阅读说明：本技术 一种土壤硝酸还原酶活性测定的新方法 (Novel method for measuring activity of soil nitrate reductase ) 是由 刘涛 褚贵新 雷雨 于 2019-10-11 设计创作，主要内容包括：本发明属于土壤氮循环测定技术领域,公开了一种土壤硝酸还原酶活性测定的新方法,以硝酸钾(KNO<Sub>3</Sub>)为底物,在30℃恒温和厌氧条件下对土壤进行24小时(h)的还原培养,通过测定还原前后土壤硝态氮(NO<Sub>3</Sub><Sup>-</Sup>-N)含量并计算其差值得出每克(g)干土中被还原的NO<Sub>3</Sub><Sup>-</Sup>-N的量,以被还原的NO<Sub>3</Sub><Sup>-</Sup>-N的量表征该土壤的硝酸还原酶活性。本发明中的培养实验中,用普通锥形瓶和真空容器代替减压锥形瓶,用连续流动分析仪代替酚二磺酸比色法进行NO<Sub>3</Sub><Sup>-</Sup>-N含量的测定,与以往方法相比,可显著降低实验误差,提高测定结果的精确度和测试效率。(The invention belongs to the technical field of soil nitrogen cycle determination, and discloses a new method for determining soil nitrate reductase activity, which uses potassium nitrate (KNO) 3 ) As a substrate, the soil was subjected to reduction culture at a constant temperature of 30 ℃ under anaerobic conditions for 24 hours (h) by measuring nitrate Nitrogen (NO) in the soil before and after the reduction 3 ‑ N) and calculating the difference to yield the reduced NO per gram (g) of dry soil 3 ‑ Amount of N to reduced NO 3 ‑ The amount of-N characterizes the nitrate reductase activity of the soil. In the culture experiment of the invention, a common conical flask and a vacuum container are used for replacing a decompression conical flask, and a continuous flow analyzer is used for replacing a phenoldisulfonic acid colorimetric method for carrying out NO 3 ‑ Compared with the conventional method, the method for measuring the content of the N-component can obviously reduce experimental errors and improve the accuracy and the testing efficiency of the measurement result.)

一种土壤硝酸还原酶活性测定的新方法

技术领域

本发明属于土壤氮循环测定技术领域，尤其涉及一种土壤硝酸还原酶活性测定的新方法。

背景技术

土壤反硝化是土壤氮循环的一个重要过程，硝酸还原酶是将土壤硝化的最终产物硝态氮(NO₃ ^--N)还原成亚硝态氮(NO₂ ^--N)的一类还原酶，其活性大小可表征反硝化的强度，可间接影响土壤氮损失(硝酸盐淋失及气态氮损失等)，在农业生态系统中还会影响氮肥利用率。土壤硝酸还原酶活性的测定方法的基本原理为，NO₃ ^--N在硝酸还原酶的催化作用下转化NO₂ ^--N，反应前后NO₃ ^--N含量的差值即可代表土壤硝酸还原酶的活性。

目前，最接近的现有技术：

以往有关土壤硝酸还原酶活性的测定方法多参照关松荫等编著的《土壤酶及其研究法》(1986)以及李振高等编著的《土壤与环境微生物研究法》(2008)，以上方法原理和步骤基本相同，均是在有氢供体和厌氧条件下，测定还原前后硝态氮与酚二磺酸作用的蓝色反应差值(即吸光度差值)来表示硝酸还原酶活性，吸光度差值越大表示硝酸还原酶活性越高。

现有技术的具体步骤为：

取1g土样置于100mL减压三角瓶中，加20mg CaCO₃和1mL KNO₃溶液，仔细混合后加1ml葡萄糖溶液作为氢供体，抽气3min，摇匀，置于30℃恒温培养箱中培养24h；培养结束后加入50mL去离子水和1mL铝钾矾溶液；取20mL滤液于瓷蒸发皿或锥形瓶中，在水浴中蒸干，加入2ml酚二磺酸溶液溶解处理10min，再加入15mL去离子水，用10％NaOH溶液调至微黄色后移至50mL容量瓶中用蒸馏水定容，用分光光度计在400～500nm处进行比色。同时用灭菌土壤(180℃烘干3h)作为对照。

吸取50mL KNO₃标准溶液(100mg/L)于瓷蒸发皿中水浴蒸干，在残渣中加入2ml酚二磺酸溶液处理10min后加入15ml蒸馏水，定容至500mL得到10mg/L的NO₃ ^--N溶液，吸取此溶液5～40mL于50mL容量瓶中，用10％NaOH溶液调至微黄色用蒸馏水定容后于400～500nm进行比色，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线用于计算土壤样品中NO₃ ^--N含量。硝酸还原酶活性以24h后每g土中被还原的NO₃ ^--N的量表示。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)现在技术中，每个样品都需要专用的减压锥形瓶，且对每个减压锥形瓶抽真空的时间为3min，如果样品量大，仅此步骤就会耗时过长，显著降低了效率；

(2)现有技术没有对真空压力范围加以说明，这会引起每个减压瓶内厌氧程度不同，在培养的过程中会引起还原程度差异，增加测定结果的不确定性；

(3)现有技术是运用酚二磺酸比色法进行测定，仅酚二磺酸配置就需要6h以上，并且此法在水浴蒸干环节也耗时较长，而显色的样品一般需要在短时间内就进行吸光度值测定，当大量样品显色后进行测定时会导致吸光度值误差增大，会降低实验结果的准确性和测定效率。

综上，现有测定方法在实际操作过程中较为繁琐，测定效率低下，尤其无法满足短时间内对大批量样品的测试需求，测定误差较大导致重现性不好，难以获得精准数据。

解决上述技术问题的难度：

将减压锥形瓶用常规的锥形瓶代替，可将同一批次的样品放入同一真空容器内用带压力计的真空泵对样品进行集体抽真空，此步骤能显著节约抽真空的时间，真空容器和带压力计的真空泵均为实验室常用设备，因此，这一技术问题容易解决；酚二磺酸比色法虽然是测定硝态氮的经典方法但较为落后，酚二磺酸配置和水浴蒸干均耗时较长，会导致测定效率低下，运用连续流动分析仪可在短时间内对大批样品进行测定，可显著提高测定效率，降低操作误差，提高测试精度，解决这一问题需要配备连续流动分析仪，近年，该仪器在高校和科研院所越来越普及。

解决上述技术问题的意义：

还原条件不好控制，操作过程耗时较长等因素导致的数据不稳定，重现性不好，误差大一直是酶活性测定中存在的问题。本发明的意义在于，通过技术上的改进，能够显著提高硝酸还原酶的测试精度和效率，尤其适用土壤硝酸还原酶的大批量测定。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种土壤硝酸还原酶活性测定的新方法。

本发明是这样实现的，一种土壤硝酸还原酶活性测定的新方法，包括：

以KNO₃为底物，在30℃恒温和厌氧条件下对土壤进行24h的还原培养，通过测定还原前后NO₃ ^--N含量的差值进而得出每g干土中被还原的NO₃ ^--N的量，以每g干土中被还原的NO₃ ^--N的量作为该土壤的硝酸还原酶活性。

进一步，所述土壤硝酸还原酶活性测定的新方法具体包括：

第一步，准确称取过1mm筛的风干土样和180℃烘干土样各1.00g放入50或100mL锥形瓶中，依次加入20mg CaCO₃和1mL 1％KNO₃溶液，摇匀后再加入1mL 1％葡萄糖溶液；

第二步，将锥形瓶放入真空容器中，用真空泵将容器内部抽真空至70KPa时关闭阀门；

第三步，将真空容器放入生化培养箱中，在30℃条件下恒温培养24h；

第四步，培养结束后，向锥形瓶内加入50mL纯水和1mL的硫酸铝钾饱和溶液，充分摇匀后用慢速定量滤纸过滤至样品瓶中；

第五步，用连续流动分析仪对标准曲线溶液和样品滤液中的硝态氮进行连续批量测定，直接得出滤液中的NO₃ ^--N浓度(mg/L)。

进一步，上一步进行前，需进行：

土壤准备：将每个新鲜土壤样品分成2份，一份自然风干，另一份在180℃条件下烘干3h使土壤酶失去活性，上述土样均过1mm筛；

土壤培养所需试剂配制：1％KNO₃溶液、1％葡萄糖溶液以及硫酸铝钾饱和溶液；

连续流动分析仪上机测定所需试剂配制：0.1％CuSO₄储备液、1％ZnSO₄储备液、硫酸肼混合液、显色剂、4％NaOH溶液、磷酸缓冲液。

标准溶液制备：用KNO₃配置浓度为500mg/L的NO₃ ^--N标准溶液；

标准曲线制备：分别吸取NO₃ ^--N标准溶液0、0.5、1、1.5、2、2.5、3mL于50mL容量瓶中，用纯水定容，得到浓度依次为0、5、10、15、20、25、30mg/L的NO₃ ^--N标准曲线溶液。

进一步，由于CaCO₃的作用是调节土壤pH值>7以满足微生物最适宜的pH值条件，因此，在测定碱性土壤中的硝酸还原酶时，可以不加CaCO₃(在第一步执行)。

进一步，还原培养所用的纯水需提前进行灭菌和超声以除去微生物、氧以及二氧化碳并密封保存。

进一步，真空容器是任何可以抽真空的容器如真空干燥器。

进一步，第一步中，风干土样培养后提取的滤液测定值为还原后的NO₃ ^--N浓度，烘干土样培养后提取的滤液测定值为还原前的NO₃ ^--N浓度。

进一步，第四步过滤后的溶液如果不立即测定，可在-18℃条件下冷冻保存。

进一步，第五步中，硝酸还原酶活性计算公式为:

式中，C1为180℃烘干土样培养后滤液中的NO₃ ^--N含量(mg/L)，C2为风干土样培养后滤液中的NO₃ ^--N含量(mg/L)，53为培养后溶液最终体积，1000为体积换算系数，W为准确称取的土壤质量(g)。

进一步，第五步连续流动分析仪测定的标准曲线中，NO₃ ^--N浓度梯度范围为0～50mg/L。

本发明的另一目的在于提供一种实施所述土壤硝酸还原酶活性测定的新方法的同时，提供硝酸还原酶活性测定设备。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明对土壤硝酸还原酶活性的培养和测定部分均进行了改进，将所有培养瓶集中抽真空既缩短了操作时间又能使样品处于相同还原条件，利用专业仪器能够较快地测定还原前后的NO₃ ^--N含量，以上的改进均能显著降低操作误差，使测定结果更加精确可靠，同时显著提高了测定效率，尤其适合土壤硝酸还原酶活性的大批量测定。

本发明中的培养实验不需要用以往方法中提及的专用减压三角瓶，只需用普通锥形瓶和可抽真空的容器代替；随着连续流动分析仪在高校和科研单位的不断普及，运用该仪器可进行NO₃ ^--N的大批量测定，能够显著降低误差，提高精度和测定效率。

附图说明

图1是本发明实施例提供的土壤硝酸还原酶活性测定的新方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

现在技术中，每个样品都需要专用的减压锥形瓶，且对每个减压锥形瓶抽真空的时间为3min，如果样品量大，仅此步骤就会耗时过长，显著降低了效率。现有技术没有对真空压力范围加以说明，这会引起每个减压瓶内厌氧程度不同，在培养的过程中会引起还原程度差异，增加测定结果的不确定性。现有技术是运用酚二磺酸比色法进行测定，仅酚二磺酸配置就需要6h以上，并且此法在水浴蒸干环节也耗时较长，而显色的样品一般需要在短时间内就进行吸光度值测定，当大量样品显色后进行测定时会导致吸光度值误差增大，会降低实验结果的准确性和测定效率。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种土壤硝酸还原酶活性测定的新方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的土壤硝酸还原酶活性测定的新方法进行前，需进行：

土壤准备：将每个新鲜土壤样品分成2份，一份自然风干，另一份在180℃条件下烘干3h使土壤酶失去活性，上述土样均过1mm筛。

土壤培养所需试剂配制：1％KNO₃溶液、1％葡萄糖溶液以及硫酸铝钾饱和溶液。

连续流动分析仪上机测定所需试剂配制：0.1％CuSO₄储备液、1％ZnSO₄储备液、硫酸肼混合液、显色剂、4％NaOH溶液、磷酸缓冲液。

标准溶液制备：用KNO₃配置浓度为500mg/L的NO₃ ^--N标准溶液。

标准曲线制备：分别吸取NO₃ ^--N标准溶液0、0.5、1、1.5、2、2.5、3mL于50mL容量瓶中，用纯水定容，得到浓度依次为0、5、10、15、20、25、30mg/L的NO₃ ^--N标准曲线溶液。

具体步骤包括：

S101，称取过1mm筛的风干土样和180℃烘干土样各1.00g放入50或100mL锥形瓶中，依次加入20mg CaCO₃和1mL 1％KNO₃溶液，摇匀后再加入1mL 1％葡萄糖溶液。

S102，将锥形瓶放入真空容器中，用真空泵将容器内部抽真空至70KPa时关闭阀门。

S103，将真空容器放入生化培养箱中，在30℃条件下恒温培养24h。

S104，培养结束后，向锥形瓶内加入50mL纯水和1mL的硫酸铝钾饱和溶液，充分摇匀后用慢速定量滤纸过滤至样品瓶中。

S105，用连续流动分析仪对标准曲线溶液和样品滤液中的硝态氮进行连续批量测定，直接得出滤液中的NO₃ ^--N浓度(mg/L)。

在本发明实施例中，硝酸还原酶活性计算公式为:

式中，C1为180℃烘干土样培养后滤液中的NO₃ ^--N含量(mg/L)，C2为风干土样培养后滤液中的NO₃ ^--N含量(mg/L)，53为培养后溶液最终体积(mL)，1000为体积换算系数，W为准确称取的土壤质量(g)。

在本发明实施例中，由于CaCO₃的作用是调节土壤pH值>7以满足微生物最适宜的pH值条件，因此，在测定碱性土壤中的硝酸还原酶时，可以不加CaCO₃(在第一步执行)。

在本发明实施例中，还原培养所用的纯水需提前进行灭菌和超声以除去微生物、氧以及二氧化碳并密封保存。

在本发明实施例中，真空容器是任何可以抽真空的容器如真空干燥器。

在本发明实施例中，风干土样培养后提取的滤液测定值为还原后的NO₃ ^--N浓度，烘干土样培养后提取的滤液测定值为还原前的NO₃ ^--N浓度。

在本发明实施例中，连续流动分析仪测定的标准工作曲线中，硝态氮浓度梯度范围为0～50mg/L。

在本发明实施例中，过滤后的溶液如果不能立即测定，可在-18℃条件下冷冻保存。

在本发明实施例中，本发明方法改进的依据：对土壤进行厌氧条件下的还原培养是硝酸还原酶测定的必要条件，以KNO₃为底物，经过24h培养，通过测定还原前后NO₃ ^--N含量的差值得出每克干土中被还原的NO₃ ^--N的量，以被还原的NO₃ ^--N的量来表征该土壤硝酸还原酶活性。本发明所使用的自然风干土壤以KNO₃为底物，在30℃进行24h厌氧培养，在硝酸还原酶的作用下催化还原硝酸钾中的部分NO₃ ^--N。180℃烘干土壤的硝酸还原酶在高温条件下失活使其无法催化对底物进行还原，因此，可用两者的差值来表征土壤硝酸还原酶活性。

现有技术中需对每个样品抽真空，耗时长，极大地降低了测定效率。由于现有技术没有确定真空压力范围，会引起每个样品的厌氧程度不同而导致培养过程中的还原差异，最终导致结果的不确定性，将样品放入真空容器内集体抽真空能显著节约操作时间。现有技术运用的酚二磺酸比色法耗时较长，测定效率较低，无法满足短时间内对大批量样品的测试需求，测定误差较大导致重现性不好，难以获得精准数据，运用连续流动分析仪可显著提高测定效率，降低误差，提高测试精度。

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例1

本发明实施例1提供的土壤硝酸还原酶活性测定的新方法与现有技术进行比较，包括：

土壤准备：本实施例土壤样品采自石河子大学农学院试验站0～20cm土层，除去杂质过1mm筛。土样分为2份，一份自然风干(7～10天)，另一份在180℃条件下烘干3h使土壤酶失去活性。

土壤培养所需试剂配制：1％KNO₃溶液(称取1.00g KNO₃用纯水定容至100mL)，1％葡萄糖溶液(称取1.00g葡萄糖用纯水定容至100mL)，CaCO₃(白色粉末)，硫酸铝钾饱和溶液(将硫酸铝钾溶于100mL纯水中至过饱和，即确保溶液中有晶体析出即可)。

本发明中连续流动分析仪测定所需试剂配制：0.1％CuSO₄储备液(将0.10g CuSO₄用纯水定容至100mL)，1％ZnSO₄储备液(将1.00g ZnSO₄用纯水定容至100mL)，硫酸肼混合液(将7mL 0.1％CuSO₄储备液、5mL 1％ZnSO₄储备液以及3.00g硫酸肼溶于500mL纯水并混合均匀)，显色剂(将5.00g磺胺、0.25g N-(1-萘基)乙二胺二盐酸以及50mL磷酸用纯水稀释至500mL)，4％NaOH溶液(将20g NaOH用纯水稀释至500mL)，磷酸缓冲液(将3mL磷酸和4.00g十水二磷酸四钠溶于1000mL纯水并混合均匀)。

现有技术中酚二磺酸比色法测定所需试剂配制：10％NaOH溶液(10g NaOH用纯水定容至100mL)，酚二磺酸(将3g重蒸酚与37g浓硫酸混合后再沸水浴上加热回流6h)。

硝态氮标准溶液制备：准确称取3.6090g KNO₃用纯水定容至1L，得到浓度为500mg/L的NO₃ ^--N标准溶液，冷藏储存。

本发明硝态氮标准曲线制备：分别吸取NO₃ ^--N标准溶液0、0.5、1、1.5、2、2.5、3mL置于50mL容量瓶中，用纯水定容，得到浓度依次为0、5、10、15、20、25、30mg/L的NO₃ ^--N标准曲线溶液。

现有技术硝态氮标准曲线制备：将NO₃ ^--N标准溶液稀释5倍，得到100mg/L的NO₃ ^--N溶液，吸取50mL此溶液至于瓷蒸发皿中，再沸水浴上蒸干，残渣用2mL酚二磺酸处理10min，再加15mL蒸馏水定容至500mL。分别吸取此溶液0、5、10、15、20、30、40mL于50mL容量瓶中，用10％NaOH溶液调至微黄色后用纯水定容，得到浓度依次为0、1、2、3、4、6、8mg/L的NO₃ ^--N标准曲线溶液，用分光光度计在450nm处比色，以吸光度值和NO₃ ^--N浓度值拟合方程。

本发明具体操作步骤：准确称取1.00g风干土样和烘干土样各7份放入50mL锥形瓶中，依次加入20mg CaCO₃和1mL 1％KNO₃溶液，摇匀后再加入1mL 1％葡萄糖溶液。将锥形瓶放入真空干燥器中，用真空泵抽真空至70KPa时，关闭阀门，放入生化培养箱中，在30℃条件下恒温培养24h。培养结束后，向锥形瓶内加入50mL纯水和1mL的硫酸铝钾饱和溶液，充分摇匀后用慢速定量滤纸过滤至样品瓶中。用连续流动分析仪对标准曲线溶液和样品滤液中的NO₃ ^--N进行连续批量测定，直接得出滤液中的NO₃ ^--N浓度(mg/L)。再利用公式计算得出土壤硝酸还原酶活性以24h每g干土中被还原的硝态氮的mg数表示。

现有技术具体操作步骤：准确称取1.00g风干土样和烘干土样各7份放入100mL减压锥形瓶中，依次加入20mg CaCO₃和1mL 1％KNO₃溶液，再加入1mL1％葡萄糖溶液摇匀，用真空泵将每个减压锥形瓶抽气3min，放入同一生化培养箱中，在30℃条件下恒温培养24h。培养结束后，向锥形瓶内加入50mL纯水和1mL的硫酸铝钾饱和溶液。每个锥形瓶量取20mL溶液置于蒸发皿进行水浴蒸干，残渣用2mL酚二磺酸处理10min，加15mL蒸馏水，再用10％NaOH溶液调至微黄色并转移至50mL容量瓶内再用纯水定容，用分光光度计在450nm处比色，根据标准曲线拟合公式以及硝酸还原酶计算公式计算得出土壤硝酸还原酶活性以24h每g干土中被还原的NO₃ ^--N的mg数表示。

试验结果如下：

上表中可知，现有技术测得土壤硝酸还原酶活性的误差较大，重复性不好，本发明方法则可将标准差降低79.26％，且本发明测得的硝酸还原酶活性较现有技术略高，这与本发明中确定了真空压使土壤处于稳定的还原环境以及采用流动分析仪测定从而降低操作误差紧密相关。

实施例2本发明实施例提供的土壤硝酸还原酶活性测定的新方法包括：

土壤准备：采集0～20cm土层土壤样品，除去杂质过1mm筛。每个样品分为2份，一份自然风干(7～10天)，另一份在180℃条件下烘干3h使土壤酶失去活性。

土壤培养所需试剂配制：1％KNO₃溶液(称取1.00g KNO₃用纯水定容至100mL)，1％葡萄糖溶液(称取1.00g葡萄糖用纯水定容至100mL)，CaCO₃(白色粉末)，硫酸铝钾饱和溶液(将硫酸铝钾溶于100mL纯水中至过饱和，即确保溶液中有晶体析出即可)。

连续流动分析仪上机试剂配制：0.1％CuSO₄储备液(将0.10g CuSO₄用纯水定容至100mL)，1％ZnSO₄储备液(将1.00g ZnSO₄用纯水定容至100mL)，硫酸肼混合液(将7mL 0.1％CuSO₄储备液、5mL 1％ZnSO₄储备液以及3.00g硫酸肼溶于500mL纯水并混合均匀)，显色剂(将5.00g磺胺、0.25g N-(1-萘基)乙二胺二盐酸以及50mL磷酸用纯水稀释至500mL)，4％NaOH溶液(将20g NaOH用纯水稀释至500mL)，磷酸缓冲液(将3mL磷酸和4.00g十水二磷酸四钠溶于1000mL纯水并混合均匀)。

硝态氮标准溶液制备：准确称取3.6090g KNO₃用纯水定容至1L，得到浓度为500mg/L的NO₃ ^--N标准溶液，冷藏储存。

硝态氮标准曲线制备：分别吸取NO₃ ^--N标准溶液0、0.5、1、1.5、2、2.5、3mL置于50mL容量瓶中，用纯水定容，得到浓度依次为0、5、10、15、20、25、30mg/L的NO₃ ^--N标准曲线溶液。

具体操作步骤：准确称取风干土样和烘干土样各1.00g放入50mL锥形瓶中，依次加入20mg CaCO₃和1mL 1％KNO₃溶液，摇匀后再加入1mL 1％葡萄糖溶液。将锥形瓶放入真空干燥器中，用真空泵抽真空至70KPa时关闭阀门。将真空干燥器放入生化培养箱，在30℃条件下恒温培养24h。培养结束后，向锥形瓶内加入50mL纯水和1mL的硫酸铝钾饱和溶液，充分摇匀后用慢速定量滤纸过滤至样品瓶中。用连续流动分析仪对标准曲线溶液和样品滤液中的NO₃ ^--N进行连续批量测定，直接得出滤液中的NO₃ ^--N浓度(mg/L)。再利用公式计算得出土壤硝酸还原酶活性以24h每g干土中被还原的硝态氮的mg数表示。

下面结合实验对本发明作进一步描述。

实施例2所用的土壤样品采自新疆北疆农田，分别采集了0～20cm土层的砂土、壤土和粘土三种质地的石灰性土壤，用本发明方法检测三种质地土壤样品中硝酸还原酶活性。

将以上土样去除杂质后过1mm筛，每种质地土样各分为2份，一份自然风干，另一份在180℃条件下烘干3h。每种质地土壤称取1.00g风干土样和烘干土样各四份于50mL锥形瓶中，加入1mL 1％KNO₃溶液，摇匀后再加入1mL 1％葡萄糖溶液。将锥形瓶放入真空干燥器中，在干燥器口磨砂处涂上一层凡士林，盖上真空干燥器盖，用真空泵将干燥器内部抽真空至70KPa，关闭阀门，放入生化培养箱中，在30℃条件下恒温培养24h。

培养结束后，向锥形瓶内加入50mL纯水和1mL硫酸铝钾饱和溶液，充分摇匀后用慢速定量滤纸过滤至50mL样品瓶中。

用连续流动分析仪对标准曲线溶液和上述滤液中的NO₃ ^--N进行连续测定，得出滤液中NO₃ ^--N的浓度。

利用公式计算得出土壤硝酸还原酶活性以24h每g干土中被还原的NO₃ ^--N的mg数表示。

试验结果如下：

上表中不同质地土壤间硝酸还原酶活性差异均达到显著水平，标准差和标准误亦可证明该方法得出的结果重复性好，精确度较高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。