阅读说明：本技术 Atp荧光检测试剂 (ATP fluorescence detection reagent ) 是由 李书红 陈杨青 夏放 蒋晓东 于 2019-10-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种ATP荧光检测试剂,所述ATP荧光检测试剂,在酶反应基本溶液体系和缓冲体系中加入用于提高所述酶反应基本溶液体系中的荧光素酶热稳定性的保护剂,所述保护剂包含特定浓度的海藻糖和甜菜碱。与相关技术相比,本发明提供的ATP荧光检测试剂的热稳定性更佳且保存时间明显延长。(The invention provides an ATP fluorescence detection reagent, wherein a protective agent for improving the thermal stability of luciferase in an enzyme reaction basic solution system is added into the enzyme reaction basic solution system and a buffer system, and the protective agent comprises trehalose and betaine with specific concentrations. Compared with the related technology, the ATP fluorescence detection reagent provided by the invention has better thermal stability and obviously prolonged storage time.)

ATP荧光检测试剂

【技术领域】

本发明涉及ATP荧光检测技术领域，尤其涉及一种室温稳定的ATP荧光检测试剂。

【背景技术】

萤光素酶在有ATP(adenosine triphosphate，腺嘌呤核苷三磷酸)情况下，氧化荧光素并放出荧光，发出的光子可以被光敏感元件，如萤光探测器或改进后的光学显微镜探测到。

荧光素酶热稳定性很差，在室温下很快就失去活性。提高荧光素酶的热稳定性一方面可以通过改变其基因结构(基因突变)来进行。但是这种方法过程繁琐，而且许多可以改变其热稳定性的突变都已被专利保护。另一种方法是加入特定保护剂来提高荧光素酶的稳定性。

虽然市售的各种ATP荧光检测试剂均在一定程度提高了溶液态试剂的热稳定性，但试剂的保存期及热稳定性还不够令人满意。

因此，有必要提供一种新的ATP荧光检测试剂来解决上述问题。

【

发明内容

】

本发明的目的是克服上述技术问题，提供一种热稳定性佳的ATP荧光检测试剂，解决现有市售ATP荧光测试剂热稳定性差，保存时间短的问题。

本发明提供一种ATP荧光检测试剂，在酶反应基本溶液体系和缓冲体系中加入用于提高所述酶反应基本溶液体系中的荧光素酶热稳定性的保护剂，所述保护剂包括海藻糖和甜菜碱，所述甜菜碱的浓度为0.18-0.36M，所述海藻糖的浓度为0.62-1.24M的甜菜碱。

优选的，所述ATP荧光检测试剂由酶反应基本溶液体系、缓冲体系及保护剂组成。

优选的，所述缓冲体系为三甲基甘氨酸缓冲溶液，所述三甲基甘氨酸缓冲溶液的浓度为0.1M。

优选的，所述酶反应基本溶液体系包括荧光素酶、荧光素和金属离子，所述荧光素酶优选为虫荧光素酶，所述荧光素优选为D-虫荧光素钾盐，所述虫荧光素酶和D-虫荧光素钾盐的浓度分别优选为10mg/L和500mg/L，所述金属离子为Mg²⁺，所述金属离子Mg²⁺的浓度优选为15mM。

优选的，所述ATP荧光检测试剂还包括牛血清白蛋白和二硫苏糖醇，其中所述牛血清白蛋白的浓度优选为0.05％-0.1％，所述二硫苏糖醇的浓度优选为0.01％-0.05％。

与相关技术相比，本发明提供的ATP荧光检测试剂加入了具有特定比例海藻糖和甜菜碱的保护剂，其中，甜菜碱有效防止脱水诱导的蛋白质热动力学干扰，海藻糖和甜菜碱这两种组分极大提高了ATP荧光检测剂的热稳定性，同时也使ATP检测试剂的保存时间显著延长。

【附图说明】

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

图1为25℃条件下仅添加海藻糖与不添加甜菜碱和海藻糖的ATP荧光检测试剂的荧光值曲线图；

图2为25℃条件下仅添加甜菜碱与不添加甜菜碱和海藻糖的ATP荧光检测试剂的荧光值曲线图；

图3为25℃条件下同时添加海藻糖与甜菜碱与不添加甜菜碱和海藻糖的ATP荧光检测试剂的荧光值曲线图；

图4为35℃条件下ATP荧光检测试剂中分别添加不同用量的海藻糖和甜菜碱的荧光值曲线图。

【

具体实施方式

】

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一

本发明提供了一种ATP荧光检测试剂，在酶反应基本溶液体系和缓冲体系中加入用于提高所述酶反应基本溶液体系中的荧光素酶热稳定性的保护剂，所述保护剂包括浓度为0.1-10M的海藻糖和浓度为0.1-10M的甜菜碱。当所述保护剂同时包括甜菜碱和海藻糖，则甜菜碱和海藻糖比例相同，且所述甜菜碱的浓度为0.18-0.36M，所述海藻糖和浓度为0.62-1.24M的甜菜碱。

所述ATP荧光检测试剂由酶反应基本溶液体系、缓冲体系及保护剂组成。

其中，所述缓冲体系为三甲基甘氨酸缓冲溶液，所述三甲基甘氨酸缓冲溶液的浓度为0.1M。

所述酶反应基本溶液体系包括荧光素酶、荧光素和金属离子，所述荧光素酶优选为虫荧光素酶，所述荧光素优选为D-虫荧光素钾盐，所述虫荧光素酶和D-虫荧光素钾盐的浓度分别优选为10mg/L和500mg/L，所述金属离子为Mg²⁺，所述金属离子Mg²⁺的浓度优选为15mM。

所述ATP荧光检测试剂还包括牛血清白蛋白和二硫苏糖醇，其中所述牛血清白蛋白的浓度为0.05％-0.1％，所述二硫苏糖醇的浓度为0.01％-0.05％。

本发明提供的ATP荧光检测试剂的配置方法及本发明提供的ATP荧光检测试剂的热稳定性验证方法具体如下：

步骤S1：配置三甲基甘氨酸缓冲体系。称取1.7917g三(羟甲基)甲基甘氨酸，溶于80mL去离子水中，完全溶解后定容至100mL形成浓度为0.1M的三甲基甘氨酸缓冲溶液；

步骤S2：取10mL所述步骤S1所配置的0.1M三甲基甘氨酸缓冲溶液溶解12mg牛血清白蛋白、48.8mg MgCl₂·6H₂O及3mg二硫苏糖醇；

步骤S3：取1950μL由所述步骤S2所提供的溶解了牛血清白蛋白、MgCl₂·6H₂O及二硫苏糖醇的三甲基甘氨酸缓冲溶液，向其中加入750μL含有浓度为0.18-0.36M的甜菜碱和浓度为0.62-1.24M海藻糖的溶液并最终形成2700μL的含保护剂的缓冲体系；

步骤S4：取意大利萤火虫荧光素酶用所述步骤S2所提供的溶解了牛血清白蛋白、MgCl₂·6H₂O及二硫苏糖醇的三甲基甘氨酸缓冲溶液做1：100浓度稀释，以形成含酶反应基本溶液的缓冲体系；

步骤S5：向所述步骤3提供的2700μL的所述含保护剂的缓冲体系中加入300μL步骤S4所提供的所述含酶反应基本溶液的缓冲体系和30μL浓度为500mg/L的荧光素，震荡混合以形成ATP荧光检测试剂，按400μL/管进行分装并放入25℃的培养箱中，至此，本发明提供的ATP荧光检测试剂配置完成。

步骤S6:在第0天、5天、12天、18天、33天、48天、78天取出所述步骤S5所分装的所述ATP荧光检测试剂，放入荧光检测仪拭子管中，加入100uL 0.013g/L的ATP，混匀后，测试荧光值。

请参阅图1-3，图1-3均为在25℃下测定的ATP荧光检测试剂的荧光值。图1为仅添加海藻糖与不添加甜菜碱和海藻糖的ATP荧光检测试剂的荧光值曲线图；图2为仅添加甜菜碱与不添加甜菜碱和海藻糖的ATP荧光检测试剂的荧光值曲线图；图3为同时添加海藻糖与甜菜碱与不添加甜菜碱和海藻糖的ATP荧光检测试剂的荧光值曲线图。

具体的，图1中的ATP荧光检测试剂中添加750μL浓度为0.36M海藻糖的荧光值数值曲线；图2中ATP荧光检测试剂中添加750μL浓度为1.24M甜菜碱的荧光值数值曲线，图3为ATP荧光检测试剂中添加375μL浓度为0.18M海藻糖和375μL浓度为0.62M甜菜碱的荧光值数值曲线，另外，图1-3中均添加了750μL未添加海藻糖和甜菜碱的空白组的对比曲线。

将添加“375μL浓度0.18M海藻糖和375μL浓度为1.62M的甜菜碱”的ATP荧光检测试剂作为实验组，分别将“750μL空白组”、“750μL浓度为0.36M的海藻糖”及“750μL浓度为1.24M的甜菜碱”的ATP荧光检测试剂作为对照组一、二及三。

结合上述表格与图1-3，不难看出，实验组分别在第0天、第5天、第12天、第18天、第33天、第48天及第78天所检测出的荧光值比对照组一数值更高。这表明实验组的ATP荧光检测试剂的稳定时间更长、热稳定性更佳。

实验组分别在第5天、第12天、第18天、第33天、第48天及第78天所检测出的荧光数值远高于对照组二，而在第0天时，实验组的荧光数值略低于对照组二。这表明实验组的ATP荧光检测试剂的稳定时间更长、稳定性更佳。

实验组在第0天、第5天、第12天、第18天、第33天所检测出的荧光值比对照组三更高，尤其是在第0天、第5天，实验组的数值远高于对照组三，在第18天、第33天实验组数值略低于对照组三。这表明实验组的ATP荧光检测试剂的在至少55天前的稳定性更佳。

但需要说明的是，实验组仅采用了对照组二中1/4的海藻糖的用量和对照组三中1/4的甜菜碱的用量，即实验组相对于对照组二和三而言降低了海藻糖和甜菜碱的用量，但实验组相对于对照组二和对照组三同样起到了在25℃条件下延长ATP荧光试剂的稳定时间的作用，且实验组相对于对照组二还起到提高ATP荧光试剂稳定性的效果，说明甜菜碱和海藻糖起到了协同作用。

实施例二

与实施例一相比，本实施例与实施例一所制取ATP荧光检测试剂的配置方法与荧光值的验证方法的不同之处在于：

步骤S5中ATP荧光检测试剂的保存温度为35℃；

步骤S6中在第0天、1天、2天、4天、7天、8天、10天及14天取出所述步骤S5所分装的所述ATP荧光检测试剂，放入荧光检测仪拭子管中，加入100uL 0.013g/L的ATP，混匀后，测试荧光值。

请再结合参阅图4，图4为35℃条件下ATP荧光检测试剂中分别添加不同用量的海藻糖和甜菜碱的荧光值曲线图，其中：

曲线一为750μL未添加海藻糖和甜菜碱的空白组的荧光数值曲线；

曲线二为750μL浓度为1.24M甜菜碱的荧光数值曲线图；

曲线三为750μL浓度为0.36M海藻糖的荧光数值曲线图；

曲线四为375μL浓度为0.18M海藻糖和375μL浓度为0.62M甜菜碱；

曲线五为375μL浓度为0.27M海藻糖和375μL浓度为0.93M甜菜碱；

曲线六为375μL浓度为0.315M海藻糖和375μL 浓度为1.085M甜菜碱；

曲线七为375μL浓度为0.36M海藻糖和375μL浓度为1.24M甜菜碱。

不难得出，曲线一、二、三大部分相互重叠，这表明在35℃条件下，不添加海藻糖和甜菜碱的ATP荧光检测试剂的热稳定性与仅添加高浓度的海藻糖或仅添加高浓度的甜菜碱的ATP荧光检测试剂的热稳定性相近，可以得出单独添加高浓度的海藻糖或单独添加高浓度的甜菜碱无法起到提升ATP荧光检测试剂热稳定性的效果。

曲线四的数值略接近曲线一、二、三，曲线四仅添加了1/4曲线二的甜菜碱用量和1/4曲线三的海藻糖的用量，但曲线四相对于曲线一、二、三还是起到了一定的提升ATP荧光检测试剂热稳定性效果的作用。

而曲线五、六、七的数值均远高于曲线一、二、三。其中，曲线七仅添加了1/2曲线二的甜菜碱用量和1/2曲线三的海藻糖的用量，但曲线七相对于曲线一、二、三起到了显著提升ATP荧光检测试剂热稳定性的效果和延长ATP荧光检测试剂稳定时间的作用。

与相关技术相比，本发明提供的ATP荧光检测试剂加入了具有特定比例海藻糖和甜菜碱的保护剂，这两种组分极大提高了ATP荧光检测剂的热稳定性，同时也使ATP检测试剂的保存时间显著延长。

以上所述的仅是本发明的实施方式，在此应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出改进，但这些均属于本发明的保护范围。