施例中，生化分析仪采用日立7180型全自动生化分析仪，校准品为已知的磷酸盐缓冲液、牛血清和蔗糖的混合物，B2的值为已知，△A2为用校准品定标时获得。

具体的，所述样本液可以血清样本、血浆样本或红血球样本，其中血清样本可采用血液凝固分离，当所述样本液为血清样本或血浆样本时，k＝1，当所述样本液为红血球样本时，k＝20÷M，其中M为所述样本液的血红蛋白水平。血红蛋白水平可通过血常规测得。

另外，所述红血球样本的制备步骤包括：

(1)取V体积的新鲜血液，离心去血浆，得红血球；

(2)对所述红血球采用0.9％氯化钠溶液进行悬浮清洗；

(3)离心分层，去除上层清液，加蒸馏水至V体积，所述蒸馏水的温度为2℃；

(4)在5℃的环境下静置10分钟，离心分层，取上层的溶解产物液，去除所述溶解产物液的管底基质，得样本液；

(5)向所述样本液中加入所述氯化钠溶液，得所述红血球样本，所述样本液和加入的所述氯化钠溶液的体积比为5:17。

需要说明的是，在检测红细胞样本时，需要先清洗红血球，去除红血球以外成分中的谷胱甘肽还原酶叠加干扰，然后破碎红血球，检测红血球中谷胱甘肽还原酶的活性。考察不同浓度NaCL清洗红细胞的结果，选择最适浓度(利用渗透压对细胞膜的作用和红细胞中含GR浓度高特性)。

实施例2

本实施例与实施例1基本一致，不同之处在于：

在第二试剂中，所述EGTA的浓度为4mmol/L。

实施例3

本实施例与实施例1基本一致，不同之处在于：

在第二试剂中，所述EGTA的浓度为6mmol/L。

实施例4

本实施例与实施例1基本一致，不同之处在于：

在第二试剂中，所述EGTA的浓度为8mmol/L。

对照例1

本实施例与实施例1基本一致，不同之处在于：

在第二试剂中，未采用EGTA。

分别采用实施例1～4和对照例1对已知活性的样本进行测量，所得结果与已知值的偏差结果见表1，并采用活性为320U/L高值点检测反应曲线，其横坐标为时间，纵坐标为样本吸光度值，结果见图2～6。(图2～6为采用日立7180型全自动生化分析仪获得的拍摄照片)

表1

分组

活性已知值

对照例1

实施例1

实施例2

实施例3

实施例4

1

10U/L

1U/L

1U/L

1.5U/L

1U/L

1U/L

2

20U/L

3U/L

1U/L

2U/L

2U/L

2U/L

3

40U/L

10％

6.25％

7.5％

7.5％

7.5％

4

80U/L

1.25％

2.5％

3.13％

4.38％

2.5％

5

160U/L

－13.13％

－0.94％

0.31％

0

－3.13％

6

320U/L

－51.88％

－5.94％

－1.25％

－5.47％

－14.69％

从表1可以看出，实施例1～4均取得了较好的效果，偏差最大也不超过15％，而当对照例1的第二试剂不采用EGTA时，产生的偏差较大，特别是活性为320U/L，测得的偏差值已达到51.88％；另外，实施例2所得结果的偏差最小，则当EGTA的浓度可优选4mmol/L。

图2～6反映了采用不同浓度的EGTA和不加EGTA配制的试剂在试剂有效期末检测320U/L较高值酶活性样本时的不同反应现象。正常有效的试剂在使用期限内，检测样本的反应曲线各检测点是一条各点相连的光滑直线，而如果试剂不稳定或试剂中某些成分不同程度地失效时，在检测样本，尤其在检测较高值样本时，就会在反应曲线中有所体现，反应曲线会变为不十分直，甚至在反应接近末端有拐弯现象。具体可理解为所得曲线越直，所得的样本吸光度变化率越准，越弯曲则吸光度变化率误差越大。

请参阅图2，反应曲线在反应开始不久就已不呈直线，在反应一段时间后拐弯严重。说明对照例1对应的试剂中有成分严重失效，不能检测较高值样本，检测较高值样本时，数据严重失真(严重偏低)；

请参阅图3和图5，反应曲线目测有一定程度弯弧，说明实施例1和实施例3对应的试剂中有成分有轻度影响，在检测较高值样本和足够高样本时，偏差会增大；

请参阅图4，反应曲线目测为一条直线，无目测弯弧，说明实施例2对应的试剂中成分影响不明显，在检测较高值样本和足够高样本时，偏差较小；

请参阅图6，反应曲线目测有较明显弯弧，说明实施例4对应的试剂中有成分有较严重影响，在检测较高值样本和足够高样本时，偏差会增大，数据会失真。

从图2～6中，同样也证明了EGTA对检测结果具有良好的促进作用，其中EGTA采用4mmol/L时效果最佳。

实施例5

实施例5与实施例1基本一致，不同之处在于：

悬浮清洗红血球时采用浓度0.3％的氯化钠溶液。

实施例6

实施例6与实施例1基本一致，不同之处在于：

悬浮清洗红血球时采用浓度0.5％的氯化钠溶液。

实施例7

实施例7与实施例1基本一致，不同之处在于：

悬浮清洗红血球时采用浓度0.6％的氯化钠溶液。

采用实施例1、实施例5～7对红血球清洗，所得效果见图1，图中试管从左至右分别为实施例5、实施例6、实施例7、实施例1，所得清洗红血球后离心上清液结果颜色越浅，代表红血球在清洗过程中破碎程度越小。

从图1可以看出，当采用实施例1的0.9％的氯化钠溶液时，清洗效果最佳。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。