含有枯草芽孢杆菌漆酶的总胆红素检测试剂盒
阅读说明：本技术 含有枯草芽孢杆菌漆酶的总胆红素检测试剂盒 (Total bilirubin detection kit containing bacillus subtilis laccase ) 是由 齐崴 尤生萍 张成玉 苏荣欣 于 2020-03-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种含有枯草芽孢杆菌漆酶的总胆红素检测试剂盒,由试剂R1、试剂R2、试剂R3和试剂R4组成：试剂R1包括：缓冲液、表面活性剂、甘露醇、亚硝酸钠、叠氮化钠、乙二胺四乙酸钠、余量为水；试剂R2包括：缓冲液、KCl、聚乙二醇-600、胆酸钠、余量为水；试剂R3为枯草芽孢杆菌漆酶；试剂R4为总胆红素标准品。枯草芽孢杆菌漆酶发酵周期短、生产成本低、可实现快速大批量生产。利用枯草芽孢杆菌漆酶制备的总胆红素检测试剂盒,可以克服原胆红素氧化酶稳定性差、成本高等问题,本发明的试剂盒稳定性好,成本低。(The invention discloses a total bilirubin detection kit containing bacillus subtilis laccase, which consists of a reagent R1, a reagent R2, a reagent R3 and a reagent R4: the reagent R1 includes: buffer solution, surfactant, mannitol, sodium nitrite, sodium azide, sodium ethylene diamine tetracetate and the balance of water; the reagent R2 includes: buffer solution, KCl, polyethylene glycol-600, sodium cholate and the balance of water; reagent R3 is Bacillus subtilis laccase; reagent R4 is total bilirubin standard. The fermentation period of the bacillus subtilis laccase is short, the production cost is low, and quick mass production can be realized. The total bilirubin detection kit prepared by utilizing the bacillus subtilis laccase can overcome the problems of poor stability, high cost and the like of the original bilirubin oxidase, and the kit disclosed by the invention is good in stability and low in cost.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种检测试剂，具体涉及含有枯草芽孢杆菌漆酶的总胆红素检测试剂盒。
背景技术
胆红素是是肝功能的一项重要指标，总胆红素的测定在临床上有着非常重要的意义。作为红细胞中铁卟啉化合物的主要代谢产物，胆红素的结构是由四个吡咯环通过分子中甲基桥相连而成。血液中红细胞破坏后释放的血红素在血红素氧化酶的作用下生成胆绿素，又经胆绿素还原酶的作用下产生胆红素。胆红素为一种有效的抗氧化剂，具有捕获氧自由基的能力，能保护脂类和脂蛋白不被氧化。它与人体内其它抗氧化防御系统有协同作用，与白蛋白结合后存在于心室的肌细胞部位，阻止该部位产生氧自由基，可调节心肌细胞的胆红素抗氧化活性，保护心室肌细胞不受氧自由基损害。胆红素分为总胆红素与间接胆红素，间接胆红素与总胆红素之和就是总胆红素。胆红素总量增高、间接胆红素增高表明：溶血性贫血、血型不合输血、恶性疾病、新生儿黄疸等；直接与间接胆红素均增高表明：急性黄疸型肝炎、慢性活动性肝炎、肝硬变、中毒性肝炎；胆红素总量增高、直接胆红素增高表明：肝内及肝外阻塞性黄疸、胰腺癌、毛细胆管型肝炎及其他胆汁瘀滞综合症；因此，对人体的血清、血浆或尿液中总胆红素的测定以及成分的分析是临床医学检验最常规的项目之一，对疾病的治疗具有非常重要的意义。
目前临床常用测定总胆红素的方法有重氮试剂法、钒酸盐氧化法、酶法等。重氮试剂法应用最早且目前应用仍然非常广泛，但试剂稳定性较差、线性较低、质量不好控制、抗干扰能力弱；与重氮试剂法相比，钒酸盐氧化法具有比较好的相关性，且试剂的稳定性比较好，因此近年发展比较迅速。但抗干扰能力也相对较弱，结果常出现负值。酶法测定胆红素具有操作简单、特异强、精密度高、抗干扰能力强等的特点，近年来在临床应用方面逐渐广泛。然而，由于一般的胆红素氧化酶的保存时间短、生产成本高，使得酶法检测胆红素试剂价格昂贵，在临床推广应用方面处于劣势。鉴于现有技术上的缺陷，迫切需要开发一种稳定性好、结果准确可靠、生产成本低的总胆红素的检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种含有枯草芽孢杆菌漆酶的总胆红素检测试剂盒。
本发明的技术方案概述如下：
一种利用枯草芽孢杆菌漆酶制备总胆红素检测试剂盒，由试剂R1、试剂R2、试剂R3和试剂R4组成：
所述试剂R1包括：缓冲液100mmol/L、表面活性剂1-10g/L、甘露醇10-250mmol/L、亚硝酸钠0.05-0.2g/L、叠氮化钠0.2-2g/L、乙二胺四乙酸钠0.001-5g/L、余量为水；
所述试剂R2包括：缓冲液100mmol/L、KCl 100mmol/L、聚乙二醇-600 5-500g/L、胆酸钠20mmol/L、余量为水；
所述试剂R3：枯草芽孢杆菌漆酶；
所述试剂R4：总胆红素标准品。
试剂R1中的缓冲液为pH＝7.0-9.5的Tris-HCl缓冲液、pH＝7.0-9.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、pH＝7.0-9.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或pH＝7.0-9.5的硼酸-氯化钾-氢氧化钠缓冲液。
试剂R1中表面活性剂为十二烷基硫酸钠、TritonX-100、曲拉通-405、甜菜碱和聚山梨醇酯中的至少一种。
试剂R2中的缓冲液为pH＝7.0-9.5的Tris-HCl缓冲液、pH＝7.0-9.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、pH＝7.0-9.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或pH＝7.0-9.5的硼酸-氯化钾-氢氧化钠缓冲液。
枯草芽孢杆菌漆酶用下述方法获得：
(1)构建含有枯草芽孢杆菌漆酶基因的大肠杆菌：设计枯草芽孢杆菌漆酶基因的上游引物和枯草芽孢杆菌漆酶基因的下游引物，以枯草芽孢杆菌基因组为模板，利用所述上游引物与所述下游引物进行PCR扩增，并将扩增产物通过酶切-连接的方式整合入大肠杆菌质粒pET-28a中，形成重组质粒pET-28a-laccase，并通过CaCl2转化法转入大肠杆菌表达型宿主菌BL21(DE3)中，得到重组菌；
所述枯草芽孢杆菌漆酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述枯草芽孢杆菌漆酶基因的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述枯草芽孢杆菌漆酶基因的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
(2)将步骤(1)获得的重组菌发酵，纯化，制备获得枯草芽孢杆菌漆酶。
本发明的优点：
(1)枯草芽孢杆菌漆酶发酵周期短、生产成本低、可实现快速大批量生产。
(2)利用枯草芽孢杆菌漆酶制备的总胆红素检测试剂盒，可以克服原胆红素氧化酶稳定性差、成本高等问题，本发明的试剂盒稳定性好，成本低。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本申请，并不用于限制本申请。对本发明内容所做的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围。
本发明所使用的枯草芽孢杆菌学名为Bacillus subtilis，购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心(网址http://www.china-cicc.org/)，菌种保存号为CICC20613，购买时间为2010年6月。
实施例1
枯草芽孢杆菌漆酶用下述方法获得：
(1)构建含有枯草芽孢杆菌漆酶基因的大肠杆菌：设计枯草芽孢杆菌漆酶基因(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)的上游引物(SEQ ID No.2所示)和下游引物(SEQ ID No.3所示)，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，CICC20613)基因组为模板，利用上游引物与下游引物进行PCR扩增，并将扩增产物通过酶切-连接的方式整合入大肠杆菌质粒pET-28a(市售)中，形成重组质粒pET-28a-laccase，选用大肠杆菌DH5α(DE3)为宿主细胞进行质粒扩增，将扩增的质粒通过CaCl2转化法转入大肠杆菌表达型宿主菌BL21(DE3)中，得到重组菌；
(2)将步骤(1)获得的重组菌发酵，纯化，制备获得枯草芽孢杆菌漆酶，具体步骤为：
将步骤(1)获得的重组菌接种至LB液体培养基，于37℃培养箱中培养12h，得到种子液；将该种子液按照1％的比例接种至新的LB液体培养基中，在37℃，220rpm条件下培养至OD600为0.8后，分别按照1mg/L与1mmol/L的加入量加入IPTG与CuCl2，然后在16℃，220rpm条件下发酵20h；发酵完毕后10000rmp离心获取菌体并利用高压细胞破碎仪破碎细胞，经Ni-NTA亲和层析柱纯化后，获取纯化的枯草芽孢杆菌漆酶。
LB液体培养基的配方：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L、卡那霉素50mg/L，余量为水。
枯草芽孢杆菌漆酶基因(SEQ ID No.1)的GenBank号为：JN043511.1；
上游引物5’-CGCGGATCCATGACACTTGAAAAATTTGTGG(SEQ ID No.2)；
下游引物5’-CGGCTCGAGCTATTTATGGGGATCAGTTATATCC(SEQ ID No.3)。
实验证明：利用本方法获得到的枯草芽孢杆菌漆酶，具有发酵周期短(加入诱导剂后20h便可完成发酵)、生产成本低(每升发酵成本约1.52元)、可实现快速大批量生产。
实施例2
一种利用枯草芽孢杆菌漆酶制备总胆红素检测试剂盒，由试剂R1、试剂R2、试剂R3和试剂R4组成：
试剂R1包括：pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液100mmol/L、十二烷基硫酸钠3g/L、甘露醇100mmol/L、亚硝酸钠0.1g/L、叠氮化钠0.2g/L、乙二胺四乙酸钠0.5g/L、余量为水；
试剂R2包括：pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液100mmol/L、KCl 100mmol/L、聚乙二醇-600 50g/L、胆酸钠20mmol/L、余量为水；
试剂R3：枯草芽孢杆菌漆酶(实施例1制备)。
试剂R4：总胆红素标准品。
用试剂盒对总胆红素的检测：
取试剂R3枯草芽孢杆菌漆酶放入试剂R2中，配成浓度为10000U/L，混匀，静置5min，得含酶试剂；
取总胆红素标准品0.04μmol加双蒸水至2mL，溶解，得到总胆红素标准品溶液(简称标准品溶液)；
待测样品：新鲜无溶血血清。
检测波长：450nm.
使用操作步骤：
1)向样品管和标准品管中分别加入270μL试剂R1；
2)在样品管中加入10μL待测样品，在标准品管中加入10μL标准品溶液，均置于分光光度计中，450nm测定吸光度，分别记为A1样品和A1标准品；
3)再向样品管和标准品管中分别加上20μL含酶试剂，混匀25℃孵育5min后，450nm测定吸光度，分别记为A2样品和A2标准品；
待测样品浓度计算：
其中，ΔA样品＝A1样品-A2样品；ΔA标准品＝A1标准品-A2标准品
待测样品总胆红素的浓度45.7μmol/L。
适用仪器除分光光度计外，还可以选用为各种半自动和全自动生化分析仪。
实施例3
一种利用枯草芽孢杆菌漆酶制备总胆红素检测试剂盒，由试剂R1、试剂R2、试剂R3和试剂R4组成：
试剂R1包括：pH＝7.0的Tris-HCl缓冲液100mmol/L、TritonX-100 0.5g/L、曲拉通-405 0.5g/L、甘露醇10mmol/L、亚硝酸钠0.05g/L、叠氮化钠0.2g/L、乙二胺四乙酸钠0.001g/L、余量为水；
试剂R2包括：pH＝7.0的Tris-HCl缓冲液100mmol/L、KCl 100mmol/L、聚乙二醇-600 5g/L、胆酸钠20mmol/L、余量为水；
试剂R3：枯草芽孢杆菌漆酶(实施例1制备)；
试剂R4：总胆红素标准品。
用试剂盒对总胆红素的检测：
取试剂R3枯草芽孢杆菌漆酶放入试剂R2中，配成浓度为5000U/L，混匀，静置5min，得含酶试剂；
取总胆红素标准品0.04μmol加双蒸水至2mL，溶解，得到总胆红素标准品溶液(简称标准品溶液)；
待测样品：肝素抗凝血浆。
检测波长：450nm.
使用操作步骤：同实施例2的使用操作步骤。
待测样品总胆红素的浓度45.2μmol/L。
实施例4
一种利用枯草芽孢杆菌漆酶制备总胆红素检测试剂盒，由试剂R1、试剂R2、试剂R3和试剂R4组成：
试剂R1包括：pH＝9.5的Tris-HCl缓冲液100mmol/L、甜菜碱5g/L、聚山梨醇酯5g/L、甘露醇250mmol/L、亚硝酸钠0.2g/L、叠氮化钠2g/L、乙二胺四乙酸钠5g/L、余量为水；
试剂R2包括：pH＝9.5的Tris-HCl缓冲液100mmol/L、KCl 100mmol/L、聚乙二醇-600 500g/L、胆酸钠20mmol/L、余量为水；
试剂R3：枯草芽孢杆菌漆酶(实施例1制备)
试剂R4：总胆红素标准品。
用试剂盒对总胆红素的检测：
取试剂R3枯草芽孢杆菌漆酶放入试剂R2中，配成浓度为20000U/L，混匀，静置5min，得含酶试剂；
取总胆红素标准品0.04μmol加双蒸水至2mL，溶解，得到总胆红素标准品溶液(简称标准品溶液)；
待测样品：EDTA抗凝血浆。
检测波长：450nm.
使用操作步骤：同实施例2的使用操作步骤。
待测样品总胆红素的浓度45.6μmol/L。
储存条件及有效期为：原装试剂2～8℃保存，有效期12个月。
实施例2、3和4与市售试剂盒比较：
用表1所列试剂盒分别对“总胆红素高值新鲜无溶血血清”样本进行测定，上述“总胆红素高值新鲜无溶血血清”经检验机构确定样本中总胆红素的浓度为325μmol/L。测定及结果见表1。
表1：
试剂盒
测定次数
平均值(μmol/L)
相对偏差％
市售(改良)重氮法总胆红素测定试剂盒
10
328.7
4.7
市售酶法总胆红素测定试剂盒
10
321.5
3.8
实施例2
10
324.3
2.4
实施例3
10
323.9
2.9
实施例4
10
324.1
2.6
结果显示：本发明的试剂盒与市售试剂盒的检测结果进行比较，无显著差异；但从数据可以看出，本发明的试剂盒特异性更强，精密度更高，结果准确可靠。
实验证明，用pH＝8.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液100mmol/L、pH＝8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液100mmol/L、pH＝8.0的硼酸-氯化钾-氢氧化钠缓冲液100mmol/L分别替代实施例2的pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液100mmol/L，其它同实施例2，制备的总胆红素检测试剂盒，检测效果与实施例2相似。
实验证明，用pH＝7.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液100mmol/L、pH＝7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液100mmol/L、pH＝7.0的硼酸-氯化钾-氢氧化钠缓冲液100mmol/L分别替代实施例3的pH＝7.0的Tris-HCl缓冲液100mmol/L，其它同实施例3，制备的总胆红素检测试剂盒，检测效果与实施例3相似。
实验证明，用pH＝9.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液100mmol/L、pH＝9.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液100mmol/L、pH＝9.5的硼酸-氯化钾-氢氧化钠缓冲液100mmol/L分别替代实施例4的pH＝9.5的Tris-HCl缓冲液100mmol/L，其它同实施例4，制备的总胆红素检测试剂盒，检测效果与实施例4相似。
序列表
<110> 天津大学
<120> 含有枯草芽孢杆菌漆酶的总胆红素检测试剂盒
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1542
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
atgacacttg aaaaatttgt ggatgctctc ccaatcccag atacactaaa gccggtacag 60
cagtcaaaag atagcacata ctacgaagta accatggagg aatgctacca tcagcttcac 120
cgcgatctcc ctccaacccg cttgtggggc tataacggtt tattccccgg tcccaccatt 180
aaggccaaaa gaaatgaaaa cgtttatgtg aaatggatga ataaccttcc ttcagagcat 240
tttcttccga ttgatcacac cattcatcac agtgacagcc agcatgccga acccgaggtg 300
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gtacagcatg aaagaataca aaacctccga acattgaagc tggcaggcac tcaagaccaa 1140
tacggcagac ccgtccttct tcttaacaac aaacgctggc acgatcctgt cactgaagca 1200
ccgaaagtcg gttctaccga aatatggtcg attatcaacc cgactcgcgg aacacatccg 1260
atccatcttc atttggtctc cttccgtgta ttggaccggc gcccatttga tacagcccgt 1320
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aaaggctgga aagacacggt tcagtcccac gccggtgaag tcctgagaat cgccgtaaca 1440
ttcgggccat acactgggcg gtacgtatgg cattgccaca ttcttgagca tgaagactat 1500
gacatgatga gaccgatgga tataactgat ccccataaat ag 1542
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 2
cgcggatcca tgacacttga aaaatttgtg gatgc 35
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 3
ccgctcgagc tagtggtggt ggtggtggtg tttatgg 37