阅读说明：本技术 一种鉴定野生稻抗稻瘟病性的方法 (Method for identifying rice blast resistance of wild rice ) 是由 兰波 杨迎青 黄俊宝 李湘民 于 2019-10-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供的一种鉴定野生稻抗稻瘟病性的方法,包括以下步骤：1)叶片的取样；2)把剪好的叶片平置于培养装置上,每个培养皿放置4段叶片；放入光照培养箱内培养,24-26℃,相对湿度100％,黑暗培养24小时,然后光照培养,每天24小时光照,光照强度3400Lux照射12h,1310Lux照射12h,培养6-10天后调查发病情况；3)发病调查及标准：调查病斑大小,并根据对照品种,判定抗感,病级分5级,0-2级的为抗病,3-4级的为感病；本发明优化了接种稻瘟病菌的方法,解决了可用于移植的宿根很有限,只能满足接种几个稻瘟病菌生理小种的需求；且操作繁复,只能一组叶片进行一次鉴定操作的缺陷。本发明通过采用培养装置,大大简化了操作步骤。(The invention provides a method for identifying blast resistance of wild rice, which comprises the following steps: 1) sampling the leaves; 2) the cut leaves are horizontally placed on a culture device, and 4 sections of leaves are placed in each culture dish; culturing in light incubator at 24-26 deg.C and relative humidity of 100% in dark for 24 hr, culturing in light for 24 hr, irradiating at 3400Lux for 12 hr and 1310Lux for 12 hr, and culturing for 6-10 days to investigate disease incidence; 3) investigation and criteria of onset: investigating the size of the lesion, and judging the disease resistance according to the control variety, wherein the disease grade is 5, the disease resistance grade is 0-2, and the disease susceptibility grade is 3-4; the invention optimizes the method for inoculating the rice blast germs, solves the problem that the ratoon roots which can be used for transplantation are very limited and can only meet the requirement of inoculating a plurality of physiological races of the rice blast germs; and the operation is complicated, and only one group of blades can carry out one-time identification operation. The invention greatly simplifies the operation steps by adopting the culture device.)

一种鉴定野生稻抗稻瘟病性的方法

技术领域

本发明涉及稻米抗稻瘟病检测领域，具体涉及一种鉴定野生稻抗稻瘟病性的方法。

背景技术

目前，稻瘟病是全球性的水稻最主要的病害之一，可给水稻造成11％ -30％的产量损失，损失稻谷高达数亿公斤，全球每年约值损失1.57亿美元。实践证明，利用抗性品种是防治稻瘟病最经济有效的措施之一，也符合人类绿色食物的要求。然而，由于稻瘟病菌生理小种的多样性和易变性，抗性品种连续使用3-5年后，品种的抗性就会明显衰退。因此，寻找和筛选稳定持久的抗病品种，尤其是从古老的地方品种和野生稻资源中发掘利用持久抗性资源，是防治稻瘟病经济、有效的措施，也是保证稻作稳产、高产的主要途径之一。

无论是常规育种，还是分子育种，研究清楚不同水稻品种所蕴藏的基因和发现它们的新基因是关键的一步。稻瘟病抗性鉴定的方法有2种：(1) 人工接种鉴定。这种方法根据选用菌株的接种方式不同，又可分为①抗谱测定，即多个菌株单个接种鉴定：②多个菌株混合接种鉴定。(2)自然诱发鉴定。目前，野生稻的抗稻瘟病性鉴定主要是通过对宿根进行分盆种植，并利用其长出的新叶进行鉴定。但可用于移植的宿根很有限，只能满足接种几个稻瘟病菌生理小种的需求；且操作繁复，只能一组叶片进行一次鉴定操作。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种鉴定野生稻抗稻瘟病性的方法，解决了现有的野生稻的抗稻瘟病性鉴定主要是通过对宿根进行分盆种植，并利用其长出的新叶进行鉴定。但可用于移植的宿根很有限，只能满足接种几个稻瘟病菌生理小种的需求；且操作繁复，只能一组叶片进行一次鉴定操作缺陷。

(二)技术方案

为了解决上述技术问题，本发明提供的一种鉴定野生稻抗稻瘟病性的方法，包括以下步骤：

1)叶片的取样：在温室中，剪取野生稻和感病对照品种丽江新团黑谷的叶片，分成放入保鲜装置中保鲜，并带回实验室，把叶片剪成5cm的片段；

2)把剪好的叶片平置于培养装置上，每个培养皿放置4段叶片；放入光照培养箱内培养，24-26℃，相对湿度100％，黑暗培养24小时，然后光照培养，每天24小时光照，光照强度3400Lux照射12h，1310Lux照射12h，每天观察滤纸湿度，以保持培养皿内的湿度，相对湿度为100％，培养6-10 天后调查发病情况；

(3)发病调查及标准：调查病斑大小，并根据对照品种，判定抗感，病级分5级，0-2级的为抗病，3-4级的为感病；

所述步骤2)中的培养装置包括外盖和9组培养皿组件，9组培养皿组件固定连接形成成井字形，所述外盖下部装有9个套管组件，所述套管组件包括5个套管，所述套管中装有2.5uL的孢子悬浮液；所述管体底部设有锥形的滴头，所述滴头由无菌水凝固形成，顶部设有连接外盖的顶盖；培养皿组件包括一对成十字形布置的玻璃分隔板、圆形的培养皿体和正方形的固定框，所述玻璃分隔板安装培养皿体内，所述培养皿体外装有固定框；所述培养皿体底部装有相适配的滤纸，所述玻璃分隔板内部设有储液腔，所述储液腔内设有无菌水凝固形成的冰块，所述储液腔底部设有通入培养皿体中；所述玻璃分隔板内固定有铰接玻璃分隔板的固定板，所述固定板上5个与套管一一对应的通孔，以便于套管装入通孔中。本发明优化了接种稻瘟病菌的方法，解决了可用于移植的宿根很有限，只能满足接种几个稻瘟病菌生理小种的需求；且操作繁复，只能一组叶片进行一次鉴定操作的缺陷。本发明通过采用培养装置，大大简化了操作步骤，便于，一次完成9组加样测试。本发明的滴头采用5微升的无菌冰凝结制成。

优选的，孢子悬浮液的浓度10×10⁶个/m²。本发明采用更高浓度的孢子悬浮液，其配置方便，配置精度更高，其与熔融后滴头形成无菌水混合后，滴入叶片中。

优选的，所述套管底部端面的厚度为3-5mm。

优选的，所述套管顶部通过冰水凝固粘附在外盖底部上。

优选的，所述培养皿体侧壁包括向外凸出的内侧锥体和与内侧锥体相适配的内侧冰片；内侧锥体和内侧冰片组成中空的圆柱体。本发明采用内侧锥体和内侧冰片，内侧冰片熔融后浸入滤纸中，内侧锥形形成便于光线折射的折射面，使得光线集中在叶片上，避免了固定板带来的光线的衰弱。

优选的，所述内侧锥体顶部的厚度大于底部的厚度。

优选的，所述固定板通过铰座铰接玻璃分隔板。

(三)有益效果

本发明提供的一种鉴定野生稻抗稻瘟病性的方法，其具有以下优点：

1、本本发明优化了接种稻瘟病菌的方法，解决了可用于移植的宿根很有限，只能满足接种几个稻瘟病菌生理小种的需求；且操作繁复，只能一组叶片进行一次鉴定操作的缺陷。本发明通过采用培养装置，大大简化了操作步骤，便于，一次完成9组加样测试。本发明的滴头采用5微升的无菌冰凝结制成。

附图说明

图1是本发明的鉴定野生稻抗稻瘟病性的方法的实施例1的培养皿组件的俯视图；

图2是本发明的鉴定野生稻抗稻瘟病性的方法的实施例1的培养皿组件的剖面图；

图3是本发明的鉴定野生稻抗稻瘟病性的方法的实施例1的固定板的结构图。

1、外盖，2、培养皿组件，3、套管组件，4、套管，5、滴头，6、玻璃分隔板，7、培养皿体，8、固定框，9、滤纸，10、储液腔，11、冰块，12、固定板，13、通孔，14、内侧锥体，15、内侧冰片，16、折射面，17、铰座。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明中的病斑分级为：

0级：无病斑；

1级：深棕色，病斑没有可见的中心

2级：病斑直径为0.1厘米，病斑小，没有显著的中心：

3级：病斑直径为0.2厘米，病斑小，没有显著的中心：

4级：病斑大，形成菌丝和分生孢子。

在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上；术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”、“前端”、“后端”、“头部”、“尾部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

实施例1

1)叶片的取样：在温室中，剪取野生稻和感病对照品种丽江新团黑谷的叶片，分成放入保鲜装置中保鲜，并带回实验室，把叶片剪成5cm的片段；

2)把剪好的叶片平置于培养装置上，每个培养皿放置4段叶片；放入光照培养箱内培养，24-26℃，相对湿度100％，黑暗培养24小时，然后光照培养，每天24小时光照，光照强度3400Lux照射12h，1310Lux照射12h，每天观察滤纸湿度，以保持培养皿内的湿度，相对湿度为100％，培养6-10 天后调查发病情况；叶片中滴入孢子悬浮液的浓度10×10⁶个/m²。

(3)发病调查及标准：调查病斑大小，并根据对照品种，判定抗感，病级分5级，0-2级的为抗病，3-4级的为感病。

如图1、图2和图3所示，步骤2)中的培养装置包括外盖1和9组培养皿组件2，9组培养皿组件固定连接形成成井字形，所述外盖下部装有9个套管组件3，所述套管组件包括5个套管4，所述套管中装有2.5uL的孢子悬浮液；所述管体底部设有锥形的滴头5，所述滴头由无菌水凝固形成，顶部设有连接外盖的顶盖；培养皿组件包括一对成十字形布置的玻璃分隔板6、圆形的培养皿体7和正方形的固定框8，所述培养皿体底部装有相适配的滤纸9，所述玻璃分隔板安装培养皿体内，所述培养皿体外装有固定框；所述玻璃分隔板内部设有储液腔10，所述储液腔内设有无菌水凝固形成的冰块11，所述储液腔底部设有通入培养皿体中；所述玻璃分隔板内固定有铰接玻璃分隔板的固定板12，所述固定板上5个与套管一一对应的通孔13，以便于套管装入通孔中。冰块熔融的无菌水的体积为2-3ml。孢子悬浮液的浓度10×10⁶个/m²。本发明采用更高浓度的孢子悬浮液，其配置方便，配置精度更高，其与熔融后滴头形成无菌水混合后，滴入叶片中。所述套管底部端面的厚度为3-5mm。所述套管顶部通过冰水凝固粘附在外盖底部上。所述培养皿体侧壁包括向外凸出的内侧锥体14和与内侧锥体相适配的内侧冰片15；内侧锥体和内侧冰片组成中空的圆柱体。本发明采用内侧锥体和内侧冰片，内侧冰片熔融后浸入滤纸中，内侧锥形形成便于光线折射的折射面16，使得光线集中在叶片上，避免了固定板带来的光线的衰弱。所述内侧锥体顶部的厚度大于底部的厚度。所述固定板通过铰座17铰接玻璃分隔板。本发明的培养装置使用前和保鲜装置一起放置在-5至-10℃的条件保存；本发明还可以不用保鲜装置，直接将叶片剪裁后放入培养皿组件中，期间使用保鲜膜封装，待进入实验室后，取下保鲜膜，装上外盖，开始测试，其将步骤1)和步骤2的衔接过程大大简化，取样后可以培养测试。

本实施例实施时，在温室中，剪取野生稻和感病对照品种丽江新团黑谷的叶片，分成放入保鲜装置中保鲜，并带回实验室，把叶片剪成5cm的片段；把剪好的叶片平置于培养装置上，每个培养皿放置4段叶片；放入光照培养箱内培养，24-26℃，相对湿度100％，黑暗培养24小时，然后光照培养，每天24小时光照，光照强度3400Lux照射12h，1310Lux照射12h，每天观察滤纸湿度，以保持培养皿内的湿度，相对湿度为100％，培养6-10 天后调查发病情况；在培养的过程，把叶片放在固定板下方，盖上装有滴管的外盖，随着温度的升高，滴管熔融引导内部悬浮液向下滴在叶片上；期间冰片和冰块熔融后浸入滤纸中；完成加样过程；内侧冰片熔融后浸入滤纸中，内侧锥形形成便于光线折射的折射面，使得光线集中在叶片上，避免了固定板带来的光线的衰弱。

上述各实施例仅用于说明本发明，其中各部件的结构、连接方式等都是可以有所变化的，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应排除在本发明的保护范围之外。