使用拴系酶检测核酸
阅读说明：本技术 使用拴系酶检测核酸 (Detection of nucleic acids using tethered enzymes ) 是由 R·科恩 A·特拉维斯 于 2020-02-26 设计创作，主要内容包括：本申请涉及检测样品中靶核酸分子的方法。所述方法包括提供含有靶核酸分子的样品和捕获寡核苷酸分子。在一个实施方案中,所述捕获寡核苷酸分子(i)长度为30-60个碱基对,(ii)在其3'端上具有4-8个碱基对的突出端,(iii)具有5'尾,(iv)在所述3'端和所述5'尾之间具有靶特异性部分,(v)脱氧二磷酸腺苷含量为40-50％,(vi)在所述3'端或所述5'尾中没有脱氧磷酸胸苷,并且(vii)所述3'端和所述5'尾的ATP含量为所述捕获寡核苷酸分子的ATP含量的40-50％。在检测方法的另一方面中,某些试剂与固体支持物偶联。本申请还涉及可用于进行本申请方法的组合物和试剂盒。(The present application relates to methods for detecting a target nucleic acid molecule in a sample. The method includes providing a sample containing a target nucleic acid molecule and a capture oligonucleotide molecule. In one embodiment, the capture oligonucleotide molecule (i) is 30-60 base pairs in length, (ii) has an overhang of 4-8 base pairs on its 3 'end, (iii) has a 5' tail, (iv) has a target-specific moiety between the 3 'end and the 5' tail, (v) has an adenosine diphosphate content of 40-50%, (vi) has no thymidine diphosphate in the 3 'end or the 5' tail, and (vii) has an ATP content of the 3 'end and the 5' tail that is 40-50% of the ATP content of the capture oligonucleotide molecule. In another aspect of the detection method, certain reagents are coupled to a solid support. The present application also relates to compositions and kits useful for performing the methods of the present application.)
本申请要求2019年2月26日提交的美国临时专利申请序列号62/810,448的权益，其以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本申请涉及使用拴系酶检测核酸。
背景技术
核酸扩增可用于确定样品中是否存在特定的模板核酸。如果产生了扩增产物，则这指示样品中存在模板核酸。相反，不存在任何扩增产物指示样品中不存在模板核酸。这些技术在诊断应用中非常重要，例如用于确定样品中是否存在病原体。
可以通过多种热循环和等温技术来扩增核酸。热循环技术，例如聚合酶链反应(PCR)，使用温度循环来驱动DNA合成的重复循环，导致大量新DNA与模板DNA的原始量成比例地合成。最近，还开发了许多不依赖于热循环来驱动扩增反应的等温技术。已经开发了利用具有链置换活性的DNA聚合酶的等温技术来实现不涉及RNA合成步骤的扩增反应。类似地，对于涉及RNA合成步骤的扩增反应，已经开发了使用逆转录酶、RNA酶H和DNA依赖性RNA聚合酶的等温技术。
然而，特定核酸序列的检测和/或定量是用于鉴定和分类微生物、诊断感染性疾病、检测和表征遗传异常、鉴定与癌症相关的遗传变化、研究对疾病的遗传易感性和测量对各种类型治疗的反应的重要技术。这些程序也可用于检测和定量可能需要监测特定微生物的存在的食品、水、工业和环境样品、种子储备和其他类型材料中的微生物。在法医科学、人类学、考古学和生物学中发现了其他应用，在这里核酸序列相关性的测量已被用于鉴定犯罪嫌疑人、解析亲子鉴定、构建谱系和系统发育树以及帮助分类多种生命形式。
过去20年来分子生物学领域的进步已经允许检测从患者和其他受试者获得的测试样品中的特定核酸序列。这样的测试样品包括血清、尿液、粪便、唾液、羊水和其他体液。因此，许多检测和/或定量核酸序列的方法是本领域熟知的。然而，高度灵敏的核酸扩增系统的固有结果是副产物的出现。副产物包括在一些系统中可能干扰扩增反应分子，从而降低了特异性。这是因为有限的扩增资源，包括引物延伸和转录产物的形成中所需的引物和酶，被转移到副产物的形成中。在一些情况下，副产物的出现也可能使通过各种分子技术对扩增子产生的分析复杂化。此外，在许多感兴趣的情况下，特定核酸序列以非常低的浓度存在于测试所需核酸序列的样品中。在这种情况下，如果不可增加测定灵敏度，则不可检测到所需分子的存在。
本申请涉及克服本领域中的这些和其他不足。
发明内容
本申请的一个方面涉及一种检测样品中靶核酸分子的方法。所述方法包括：提供含有靶核酸分子的样品；以及将所述样品与互补于所述靶核酸分子的至少一部分的捕获寡核苷酸分子接触，使得所述捕获寡核苷酸分子与所述靶核苷酸分子的互补部分杂交并形成双链核酸分子。捕获寡核苷酸分子(i)长度为30-60个碱基对，(ii)在其3'端上具有4-8个碱基对的突出端(overhang)，(iii)具有5'尾，(iv)在所述3'端和所述5'尾之间具有靶特异性部分，(v)脱氧二磷酸腺苷含量为40-50％，(vi)在所述3'端或所述5'尾中没有脱氧磷酸胸苷，并且(vii)所述3'端和所述5'尾的ATP含量为所述捕获寡核苷酸分子的ATP含量的40-50％。将双链核酸分子、聚合酶和dNTP混合物接触在一起以形成聚合酶延伸混合物。使聚合酶延伸混合物经受使靶核酸分子延伸并释放游离磷酸根的条件。然后由释放的游离磷酸根产生三磷酸腺苷，并且用荧光素酶代谢由游离磷酸根产生的三磷酸腺苷以产生生物发光读出信号，指示样品中靶核酸分子的存在。
本申请的另一方面涉及一种检测样品中靶核酸分子的方法。所述方法包括：提供含有靶核酸分子的样品；以及将所述样品与互补于所述靶核酸分子的至少一部分的捕获寡核苷酸分子接触，使得所述捕获寡核苷酸分子与所述靶核酸分子的互补部分杂交并形成双链核酸分子。将双链核酸分子、聚合酶和dNTP混合物接触在一起以形成聚合酶延伸混合物。使聚合酶延伸混合物经受使靶核酸分子延伸并释放游离磷酸根的条件。然后由释放的游离磷酸根酶促产生三磷酸腺苷，并且用荧光素酶代谢由游离磷酸根产生的三磷酸腺苷以产生生物发光读出信号，指示样品中靶核酸分子的存在。DNA聚合酶、荧光素酶和产生三磷酸腺苷的酶各自与固体支持物偶联。
本申请的另一方面涉及一种用于检测样品中靶核酸分子的试剂盒。所述试剂盒包括互补于靶核酸分子的至少一部分的捕获寡核苷酸分子，使得捕获寡核苷酸分子与靶核酸分子的互补部分杂交并形成双链核酸分子；聚合酶，其与固体支持物偶联；dNTP混合物；用于从释放的游离磷酸根产生三磷酸腺苷的酶，其与固体支持物偶联；以及用于产生生物发光读出信号的荧光素酶，其中荧光素酶与固体支持物偶联。
本申请的另一方面涉及一种用于检测样品中靶核酸分子的试剂盒。试剂盒包括互补于所述靶核酸分子的至少一部分的捕获寡核苷酸分子，使得所述捕获寡核苷酸分子与所述靶核酸分子的互补部分杂交并形成双链核酸分子。捕获寡核苷酸分子(i)长度为30-60个碱基对，(ii)在其3'端上具有4-8个碱基对的突出端，(iii)具有5'尾，(iv)在所述3'端和所述5'尾之间具有靶特异性部分，(v)脱氧二磷酸腺苷含量为40-50％，(vi)在所述3'端或所述5'尾中没有脱氧磷酸胸苷，并且(vii)所述3'端和所述5'尾的ATP含量为所述捕获寡核苷酸分子的ATP含量的40-50％。试剂盒还包括聚合酶、dNTP混合物、用于从释放的游离磷酸根产生三磷酸腺苷的酶以及用于产生生物发光读出信号的荧光素酶。
本申请的最后一个方面涉及一种包含捕获寡核苷酸分子的组合物，其中所述捕获寡核苷酸分子(i)长度为30-60个碱基对，(ii)在其3'端上具有4-8个碱基对的突出端，(iii)具有5'尾，(iv)在所述3'端和所述5'尾之间具有靶特异性部分，(v)脱氧二磷酸腺苷含量为40-50％，(vi)在所述3'端或所述5'尾中没有脱氧磷酸胸苷，并且(vii)所述3'端和所述5'尾的ATP含量为所述捕获寡核苷酸分子的ATP含量的40-50％。
本申请公开了通过使用例如酶反应来检测核酸的方法的显著进步，在酶反应中酶被拴系到表面(例如，纳米颗粒)。本文所述的测定被转换为共同的发光输出。也就是说，在某些实施方案中，它们可以全部与生物发光(BL)蛋白或底物连接，从而将允许发射和读取光，所述光的量与系统或生物样品中靶核酸的量相关。此技术适用于生成各种核酸分子的定性以及定量结果。
本申请与其他检测方法和系统相比具有多个优点。这些包括：1)速度-使用酶促反应的测定快速地发生，在数分钟内提供读出；2)使用基于发光的读出，其能够实现独立、高度便携的系统和装置，它们不需要庞大的激发元件(例如荧光所需的那些)；3)灵敏度-由于对于每个杂交事件和酶促反应测定释放多种游离磷酸根，促进检测和读出步骤的信号放大；4)制造成本降低-这种系统的可能部件，包括例如纳米颗粒，可以由便宜的材料制成并且可以容易地批量生产；5)多重能力-在本申请的某些实施方案中，偶联的生化反应可以在单个系统中检测多种核酸分子；6)拴系酶的使用促进最大酶稳定性和活性；7)拴系酶的使用将反应和读出限制在系统的特定区域(例如，卡片的特定区域)，减小读取器中光电检测器的大小；8)拴系酶的使用限制反应和读出，实现在线阴性对照和背景发光对照；9)拴系酶的使用限制反应和读出，减少同一系统中其他核酸分子检测的光污染；10)捕获寡核苷酸的固定增强了在系统的特定区域(例如，卡片的特定区域)中检测多种靶寡核苷酸的能力；11)使用等温扩增使得能够在环境温度下进行检测，而无需温度循环；并且12)捕获寡核苷酸的设计使得能够进行单步反应而无副产物的干扰/抑制，并且将生物发光酶并入单步反应的能力使得能够进行额外水平的信号放大，所述信号放大来自游离磷酸根从代谢的AP分子的释放，其反馈到ATP生成反应中。
附图说明
图1显示了拴系酶技术(TET)-miRNA反应的实施方案。miRNA(或其他单链核酸聚合物)与捕获寡核苷酸内的互补插入序列退火并生成双链。这允许DNA-聚合酶结合并引发聚合反应，其通过核苷酸掺入(等温复制)来释放游离磷酸根(PPi)。在ADP、NAD+和GAP的存在下，这些PPi基团然后被偶联的GAPDH-PGK酶促反应用于生成ATP。最后，荧光素酶水解ATP以生成生物发光信号。
图2显示了TET-miRNA反应的另一个实施方案。miRNA(或其他单链核酸聚合物)与捕获寡核苷酸内的互补插入序列退火并生成双链。这允许DNA-聚合酶结合并引发聚合反应，其通过核苷酸掺入(等温复制)来释放游离磷酸根(PPi)。在APS的存在下，这些PPi基团然后被酶ATP-硫酸化酶用于生成ATP。最后，荧光素酶水解ATP以生成生物发光信号。
图3显示捕获寡核苷酸(Cap-Oligo)的设计和特征。
图4显示从反应混合物中排除dATP改善了测定动力学和灵敏度。
图5A至图5D显示TET-miRNA测定可检测靶寡核苷酸的3'端中的错配核苷酸，以及数据的各种分析或定量。
图6A至图6B显示靶寡核苷酸检测的TET-miRNA测定灵敏度范围的测试。
图7A至图7C显示捕获寡核苷酸的5'和3'尾的设计影响TET-miRNA反应动力学。
图8A至图8B显示捕获寡核苷酸dATP含量影响TET-miRNA反应动力学。
图9A至图9B显示捕获寡核苷酸的3'尾长度影响TET-miRNA反应活性和动力学。
图10A至图10C显示TET-miRNA测定对MIR-340靶寡核苷酸(肺癌相关微RNA)序列中的突变敏感。
图11A至图11B显示TET-miRNA测定可检测人血清中天然存在的miRNA。
图12显示TET-miRNA测定可检测人血浆中天然存在的miRNA。
图13A至图13B显示核糖核酸酶(RNA酶)处理消除了TET-miRNA活性。
图14A至图14B显示使用(非定向)NP固定相对于溶液中反应的靶寡核苷酸检测。
图15A至图15B显示通过生物素-链霉亲和素结合将商业BST2.0固定到NP上抑制TET-miRNA反应测定。
图16A至图16C显示TET-miRNA测定仅受温度很小影响。
图17A至图17E显示用于检测人血清中miRNA的两种不同捕获寡核苷酸设计的测试(非拴系)。
图18A至图18B显示TET-miRNA测定中各种DNA聚合酶活性的活性比较。
图19A至图19D显示当拴系相对于溶液中时使用TET-miRNA的靶寡核苷酸检测。
图20A至图20C显示在TET-miRNA测定中His-Si-Klenow与His-Si-BST活性的比较，拴系相对于未拴系。
图21A至图21B显示使用各种比率的His-Si-ATPS/His-Si-BST/NP的靶寡核苷酸检测的比较。
图22A至图22C显示使用TET-miRNA(His-Si-酶)和DNA捕获寡核苷酸的miRNA(RNA寡核苷酸)检测。
图23A至图23C显示测试不同非拴系DNA聚合酶的靶寡核苷酸错配灵敏度(His-Si-Klenow相对于His-Si-BST)。
图24显示当捕获寡核苷酸在溶液中相对于固定(非定向)时测试TET-miRNA反应。
图25A至图25B显示当捕获寡核苷酸在溶液中相对于通过生物素-链霉亲和素固定到SiO2 NP时测试TET-miRNA反应。
具体实施方式
本申请的一个方面涉及一种检测样品中靶核酸分子的方法。所述方法包括：提供含有靶核酸分子的样品；以及将所述样品与互补于所述靶核酸分子的至少一部分的捕获寡核苷酸分子接触，使得所述捕获寡核苷酸分子与所述靶核苷酸分子的互补部分杂交并形成双链核酸分子。捕获寡核苷酸分子(i)长度为30-60个碱基对，(ii)在其3'端上具有4-8个碱基对的突出端，(iii)具有5'尾，(iv)在所述3'端和所述5'尾之间具有靶特异性部分，(v)脱氧二磷酸腺苷含量为40-50％，(vi)在所述3'端或所述5'尾中没有脱氧磷酸胸苷，并且(vii)所述3'端和所述5'尾的ATP含量为所述捕获寡核苷酸分子的ATP含量的40-50％。将双链核酸分子、聚合酶和dNTP混合物接触在一起以形成聚合酶延伸混合物。使聚合酶延伸混合物经受使靶核酸分子延伸并释放游离磷酸根的条件。然后由释放的游离磷酸根产生三磷酸腺苷，并且用荧光素酶代谢由游离磷酸根产生的三磷酸腺苷以产生生物发光读出信号，指示样品中靶核酸分子的存在。
本申请的另一方面涉及一种检测样品中靶核酸分子的方法。所述方法包括：提供含有靶核酸分子的样品；以及将所述样品与互补于所述靶核酸分子的至少一部分的捕获寡核苷酸分子接触，使得所述捕获寡核苷酸分子与所述靶核酸分子的互补部分杂交并形成双链核酸分子。将双链核酸分子、聚合酶和dNTP混合物接触在一起以形成聚合酶延伸混合物。使聚合酶延伸混合物经受使靶核酸分子延伸并释放游离磷酸根的条件。然后由释放的游离磷酸根酶促产生三磷酸腺苷，并且用荧光素酶代谢由游离磷酸根产生的三磷酸腺苷以产生生物发光读出信号，指示样品中靶核酸分子的存在。DNA聚合酶、荧光素酶和产生三磷酸腺苷的酶各自与固体支持物偶联。
如图1所示，将DNA聚合酶拴系至一个纳米颗粒，并且将GAPDH、PGK和荧光素酶(“Luc”)拴系至另一个纳米颗粒。miRNA靶与拴系或溶液中的所提供的捕获寡核苷酸内的互补插入序列退火，并且生成了双链。这允许DNA聚合酶结合并引发聚合反应，从而通过核苷酸掺入来释放游离磷酸根(PPi)。提供ADP、NAD+和3-磷酸甘油醛用于测定。在这些组分的存在下，游离磷酸根被拴系的GAPDH和PGK用于生成ATP。然后结合荧光素，ATP被拴系的Luc用来生成生物发光信号。所发射的光的量与系统中ATP的量成正比，从而对应于系统中靶miRNA的量。在一个实施方案中，所发射的光可以由定位成捕获所发射的信号的光电检测器定量和/或定性地读取。
另选地，如图2所示，将DNA聚合酶拴系至一个纳米颗粒，并且将ATP硫酸化酶(ATP-sul)和荧光素酶(“Luc”)拴系至另一个纳米颗粒。miRNA靶与拴系或溶液中的所提供的捕获寡核苷酸内的互补插入序列退火，并且生成了双链。这允许DNA聚合酶结合并引发聚合反应，从而通过核苷酸掺入来释放游离磷酸根(PPi)。提供5'-磷酰硫酸腺苷(APS)用于测定。在APS的存在下，游离磷酸根被拴系的ATP-sul用于生成ATP。然后结合荧光素，ATP被拴系的Luc用于生成生物发光信号。所发射的光的量与系统中ATP的量成正比，从而对应于系统中靶miRNA的量。在一个实施方案中，所发射的光可以由定位成捕获所发射的信号的光电检测器定量和/或定性地读取。
根据本申请的合适的生物样品包括以下生物样品，包括但不限于血液、血清、血浆、脑脊液、尿液、唾液、组织。工业样品可以包括食品、饮料和合成材料。环境样品可以包括水、空气或表面样品。
术语“核酸”是指核苷酸(例如，天然的和非天然的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸)的聚合物，包括DNA、RNA和它们的子类，如cDNA、mRNA、miRNA等。核酸可以是单链的并且通常含有5'-3'磷酸二酯键，但在一些情况下，核苷酸类似物可以具有其他键联。核酸可以包括天然存在的碱基(腺苷、鸟苷、胞嘧啶、尿嘧啶和胸苷)以及非天然的碱基。
如本文所用，术语“靶核酸”或“靶”是指样品中待检测或分析的核酸序列的一部分。术语靶包括靶序列的所有变体，例如一种或多种突变变体和野生型变体。
在一个实施方案中，靶核酸分子是微RNA。
如本文所用，“捕获寡核苷酸”是指通过标准碱基配对与靶核酸中的靶序列特异性杂交的核酸片段。如本文所用，“特异性杂交”是指在严格杂交测定条件下，捕获寡核苷酸与它们的靶序列或其复制物杂交以形成稳定的捕获寡核苷酸:靶杂交体，同时使稳定的捕获寡核苷酸:非靶杂交体的形成最小化。因此，捕获寡核苷酸与靶序列或其复制物的杂交程度远大于与非靶序列的杂交程度。合适的杂交条件是本领域熟知的，可基于序列组成进行预测，或可通过使用常规测试方法来确定(参见例如Sambrook等人,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,第2版.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.,1989，其以引用的方式整体并入本文)。
图3描述了捕获寡核苷酸的设计的实施方案。如图3所示，捕获寡核苷酸的长度可以是30-60个核苷酸，包括5'延伸尾、内部互补插入物和3'尾。5'延伸尾和3'尾序列不含dTTP。5'延伸尾和3'尾的ATP含量为整个寡核苷酸的40-50％。最佳捕获寡核苷酸序列在3'尾包含4至8个额外的核苷酸。优选地，捕获寡核苷酸被设计为不与自身杂交以形成发夹结构，使得干扰与靶核酸的杂交。
如本文所用，“荧光素酶”是指如下催化发光反应的加氧酶：
因此，除非另外指定，否则荧光素酶是指催化生物发光反应(产生生物发光的反应)的酶或光蛋白，并且是天然存在、重组或突变的荧光素酶。当天然存在时，本领域普通技术人员可容易地从生物体获得荧光素酶。如果荧光素酶是天然存在的荧光素酶，或重组或突变的荧光素酶(例如，在天然存在的荧光素酶的荧光素酶-荧光素反应中保留活性的荧光素酶)，则表达编码荧光素酶的核酸。它可以容易地从转化的细菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等的培养物中获得。此外，重组或突变的荧光素酶可容易地从使用编码荧光素酶的核酸的体外无细胞系统中获得。荧光素酶购自Promega Corporation,Madison,WI.。荧光素酶、其修饰的突变体或变体也是本领域中已知的并且描述于例如Thorne等人,“Illuminating Insights into Firefly Luciferase and Other BioluminescentReporters Used in Chemical Biology,”Chemistry&Biology 17(6):646–657(2010)中，其以引用的方式整体并入本文。
根据本申请的“聚合酶延伸”反应包括所有形式的模板指导的聚合酶催化的核酸合成反应。引物延伸反应的条件和试剂是本领域已知的，并且在此阶段可以使用任何标准方法、试剂和酶等(参见，例如，Sambrook等人,(编辑),Molecular Cloning:a LaboratoryManual(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press，其以引用的方式整体并入本文)。因此，最基本形式的延伸反应是在引物、脱氧核苷酸(dNTP)和合适的聚合酶(例如Klenow)或实际上任何可用和合适的聚合酶的存在下进行的。以举例的方式，适用于本申请方法的聚合酶是本领域熟知的并且包括但不限于全长BST DNA聚合酶、大片段BST DNA聚合酶、BST2.0DNA聚合酶、Klenow片段(3'至5'exo)和DNA聚合酶I(大Klenow片段)。可以根据本领域已知的程序，根据选择来选择条件。
用于本申请方法的聚合酶延伸技术是等温技术(即，在单一温度下进行的技术或者扩增过程的主要方面是在单一温度下进行的技术)。这些技术依赖于聚合酶复制被扩增的模板链以形成结合双链体的能力。等温技术依赖于链置换聚合酶以分离/置换双链体的两条链并重新复制模板。这种熟知的特性已经成为许多科学文章的主题(参见例如Y.Masamute等人,J.Biol.Chem.246:2692-2701(1971)；R.L.Lechner等人,J.Biol.Chem.258:11174-11184(1983)；以及R.C.Lundquist和B.M.Olivera,Cell 31:53-60(1982)，其以引用的方式整体并入本文)。
简言之，如本申请的方法中所用，当DNA聚合酶结合捕获寡核苷酸-靶杂交体(即双链DNA)并基于捕获寡核苷酸序列延伸互补DNA链时，发生聚合酶延伸。使用添加到反应中的脱氧核苷酸(dNTP)混合物中提供的可用核苷酸进行延伸反应。这些dNTP包括脱氧三磷酸腺苷(dATP)、脱氧三磷酸胸苷(dTTP)、脱氧三磷酸胞苷(dCTP)和脱氧三磷酸鸟苷(dGTP)。在一个实施方案中，从聚合酶延伸混合物中排除脱氧三磷酸腺苷。
如上所述，用于本申请方法的聚合酶延伸技术是等温技术(即，在单一温度下进行的技术或者扩增过程的主要方面是在单一温度下进行的技术)。因此，在某些实施方案中，聚合酶延伸反应在0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95至100℃的温度下进行。在一个实施方案中，聚合酶延伸反应在25至40℃的温度下进行。
聚合酶延伸反应每个添加到DNA链的核苷酸释放两个磷酸根(PPi)。在本申请的方法中，这些游离磷酸根(PPi)的释放然后可用于促进样品中靶核酸分子的检测。具体地，通过酶促反应将PPi转化为ATP并随后使用信号转导分子荧光素酶对ATP进行生物发光检测，可以检测靶核酸分子的存在或不存在。
组合使用荧光素酶和荧光素来鉴定靶核酸，因为生成的光的量基本上与生成的ATP的量成比例，并且进而与掺入的核苷酸和存在的靶核酸量成正比。因此，所述方法还包括提供荧光素和O2，其中将荧光素和O2加入到反应中。
如上所述，本文所述的方法涉及使聚合酶延伸混合物经受使靶核酸分子延伸并释放游离磷酸根的条件。然后通过酶促反应从释放的游离磷酸根产生三磷酸腺苷(ATP)，然后用荧光素酶代谢以产生生物发光读出信号。根据此方面，在一个实施方案中，产生三磷酸腺苷包括使释放的游离磷酸根经受偶联的3-磷酸甘油醛脱氢酶-磷酸甘油酸激酶(GAPDH-PGK)酶促反应以产生三磷酸腺苷。
在此实施方案中，酶促反应涉及在PPi、二磷酸腺苷(ADP)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和3-磷酸甘油醛(GAP)的存在下使GAPDH与PGK反应以产生ATP。然后ATP与荧光素酶反应以产生可测量的信号。反应方案如下所示：
在另一个实施方案中，三磷酸腺苷可通过在三磷酸腺苷硫酸化酶(ATP-sul)的存在下使释放的游离磷酸根与5'-磷酰硫酸腺苷(APS)接触以产生三磷酸腺苷来产生。然后ATP与荧光素酶反应以产生可测量的信号。反应方案如下所示：
根据上述实施方案，3-磷酸甘油醛脱氢酶、磷酸甘油酸激酶和/或三磷酸腺苷硫酸化酶可如上所述与固体支持物偶联。
所产生的光的量可以在合适的光线下使用敏感装置例如光度计容易地确定。因此，发光测定法提供了能够定量的优点。
在一个实施方案中，定量生物发光读出信号以确定样品中靶核酸分子的存在或浓度。靶核酸的量可以从发光信号的峰值幅度、和/或信号达到其峰值幅度所花费的时间、和/或在一段时间内发射的信号的积分量、和/或产生发光的速率来确定。
在一个实施方案中，靶核酸分子以小于10-5摩尔/升的浓度存在于样品中。
在一个实施方案中，样品中靶核酸分子的存在通过包括以下的程序来确定：计算生物发光信号产生的初始速率；计算达到峰值生物发光所需的时间段；以及计算生物发光信号峰值幅度或从时间零到峰值生物发光的积分生物发光信号。
这些程序可单独使用或作为结合两种或更多种程序以更好定量的分析方法的一部分使用。对于每个程序或程序的组合，可以预定阈值并将其根据靶核酸靶的已知量进行校准。预定值还可用于鉴定与所需靶寡核苷酸相似但不相同的序列(即，突变)。另外，由这些分析程序提供的值可以相对于截止值进行评估以提供存在/不存在的测量结果，或作为能够进行定量读出的量度。
在一个实施方案中，提供多种捕获寡核苷酸分子用于检测多种靶核酸分子。
根据此实施方案的设想方法是多重测定，在所述测定中利用多种捕获寡核苷酸来确定样品中是否存在多种预定核酸靶序列中的一种或多种。此类多重测定的一个特别有用的领域是筛选测定，在所述测定中通常的分析输出指示不存在所寻求的核酸。
在上述方法的多重实施方案中，样品与多种不同的捕获寡核苷酸混合。在此实施方案中，使用一种捕获寡核苷酸的某一结果的分析输出与使用所有捕获寡核苷酸的相反结果的分析输出是可区分的。
根据此实施方案，例如，固体支持物可含有对多种靶核酸具有特异性的多种捕获寡核苷酸。每种捕获寡核苷酸可以定位于固体支持物的限定位置或区域，或在固体支持物的限定位置或区域的表面上原位合成。这样的支持物有利于对多种捕获寡核苷酸结合的靶核酸进行平行分析。这些支持物也适用于高通量筛选。
在某些实施方案中，本申请的反应在溶液中进行。术语“在溶液中”是指在溶液或悬浮液中检测靶核酸的任何测定。例如，与靶核酸的第一杂交可用第一捕获寡核苷酸进行，并且与靶核酸的第二杂交可用第二捕获寡核苷酸进行。这种多重杂交可包括洗涤步骤以除去任何不期望的(例如，非杂交序列)组分。
在某些实施方案中，根据本申请的方法的酶可以与固体支持物偶联。在其他实施方案中，所述方法的酶可以保留在溶液中。
合适的支持物包括有机或无机材料，并且可以具有任何合适的大小或形状(例如，支架片材、平台和/或纳米颗粒)。拴系或固定根据本申请的测定的组分用于例如在空间上限制它们以及在进行例如作为特定测定的一部分的级联或顺序反应中增强它们的稳定性和/或功能。在某些实施方案中，支持物材料包括例如核苷酸序列或凝胶。在某些实施方案中，根据本申请的测定的酶或组分可以固定在或拴系于例如纳米颗粒或支持物材料如平台的通道(例如，微流体通道)的腔表面。
可以使用若干种技术以将根据本申请的测定的组分(例如，酶)固定在表面上。例如，组分可以非特异性地连接或通过特异性的但非定向的化学反应(例如，羧基-酰胺结合)来结合。根据本申请的方法，还可以使用定向酶固定。定向酶固定赋予若干优点，包括例如定位结合标签(例如，亲和标签)，使得拴系的酶的活性和稳定性被优化(参见Mukai等人,“Sequential Reactions of Surface-Tethered Glycolytic Enzymes,”Chem.Biol.16(9):1013-20(2009)，其以引用的方式整体并入本文)。
在核酸检测中涉及的酶如何被拴系到表面的一个实例是使用定向固定。在根据本申请的测定的某些实施方案中，在测定的反应中涉及的重组酶或测定组分用亲和标签工程化，使得它们能够结合至表面如二氧化硅或镍或者表面的组分如镍-次氮基三乙酸。例如，亲和标签可以连接在待固定的蛋白质的氨基或羧基末端，或包埋在待固定的蛋白质内。拴系结构域的最佳位置将取决于酶催化结构域、底物结合结构域的性质和位置、以及酶必须产生的任何构象变化。
使用亲和标记蛋白是特别方便的，因为在本申请的方法中使用的蛋白质(即，DNA聚合酶、荧光素酶等)可以容易地表达为与合适的结合标签的融合体，以有利于向含有相应捕获结合部分的固体支持物的固定。可根据本申请的该实施方案使用的合适的捕获部分和结合标签配偶体包括但不限于His-Si、His、Si、生物素、链霉亲和素、Pt、Au、Ag、His-Pt、His-Au、His-Ag、GST、抗体和表位标签。将寡核苷酸共价连接到固体支持物的方法是本领域熟知的，参见例如Gosh等人,“Covalent Attachment of Oligonucleotides to SolidSupports,”Nucleic Acids Res.15(13):5353-5372(1987)；Joos等人,“CovalentAttachment of Hybridizable Oligonucleotides to Glass Supports,”Anal.Biochem.247(1):96-101(1997)；Lund等人,“Assessment of Methods for CovalentBinding of Nucleic Acids to Magnetic Beads,Dynabeads,and the Characteristicsof the Bound Nucleic Acids in Hybridization Reactions,”Nucleic Acids Res.16(22):10861-80(1988)，其以引用的方式整体并入本文。
在某些实施方案中，DNA聚合酶和/或荧光素酶与固体支持物偶联。
根据本申请的这一方面，DNA聚合酶和/或荧光素酶可以用选自由His-Si、His、Si、生物素、链霉亲和素、Pt、Au、Ag、His-Pt、His-Au、His-Ag、GST、抗体和表位标签组成的组的接头与固体支持物偶联。
用作支持物、平台或支架的表面可以采取多种形式，包括例如各种纳米颗粒或核酸链，并且可以包括各种几何形状。
在根据本申请的某些实施方案中，支持物是纳米颗粒。如本文所用，术语“纳米颗粒”是指平均直径在纳米范围内(即，平均直径至多1μm)的任何颗粒。所使用的纳米颗粒可以由本领域普通技术人员已知的任何合适的有机或无机物质制成。例如，纳米颗粒可以由任何聚合物、氧化铁(II，III)、金、银、碳、二氧化硅、CdSe和/或CdS组成。在一个实施方案中，纳米颗粒是磁性纳米颗粒。在另一个实施方案中，纳米颗粒是磁性的二氧化硅涂覆的纳米颗粒(“MSP”)。
除了纳米颗粒(NP)之外，不同材料的支持物或支架可以呈棒、平坦表面、石墨烯片、纳米管、DNA支架、凝胶、微球或较大支持物的微通道的内通道壁的形式。根据本申请，还考虑将量子点用作支持物。酶固定可以通过非特异性结合、化学修饰、亲和标签或其他缀合技术来实现。
在根据本申请的一个实施方案中，所述方法还包括进行阳性和/或阴性对照。通过与对照量比较来检测靶核酸的诊断或预后量。靶核酸的对照量可以是与靶核酸的测试量比较的任何量或量的范围。对照量可以是作为根据本申请的测定的一部分进行的阳性或阴性对照样品中的靶核酸的量。对照量可以是绝对量(例如，μg/ml)或相对量(例如，信号的相对强度)。
用于本申请方法中的示例性阴性对照包括靶向靶寡核苷酸的封闭寡核苷酸(与靶寡核苷酸完全或部分互补的序列)、靶向捕获寡核苷酸的封闭寡核苷酸(在3'/5'端修饰以抑制延伸)、添加到反应混合物的核糖核酸酶(RNA酶)、缺乏捕获寡核苷酸的反应混合物、缺乏核苷酸的反应混合物(dNTP)和缺乏任何底物的反应混合物。用于本申请方法中的示例性阳性对照包括各种浓度(包括饱和量)的靶寡核苷酸模拟物(具有来自样品的靶寡核苷酸的相同序列的DNA寡核苷酸)和能够通过聚合酶延伸的具有悬垂单链序列的预退火双链DNA。
在各种相关方面，本申请还涉及用于执行本文所述方法的装置和试剂盒。此类试剂盒包含可在临床或研究环境中使用或适于现场实验室或现场使用的监测器、试剂和程序。特别地，设想了包括用于实施本文所述方法的所公开试剂的试剂盒包括用于检测捕获的靶核酸分子和测量靶捕获后产生的生物发光信号的多种手段中的任一种以及适当的说明书。合适的试剂盒包括足以进行检测靶核酸分子的测定的试剂。
应当理解，这样的试剂盒可用于本申请的任何方法。特定组分的选择取决于试剂盒被设计用于执行的特定方法。可以提供另外的组分用于检测分析输出，如通过ATP的释放和生物发光信号的检测所测量的。
如上所述，试剂盒任选地还包括用于通过本文所述方法检测靶核酸的说明书。存在于这种试剂盒中的说明书指导使用者如何使用试剂盒的组分来进行本申请的各种方法。这些说明书可以包括本申请的检测方法(包括通过发光的检测)的描述。
因此，本申请的另一方面涉及一种用于检测样品中靶核酸分子的试剂盒。所述试剂盒包括互补于靶核酸分子的至少一部分的捕获寡核苷酸分子，使得捕获寡核苷酸分子与靶核酸分子的互补部分杂交并形成双链核酸分子；聚合酶，其与固体支持物偶联；dNTP混合物；用于从释放的游离磷酸根产生三磷酸腺苷的酶，其与固体支持物偶联；以及用于产生生物发光读出信号的荧光素酶，其中荧光素酶与固体支持物偶联。
本申请的另一方面涉及一种用于检测样品中靶核酸分子的试剂盒。试剂盒包括互补于所述靶核酸分子的至少一部分的捕获寡核苷酸分子，使得所述捕获寡核苷酸分子与所述靶核酸分子的互补部分杂交并形成双链核酸分子。捕获寡核苷酸分子(i)长度为30-60个碱基对，(ii)在其3'端上具有4-8个碱基对的突出端，(iii)具有5'尾，(iv)在所述3'端和所述5'尾之间具有靶特异性部分，(v)脱氧二磷酸腺苷含量为40-50％，(vi)在所述3'端或所述5'尾中没有脱氧磷酸胸苷，并且(vii)所述3'端和所述5'尾的ATP含量为所述捕获寡核苷酸分子的ATP含量的40-50％。试剂盒还包括聚合酶、dNTP混合物、用于从释放的游离磷酸根产生三磷酸腺苷的酶以及用于产生生物发光读出信号的荧光素酶。
上述试剂盒还可包含用于检测多种靶核酸分子的多种捕获寡核苷酸分子。在设想的用于多重捕获寡核苷酸介导的特异性核酸检测的试剂盒中，试剂盒含有多种针对感兴趣的核酸靶的捕获寡核苷酸。优选地，当试剂盒含有多种捕获寡核苷酸时，每种捕获寡核苷酸被设计成询问不同的靶核酸序列。
本申请的最后一个方面涉及一种包含捕获寡核苷酸分子的组合物，其中所述捕获寡核苷酸分子(i)长度为30-60个碱基对，(ii)在其3'端上具有4-8个碱基对的突出端，(iii)具有5'尾，(iv)在所述3'端和所述5'尾之间具有靶特异性部分，(v)脱氧二磷酸腺苷含量为40-50％，(vi)在所述3'端或所述5'尾中没有脱氧磷酸胸苷，并且(vii)所述3'端和所述5'尾的ATP含量为所述捕获寡核苷酸分子的ATP含量的40-50％。
实施例
以下实施例旨在举例说明本公开的实施方案的实践，但决不旨在限制其范围。
实施例1-从反应混合物中排除dATP改善了测定动力学和灵敏度
通过混合0.05μl ATP硫酸化酶(NEB，M0394S，300U/ml)、0.25μl Klenow(NEB，Lg片段，M0210S，5000U/ml)、5μl His-Si-荧光素酶(实验室制备)、5μl荧光素(200mM)、5μl 20X荧光素酶缓冲液(50mM HEPES、40mM KCL、200mM MgCl2)、2μl APS(30mM)、1μl捕获寡核苷酸(T2(SEQ ID NO:7)，1μM)、1.8μl dNTP混合物(各33mM)和+/-dATP来制备100ul总体积反应混合物。将反应混合物加入含有1μl靶寡核苷酸(R6(SEQ ID NO:6)，1μM)的白色96孔板的个别孔中。然后立即将反应混合物置于TECAN读板器中以在室温下以400毫秒积分时间读取发光信号2000秒。
如图4所示，使用如上所述的条件测试两种相同的反应，从加入到反应A中的核苷酸混合物中排除dATP(脱氧三磷酸腺苷)。荧光素酶结合和水解dATP引起初始发光信号的衰减(1)、峰值响应相位延迟(2)以及信号幅度总体较低(3)。这显示了纯测序和这里使用的拴系检测方法之间的关系，其中生物发光作为读出产生。作为这些数据的结果，将捕获寡核苷酸设计为在其序列中不包括任何dTPS，以避免在反应混合物中对dATP的需要。
实施例2-TET-miRNA测定可检测靶寡核苷酸的3'端中的错配核苷酸
通过混合0.05μl ATP硫酸化酶(NEB，M0394S，300U/ml)、0.25μl Klenow(NEB，Lg片段，M0210S，5000U/ml)、5μl His-Si-荧光素酶(实验室制备)、5μl荧光素(200mM)、5μl 20X荧光素酶缓冲液(50mM HEPES、40mM KCL、200mM MgCl2)、2μl APS(30mM)、1μl捕获寡核苷酸(T2(SEQ ID NO:7)，100uM)和1.8μl dNTP混合物(各33mM)来制备100μl总体积反应。将反应混合物加入含有1μl每种靶寡核苷酸(R1-R6(SEQ ID NO:1-6)，100μM)的白色96孔板的个别孔中，并立即置于TECAN读板器中以在室温下以400毫秒积分时间读取发光信号3500秒。
图5A显示发光信号随着靶寡核苷酸序列3'端的如图5B(以下划线字体表示)所示的错配核苷酸百分比的增加而降低。测试了两种互补的靶寡核苷酸(R1(SEQ ID NO:1)和R6(SEQ ID NO:6)，与捕获寡核苷酸中移位的和重叠序列互补)和4种错配的寡核苷酸(以错配核苷酸的百分比表示)，证明了对核苷酸错配的TET反应的强烈抑制，并总结在图5C中。图5D显示了用于确定靶寡核苷酸存在和与捕获寡核苷酸杂交的可能的数据分析程序的说明(提供了图5A中所示的靶寡核苷酸R1(SEQ ID NO:1)和R6(SEQ ID NO:6)的数据)：a/a'-计算发光信号产生的初始速率(斜率)；b/b'-峰值发光时间；c/c'-发光信号的峰值幅度；以及d/d'-从时间0到峰值的积分发光信号。
实施例3-使用TET-miRNA测定确定靶寡核苷酸检测的灵敏度范围
通过混合0.05μl ATP硫酸化酶(NEB，M0394S，300U/ml)、0.25μl Klenow(NEB，Lg片段，M0210S，5000U/ml)、5μl His-Si-荧光素酶(实验室制备)、5μl荧光素(200mM)、5μl 20X荧光素酶缓冲液(50mM HEPES、40mM KCL、200mM MgCl2)、2μl APS(30mM)、0.5μl捕获寡核苷酸(T2(SEQ ID NO:7)(参见图7A)，1μM)和1.8μl dCTP/dTTP/dGTP混合物(各33mM)来制备100μl总体积反应混合物。将反应混合物加入含有递减浓度的靶寡核苷酸(R6(SEQ ID NO:6)，0mM、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM、1μM)的白色96孔板的个别孔中，并立即置于TECAN读板器中以在室温下以400毫秒积分时间读取发光信号2000秒。
图6A显示了响应于递减浓度的靶寡核苷酸的发光信号。表明了1皮摩尔(10-12mol/L)至1微摩尔(10-6mol/L)浓度的检测范围。图6B显示，尽管需要进一步优化，但如从反应动力学(即，作为寡核苷酸浓度(以picoM为单位)的函数的初始反应阶段的斜率)计算的图6A的总结指示高灵敏度和宽动态范围。
实施例4-捕获寡核苷酸的5'和3'尾的设计影响TET-miRNA反应动力学
通过混合0.05μl ATP硫酸化酶(NEB，M0394S，300U/ml)、0.25μl Klenow(NEB，Lg片段，M0210S，5000U/ml)、5ul His-Si-荧光素酶(实验室制备)、5μl荧光素(200mM)、5μl 20X荧光素酶缓冲液(50mM HEPES、40mM KCL、200mM MgCl2)、2μl APS(30mM)、1μl靶寡核苷酸(R6(SEQ ID NO:6)，100μM)和1.8μl dNTP混合物(各33mM)来制备100μl总体积反应混合物。将反应混合物加入含有1μl每种捕获寡核苷酸(T2-T6(SEQ ID NO:7-11)，100μM)的白色96孔板的个别孔中，并立即置于TECAN读板器中以在室温下以400毫秒积分时间读取发光信号1000秒。
如图7A所示，产生了捕获寡核苷酸的若干设计(T2-T6(SEQ ID NO:7-11))。所有设计包括相似的互补插入序列(与R6靶寡核苷酸互补，用下划线字体指示)。图7B显示了如在各种捕获寡核苷酸(如图7A中提供的)的存在下，响应于靶寡核苷酸的加入所测量的发光信号。图7C是图7B的总结并且显示了退火动力学的差异，如通过计算的各种捕获寡核苷酸的反应斜率所指示。
实施例5-捕获寡核苷酸dATP含量影响TET-miRNA反应动力学
通过混合0.05μl ATP硫酸化酶(NEB，M0394S，300U/ml)、0.25μl Klenow(NEB，Lg片段，M0210S，5000U/ml)、5μl His-Si-荧光素酶(实验室制备)、5μl荧光素(200mM)、5μl 20X荧光素酶缓冲液(50mM HEPES、40mM KCL、200mM MgCl2)、2μl APS(30mM)、1μl靶寡核苷酸(R6(SEQ ID NO:6)，100μM)和1.8μl dNTP混合物(各33mM)来制备100μl总体积反应混合物。将反应混合物加入含有1μl每种捕获寡核苷酸(T1(SEQ ID NO:12)+T1A-T1E(SEQ ID NO:13-17)，100μM)的白色96孔板的个别孔中，并立即置于TECAN读板器中以在室温下以400毫秒积分时间读取发光信号1000秒。
如图8A所示，设计了含有递增百分比的dATP(27％-63％)的6种捕获寡核苷酸以用于检测靶寡核苷酸hsa-let-7a-5p(全部都具有相似的互补插入序列，用下划线字体表示)。图8B是显示在捕获寡核苷酸序列内具有40％-50％dATP含量的最佳活性的数据总结。此实验值是令人惊讶的并且代表显著的增强。
实施例6-捕获寡核苷酸的3'尾长度影响TET-miRNA反应活性和动力学
通过混合0.05μl ATP硫酸化酶(NEB，M0394S，300U/ml)、0.25μl Klenow(NEB，Lg片段，M0210S，5000U/ml)、5μl His-Si-荧光素酶(实验室制备)、5μl荧光素(200mM)、5μl 20X荧光素酶缓冲液(50mM HEPES、40mM KCL、200mM MgCl2)、2μl APS(30mM)、1μl靶寡核苷酸(R6(SEQ ID NO:6)，100μM)和1.8μl dNTP混合物(各33mM)来制备100μl总体积反应混合物。将反应混合物加入含有1μl每种捕获寡核苷酸(T1-T9(SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:18-25)，100μM)的白色96孔板的个别孔中，并立即置于TECAN读板器中以在室温下以400毫秒积分时间读取发光信号1000秒。
如图9A所示，设计了9种捕获寡核苷酸以用于检测靶寡核苷酸hsa-let-7a-5p。这九种捕获寡核苷酸在它们的序列的3'端的miRNA互补插入位点(以下划线字体表示)之后含有递减数量的核苷酸。图9B显示当将5-8个核苷酸添加到靶寡核苷酸互补插入序列的3'上时，达到TET-miRNA测定最佳活性。
实施例7-TET-miRNA测定对MIR-340靶寡核苷酸序列中的突变敏感
通过混合0.05μl ATP硫酸化酶(NEB，M0394S，300U/ml)、0.25μl Klenow(NEB，Lg片段，M0210S，5000U/ml)、5μl His-Si-荧光素酶(实验室制备)、5μl荧光素(200mM)、5μl 20X荧光素酶缓冲液(50mM HEPES、40mM KCL、200mM MgCl2)、2μl APS(30mM)、1μl捕获寡核苷酸(T2，100μM)和1.8μl dNTP混合物(各33mM)来制备100μl总体积反应混合物。将反应混合物加入含有1μl每种靶寡核苷酸(MIR-340#1-MIR-340#7(SEQ ID NO:27-33)，100μM)的白色96孔板的个别孔中，并立即置于TECAN读板器中以在室温下以400毫秒积分时间读取发光信号1200秒。
如图10A所示，在此实验中使用了MIR340靶寡核苷酸(MIR-340#1(SEQ ID NO:27))和各种突变序列(MIR-340#2-#7)(SEQ ID NO:28-33)，以及2种对照(以前的-未突变的MIR-340#2，和Ctrl-不包括任何靶寡核苷酸的反应混合物)(突变的核苷酸用下划线字体表示)。图10B至图10C显示对于如图10A所示的各种突变所测量的发光信号和动力学。图10A中的数据显示，所有测试的突变都诱导了测量的信号中的可检测的差异。
实施例8-TET-miRNA测定可检测人血清和人血浆中天然存在的miRNA
通过混合0.05μl ATP硫酸化酶(NEB，M0394S，300U/ml)、0.25μl Klenow(NEB，Lg片段，M0210S，5000U/ml)、5μl His-Si-荧光素酶(实验室制备)、5μl荧光素(200mM)、5μl 20X荧光素酶缓冲液(50mM HEPES、40mM KCL、200mM MgCl2)、2μl APS(30mM)、1μl靶向如图10A中所列的天然存在的miRNA的捕获寡核苷酸(100μM)和1.8μl dNTP混合物(各33mM)来制备40μl总体积反应混合物。将反应混合物加入含有60μl人血清或人血浆的白色96孔板的个别孔中，并立即置于TECAN读板器中以在室温下以400毫秒积分时间读取发光信号500秒。
如图11A所示，设计了6种捕获寡核苷酸来检测商业获得的人血清中6种不同的天然存在的miRNA。显示了TET-miRNA反应的实时动力学。图11B是图11A的总结，其中将生物发光信号进行500秒积分以显示测试血清样品中各种miRNA的相对量。
如图12所示，用TET-miRNA测试来自3个人类供体的血浆样品(收集于GuthrieMedical Center,Sayre PA)的一组6种天然存在的miRNA。
实施例9-核糖核酸酶(RNA酶)处理消除TET-miRNA活性
通过混合0.05μl ATP硫酸化酶(NEB，M0394S，300U/ml)、0.25μl Klenow(NEB，Lg片段，M0210S，5000U/ml)、5μl His-Si-荧光素酶(实验室制备)、5μl荧光素(200mM)、5μl 20X荧光素酶缓冲液(50mM HEPES、40mM KCL、200mM MgCl2)、2μl APS(30mM)、1μl靶向如图12A至图12B中所述的天然存在的miRNA的捕获寡核苷酸(100μM)和1.8μl dNTP混合物(各33mM)来制备40μl总体积反应混合物。将反应混合物加入含有60μl人血浆的白色96孔板的个别孔中，并立即置于TECAN读板器中以在室温下以400毫秒积分时间读取发光信号500秒。
图13A显示了用TET-miRNA测试来自3个受试者的血浆样品(收集于Guthrie(Sayre,PA))的一组4种天然存在的miRNA。图13B显示在室温下用RNA酶-A处理30分钟后观察到的信号的显著降低。
实施例10-使用NP-固定相对于溶液中反应的靶寡核苷酸检测的分析
根据制造商的说明书将生物素化的酶固定到涂覆链霉亲和素的微球(500nmSiO2,Bangs Laboratory,IN,USA)上，然后旋转洗涤掉未结合的蛋白质3次。将等量的NP拴系或未拴系的酶加入到含有以下的反应混合物(每个反应100μl总体积)中：5μl His-Si-荧光素酶(实验室制备)、5μl荧光素(200mM)、5μl 20X荧光素酶缓冲液(50mM HEPES、40mMKCL、200mM MgCl2)、2μl APS(30mM)、1μl捕获寡核苷酸(Cap-HAS-MIR-451a，1μM)和1.8μldCTP/dTTP/dGTP混合物(各33mM)。将反应混合物加入含有靶寡核苷酸(HAS-MIR-451a，1μM)的白色96孔板的个别孔中，并立即置于TECAN读板器中以在室温下以400毫秒积分时间读取发光信号2000秒。
商业获得的人血清样品中掺杂等量的靶寡核苷酸HSA-MIR-451a，并加入到包括可溶性酶荧光素酶/ATP-硫酸化酶/Klenow的TET-miRNA反应混合物中(图14A，Sol)或拴系到NP(图14B，NP)。注意，使用通过生物素化的非定向固定将DNA-聚合酶和ATP-硫酸化酶拴系到NP。根据制造商说明书，使用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素化试剂盒(ThermoScientific，USA)对ATP硫酸化酶(NEB，M0394S，300U/ml)和Klenow(NEB，Lg片段，M0210S，5000U/ml)进行生物素化。
实施例11-通过生物素-链霉亲和素结合将商业BST2.0固定到NP抑制TET-miRNA反应测定
根据制造商说明书，使用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素化试剂盒(ThermoScientific，USA)对BST2.0(NEB，M0537S，8000U/ml)进行生物素化。根据制造商的说明书将生物素化的酶固定到涂覆链霉亲和素的微球(500nm SiO2，Bangs Laboratory，IN，USA)上，然后旋转洗涤掉未结合的蛋白质3次。将等量的NP拴系或未拴系的BST2.0加入到含有以下的反应混合物(每个反应100μl总体积)中：0.05μl ATP硫酸化酶(NEB，M0394S，300U/ml)、5μl His-Si-荧光素酶(实验室制备)、5μl荧光素(200mM)、5μl 20X荧光素酶缓冲液(50mMHEPES、40mM KCL、200mM MgCl2)、2μl APS(30mM)、1μl捕获寡核苷酸(Cap-HSA-MIR-451a，1μM)和1.8μl dCTP/dTTP/dGTP混合物(各33mM)。将反应混合物加入含有靶寡核苷酸(HSA-MIR-451a，1μM)的白色96孔板的个别孔中，并立即置于TECAN读板器中以在室温下以400毫秒积分时间读取发光信号2000秒。
商业获得的人血清样品中掺杂等量的HSA-MIR-451a，并加入到包括可溶性酶荧光素酶/ATP-硫酸化酶/Bst2.0的TET-miRNA反应混合物中(图15A，Sol)，或当将Bst2.0通过生物素化固定到NP上时加入(图15B，NP)。数据显示生物素化对其活性有负面影响，并且当将Bst2.0通过非定向固定拴系到NP时更是如此。
实施例12-TET-miRNA测定仅受温度很小影响
通过混合0.05μl ATP硫酸化酶(NEB，M0394S，300U/ml)、0.25μl Klenow(NEB，Lg片段，M0210S，5000U/ml)、5μl His-Si-荧光素酶(实验室制备)、5μl荧光素(200mM)、5μl 20X荧光素酶缓冲液(50mM HEPES、40mM KCL、200mM MgCl2)、2μl APS(30mM)、1μl靶向Has-let-7a-5p miRNA的捕获寡核苷酸(100μM)、1.8μl dNTP混合物(各33mM)和Has-let-7a-5p寡核苷酸来制备100μl总体积反应混合物。将反应混合物加入白色96孔板的个别孔中，并立即置于TECAN读板器中以在所示不同温度下读取发光信号。以400毫秒积分时间测量发光1000秒。
如图16A所示，商业获得的人血清样品中掺杂等量的靶寡核苷酸并在不同温度(25℃-40℃)下加入TET-miRNA反应混合物中。在反应动力学(如从斜率所测量的，图16B)和效率(如从积分信号所测量的，图16C)的初始参数中仅观察到微小的差异。
实施例13-用于检测人血清中miRNA的两种不同捕获寡核苷酸设计的分析
通过混合0.05μl ATP硫酸化酶(NEB，M0394S，300U/ml)、0.25μl Klenow(NEB，Lg片段，M0210S，5000U/ml)、5μl His-Si-荧光素酶(实验室制备)、5μl荧光素(200mM)、5μl 20X荧光素酶缓冲液(50mM HEPES、40mM KCL、200mM MgCl2)、2μl APS(30mM)、1μl CAP1(SEQ IDNO:34)或CAP2(SEQ ID NO:35)捕获寡核苷酸(100μM)、1.8μl dNTP混合物(各33mM)和测试寡核苷酸来制备100μl总体积反应混合物。将反应混合物加入白色96孔板的个别孔中，并立即置于TECAN读板器中以在室温下读取发光信号。以400毫秒积分时间测量发光1000秒。
图17A描述了被测试以检测人血浆中6种不同的天然存在的miRNA的2种捕获寡核苷酸的设计。CAP1是随机核苷酸序列，并且在CAP2中，5'尾和3'尾仅含有腺苷。图17B显示检测天然存在的miRNA以及具有相似序列的基于DNA的靶寡核苷酸(测试寡核苷酸)的TET-miRNA反应的实时动力学。图17C是图17B中呈现的数据的放大部分，以显示各种miRNA分子的发光信号。图17D是图17A的总结，其中将生物发光信号进行500秒积分以显示各种miRNA的相对量。图17E是仅天然存在的miRNA(如图17C所示)的测量结果的总结。
实施例14-在TET-miRNA测定中各种DNA聚合酶活性的比较
通过混合0.05μl ATP硫酸化酶(NEB，M0394S，300U/ml)、DNA聚合酶(如图17A所示)、5μl His-Si-荧光素酶(实验室制备)、5μl荧光素(200mM)、5μl 20X荧光素酶缓冲液(50mM HEPES、40mM KCL、200mM MgCl2)、2μl APS(30mM)、1μl靶向hsa-let-7a-5p miRNA的捕获寡核苷酸(100μM)、1.8μl dNTP混合物(各33mM)和hsa-let-7a-5p寡核苷酸来制备100μl总体积反应混合物。将反应混合物加入白色96孔板的个别孔中，并立即置于TECAN读板器中以在室温下以400毫秒积分时间读取发光信号500秒。
图18A是此实验中使用的DNA聚合酶及其一些关键特征的列表。如图18B所示，商业获得的人血清样品中掺杂等量的miRNA寡核苷酸，并在各种DNA聚合酶的存在下加入TET-miRNA反应混合物中(室温下)。反应动力学的条形图(从反应的初始斜率计算)显示Bst、Klenow和Terminator DNA聚合酶在这些实验条件下提供最快的反应动力学。对照1(CTRL1)反应缺少捕获寡核苷酸，而对照2(CTRL2)不包括DNA聚合酶。突出显示了用于获得先前图中数据的Bst和Klenow变体的数据条。
实施例15－当拴系相对于溶液中时使用TET-miRNA的靶寡核苷酸检测
制备由等量的NP拴系或未拴系的酶，5μl His-Si-荧光素酶、5μl荧光素(200mM)、5μl 20X荧光素酶缓冲液(50mM HEPES、40mM KCL、200mM MgCl2)、2μl APS(30mM)、1μl捕获寡核苷酸(T2(SEQ ID NO:7)，100μM)和1.8μl dCTP/dTTP/dGTP混合物(各33mM)组成的反应混合物。将反应混合物加入含有递增量的靶寡核苷酸(R6(SEQ ID NO:6)，200nM、500nM和1uM)的白色96孔板的个别孔中，并立即置于TECAN读板器中以在室温下以400毫秒积分时间读取发光信号1400秒。
图19A显示了His-Si-酶设计(ATPS：ATP-硫酸化酶，DNA-pol：DNA聚合酶，Luc：荧光素酶)的示意图。将编码ATP-硫酸化酶(MET3，硫酸腺苷酸转移酶，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))、BST(嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶I(pol)基因)和Klenow(大肠杆菌(Escherichia coli)菌株LD93-1 DNA聚合酶I)的基因与His-Si标签融合插入pET17b载体中用于细菌蛋白质表达。使用Ni-NTA珠纯化His-Si-蛋白质，并储存在含有山梨醇的天然蛋白质缓冲液(NPB)中直至使用。图19B显示当拴系相对于使用上述反应混合物制成的溶液中时的酶活性的测量结果。数据显示当将TET-miRNA酶固定到500nmSiO2 NP上时(NP，左)，或当在溶液中时(Sol，右)，个别反应的动力学。图19C是反应动力学(从反应的初始斜率计算)的条形图，其显示当将TET-miRNA酶拴系到NP时，偶联反应以更快的动力学发生。图19D是NP TET-miRNA反应在检测递增浓度的R6靶寡核苷酸中的总结。
实施例16-在TET-miRNA测定中His-Si-Klenow相对于His-Si-BST活性的比较(拴系相对于未拴系)
使用由等量的NP拴系或未拴系的酶，5μl His-Si-荧光素酶、5μl荧光素(200mM)、5μl 20X荧光素酶缓冲液(50mM HEPES、40mM KCL、200mM MgCl2)、2μl APS(30mM)、1μl捕获寡核苷酸(T2(SEQ ID NO:7)，100μM)和1.8μl dCTP/dTTP/dGTP混合物(各33mM)组成的反应缓冲液，进行在拴系相对于溶液中时酶活性的测量。将反应混合物加入含有增加量的靶寡核苷酸(R6(SEQ ID NO:6)，1μM)的白色96孔板的个别孔中，并立即置于TECAN读板器中以在室温下以400毫秒积分时间读取发光信号1200秒。
如图20A所示，来自大肠杆菌(大肠杆菌菌株LD93-1 DNA聚合酶I)的大Klenow片段表达为His-Si亲和标签下游的融合蛋白。图20B显示了与DNA-pol I(His-Si-BST2(来自嗜热脂肪芽孢杆菌))相比，His-Si-Klenow在溶液中的活性。在初始反应速率和总活性方面，His-Si-BST表现出稍好的活性动力学。图20C显示当将反应酶拴系到500nm SiO2纳米颗粒时两种DNA聚合酶活性的比较。同样，His-Si-BST表现出更好的活性。此外，当反应包括拴系酶时，Klenow和BST都表现出活性改善。
实施例17-使用不同比率的His-Si-ATPS/His-Si-BST/NP的靶寡核苷酸检测的比较
使用由20μl NP-His-Si-BST(不同比率的酶/NP，如图20B所示)、20μl NP-His-Si-ATPS、5μl His-Si-荧光素酶、5μl荧光素(200mM)、5μl 20X荧光素酶缓冲液(50mM HEPES、40mM KCL、200mM MgCl2)、2μl APS(30mM)、1μl捕获寡核苷酸(T2(SEQ ID NO:7)，100μM)和1.8μl dCTP/dTTP/dGTP混合物(各33mM)组成的反应混合物，进行酶活性的测量。将反应混合物加入含有1μl靶寡核苷酸(R6，100μM)的白色96孔板的个别孔中，并立即置于TECAN读板器中以在室温下以400毫秒积分时间读取发光信号2000秒。
图21A是His-Si-BST2(DNA-Pol)与ATPS的比率从0.1:1增加到2.5:1的实验总结。图21B是His-Si-BST2(DNA-Pol)与NP的比率从0.1:1增加到10:1的实验总结。
实施例18-使用TET-miRNA(His-Si-酶)和DNA捕获寡核苷酸的miRNA(RNA寡核苷酸)检测
使用由20μl NP-His-Si-BST、20μl NP-His-Si-ATPS、5μl NP-His-Si-荧光素酶、5μl荧光素(200mM)、5μl 20X荧光素酶缓冲液(50mM HEPES、40mM KCL、200mM MgCl2)、2μlAPS(30mM)、1μl捕获寡核苷酸(T2(SEQ ID NO:7)，100μM)和1.8μl dCTP/dTTP/dGTP混合物(各33mM)组成的反应混合物，进行酶活性的测量。将反应混合物加入含有DNA或RNA靶寡核苷酸(R5(SEQ ID NO:38和39)或R6(SEQ ID NO:36和37)，1μM)的白色96孔板的个别孔中，并立即置于TECAN读板器中以在室温下以400毫秒积分时间读取发光信号2500秒。
图22A显示了如制造公司(IDT,San Diego CA)所提供的靶寡核苷酸(RNA和DNA)的序列，以及设计用于检测它们的捕获寡核苷酸(T2)的序列。图22B显示了使用拴系酶检测RNA相对于相应的DNA靶寡核苷酸的TET-miRNA反应。图22C是图22A中呈现的数据的总结，显示了计算的反应初始速率(斜率)。
实施例19-不同非栓系DNA聚合酶(His-Si-Klenow相对于His-Si-BST)的靶寡核苷酸错配灵敏度的分析
使用由20μl NP-His-Si-BST或NP-His-Si-Klenow、20μl NP-His-Si-ATPS、5μlNP-His-Si-荧光素酶、5μl荧光素(200mM)、5μl20X荧光素酶缓冲液(50mM HEPES、40mM KCL、200mM MgCl2)、2μl APS(30mM)、1μl捕获寡核苷酸(T2(SEQ ID NO:7)，100μM)和1.8μldCTP/dTTP/dGTP混合物(各33mM)组成的反应混合物，进行酶活性的测量。将反应混合物加入含有1μl每种靶寡核苷酸(1μM)的白色96孔板的个别孔中，并立即置于TECAN读板器中以在室温下以400毫秒积分时间读取发光信号2000秒。
如图23A所示，相对于捕获寡核苷酸T2的序列，将递增百分比的错配核苷酸在靶寡核苷酸序列的3'端引入到本文所测试的靶寡核苷酸(以下划线字体表示)中。R1(SEQ IDNO:1)和R6(SEQ ID NO:6)寡核苷酸均与捕获寡核苷酸序列匹配；然而，它们含有不同水平的GC含量。图23B是各种寡核苷酸的TET-miRNA反应的初始速度的总结，并且显示Klenow和BST的100％匹配序列的显著更快的动力学，如从初始反应斜率计算的。图23C表明，计算在各种错配寡核苷酸和100％匹配寡核苷酸的存在下的反应速度之间的比率提供了两种DNA聚合酶对靶寡核苷酸中错配含量的灵敏度的量度，其中根据错配百分比，BST聚合酶的灵敏度高2-5倍。
实施例20-当捕获寡核苷酸在溶液中相对于固定(非定向)时，将TET-miRNA反应拴系
使用由20μl NP-His-Si-BST或NP-His-Si-Klenow、20μl NP-His-Si-ATPS、5μlNP-His-Si-荧光素酶、5μl荧光素(200mM)、5μl 20X荧光素酶缓冲液(50mM HEPES、40mMKCL、200mM MgCl2)、2μl APS(30mM)、1μl捕获寡核苷酸(T2(SEQ ID NO:7)，100μM)和1.8μldCTP/dTTP/dGTP混合物(各33mM)组成的反应混合物，进行酶活性的测量。将反应混合物加入含有1μl靶寡核苷酸(1μM)的白色96孔板的个别孔中，并立即置于TECAN读板器中以在室温下以400毫秒积分时间读取发光信号1500秒。
使用溶液中或通过非特异性吸附固定到SiO2 NP上(捕获寡核苷酸与SiO2 NP在室温下孵育30分钟，然后旋转洗涤到天然蛋白质缓冲液中)时的捕获寡核苷酸进行TET-miRNA反应。图24显示捕获寡核苷酸吸附到NP上显著降低其检测靶寡核苷酸的能力。
实施例21－当捕获寡核苷酸在溶液中相对于通过生物素-链霉亲和素固定到SiO2NP上时的TET-miRNA反应的分析
使用由20μl His-Si-BST、20μl His-Si-ATPS、5μl His-Si-荧光素酶、5μl荧光素(200mM)、5μl 20X荧光素酶缓冲液(50mM HEPES、40mM KCL、200mM MgCl2)、2μl APS(30mM)、1μl NP-捕获寡核苷酸(T2(SEQ ID NO:7)，100μM)和1.8μl dCTP/dTTP/dGTP混合物(各33mM)组成的反应混合物，进行酶活性的测量。将反应混合物加入含有1μl靶寡核苷酸(R6(SEQ ID NO:6)，1μM)的白色96孔板的个别孔中，并立即置于TECAN读板器中以在室温下以400毫秒积分时间读取发光信号2000秒。
图25A鉴定了所生成的2种形式的可固定捕获寡核苷酸，其中生物素标签连接到5'或3'端(生物素化寡核苷酸购自IDT，CA，USA)。根据制造商的说明书，将3'和5'生物素化寡核苷酸固定到涂覆链霉亲和素的SiO2 NP(500nm，Bangs Laboratory，IN，USA)上，然后旋转洗涤掉未结合的蛋白质3次。当酶(DNA-Pol、ATP和Luc)在溶液中时，使用栓系到涂覆链霉亲和素的500nm SiO2 NP的捕获寡核苷酸，TET-mRNA反应表明低活性。图25B显示当在5'生物素化捕获寡核苷酸的存在下将TET-mRNA酶也固定到NP上(通过Si-标签)时，获得显著更高的活性；然而，3'生物素化捕获寡核苷酸表现出非常低的活性或没有活性。
尽管本文已经详细描绘和描述了优选实施方案，但是对于相关领域的技术人员而言将显而易见的是，在不脱离本发明的精神下，可以作出各种修改、添加、取代等并且因此这些被视为处于以下权利要求所限定的本发明的范围内。