阅读说明：本技术 一种快速检测细菌耐药性的方法 (Method for rapidly detecting drug resistance of bacteria ) 是由 罗艳君 衣晓飞 彭迪 于 2019-10-31 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种快速检测细菌耐药性的方法,设置不同浓度的抗生素实验组及阳性对照组与阴性对照组,不同浓度的抗生素实验组是指将不同浓度的抗生素添加到培养基中,且后续会添加重水的实验组,阳性对照组是指培养基中加入抗生素浓度为0,并且后续添加重水的实验组,阴性对照组是指培养基中加入抗生素浓度为0,且后续不添加重水的实验组,孵育后离心清洗,对样品进行拉曼检测,根据得到的拉曼图谱分别计算C-D/(C-D+C-H),将不同浓度的抗生素实验组相对于对照组C-D/(C-D+C-H)比值下降的转折点作为抗生素对该菌的最低抑菌浓度,将最低抑菌浓度与CLSI药敏试验标准中给出的折点比较,判断细菌敏感、中介或耐药。本发明引入折点比较,更准确给出细菌对抗生素的敏感性。(The invention relates to a method for rapidly detecting bacterial drug resistance, which comprises the steps of setting antibiotic experimental groups with different concentrations, a positive control group and a negative control group, wherein the antibiotic experimental groups with different concentrations are experimental groups which are added into a culture medium and are added with heavy water subsequently, the positive control group is an experimental group which is added into the culture medium and is added with the antibiotic concentration of 0 and is added with the heavy water subsequently, the negative control group is an experimental group which is added into the culture medium and is added with the antibiotic concentration of 0 and is not added with the heavy water subsequently, carrying out centrifugal cleaning after incubation, carrying out Raman detection on samples, respectively calculating C-D/(C-D + C-H) according to the obtained Raman spectra, taking the turning point of the ratio reduction of the antibiotic experimental groups with different concentrations relative to the control group C-D/(C-D + C-H) as the minimum concentration of the antibiotic to the bacteria, and comparing the minimum inhibitory concentration with a break point given in a CLSI drug sensitivity test standard to judge the sensitivity, mediation or drug resistance of bacteria. The invention introduces breakpoint comparison, and more accurately gives the sensitivity of bacteria to antibiotics.)

一种快速检测细菌耐药性的方法

技术领域

本发明涉及细菌检测方法，尤其是涉及一种快速检测细菌耐药性的方法。

背景技术

细菌耐药性检测的传统方法主要有纸片扩散法、肉汤稀释法和琼脂稀释法(Melvin P,Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing.CLSIM100.28,30(2018))，在利用这些方法进行药敏实验之前都需要经过细菌的培养纯化步骤，培养耗时24～48h，之后的药敏实验同样也是通过观察细菌是否生长增殖如细菌浊度或抑菌斑大小来判断细菌对药物的敏感性，耗时16～20h。临床通过传统药敏检测方法获得一份药敏报告需要经过3～5天，无法满足急性感染科医生和病人对于快速诊断的需求。

近两年，有研究者提出利用单细胞拉曼技术结合重水标记对细菌进行快速药敏检测(Tao,Y.,et al,Metabolic-Activity-Based Assessment of Antimicrobial Effectsby D2O-Labeled Single-Cell Raman Microspectroscopy.Anal.Chem.89,4108-4115(2017)；Song,Y.,et al,Raman-Deuterium Isotope Probing for in-situidentification of antimicrobial resistant bacteria in Thames River.ScientificReports 7(1):16648(2017))。

在现有的拉曼结合重水标记对细菌进行药敏检测的方法中，一般将重水和抗生素同时添加到培养基中，然后对细菌进行孵育，一段时间后通过拉曼光谱仪检测单细胞的C-D强度。认为耐药细菌的C-D强度不受抗生素影响，而敏感菌的C-D强度受抗生素的抑制而降低。

但这种方法存在缺点：抗生素添加到细胞培养液后，对细菌的抑菌或杀菌作用需要一定的时间生效。在抗生素生效之前，细菌在培养基中仍有较强的代谢活性，并在代谢过程中结合重水。因此，即使细菌对所施加的药物敏感，拉曼检测时也会被检测到C-D峰存在，导致药敏结果判断不准确。

在判读结果时，目前已公开的方法通常以处理组和对照组的C-D/(C-D+C-H)比值小于或等于0.75判断为敏感，大于0.75判断为耐药。

单纯以某一抗生素浓度的处理组和对照组的C-D/(C-D+C-H)比值来判断敏感或耐药，不符合临床判断标准即通过所检测药物对细菌的MIC与折点比较得出细菌敏感、耐药或中介。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种快速检测细菌耐药性的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种快速检测细菌耐药性的方法，包括以下步骤：

设置不同浓度的抗生素实验组及阳性对照组与阴性对照组，其中，不同浓度的抗生素实验组是指将不同浓度的抗生素添加到培养基中，阳性对照组培养基中加入抗生素浓度为0，阴性对照组培养基中加入抗生素浓度为0，

对实验组、阳性对照组、阴性对照组中的细菌进行孵育，然后分别向实验组、阳性对照组菌液中加入重水，而阴性对照组菌液中不加入重水，即不同浓度的抗生素实验组是指将不同浓度的抗生素添加到培养基中，且后续会添加重水的实验组，阳性对照组是指培养基中加入抗生素浓度为0，并且后续添加重水的实验组，阴性对照组是指培养基中加入抗生素浓度为0，且后续不添加重水的实验组，继续孵育后离心清洗，对实验组、阳性对照组、阴性对照组的样品进行拉曼检测，根据得到的拉曼图谱分别计算实验组、阳性对照组、阴性对照组的C-D/(C-D+C-H)，将不同浓度的抗生素实验组相对于对照组C-D/(C-D+C-H)比值下降的转折点作为抗生素对该菌的最低抑菌浓度(MIC)，将最低抑菌浓度与CLSI药敏试验标准(2019)中给出的折点比较，在3～5小时内快速判断细菌敏感、中介或耐药。

进一步地，进行不同浓度的抗生素实验组设置时，抗生素的浓度设置应跨越该类菌CLSI规定的3个折点，即敏感(S)、中介(I)、耐药(R)浓度。

进一步地，当最低抑菌浓度(MIC)<CLSI规定的敏感值(S)，判读为敏感，当CLSI规定的敏感值(S)<最低抑菌浓度(MIC)<CLSI规定的耐药(R)，判读为中介，当最低抑菌浓度(MIC)>CLSI规定的耐药(R)，判读为耐药。

在本发明的一个实施方式中，培养基使用MH培养基。

在本发明的一个实施方式中，重水添加量占培养基总体积的40％～60％。

在本发明的一个实施方式中，第一次孵育的时间为0.5-3h，孵育温度为37℃，第二次孵育的时间为0.5-3h，孵育温度为37℃。

在本发明的一个实施方式中，离心清洗的条件为：设置离心机转速3000rpm-6000rpm(优选5000rpm)，时间1-3min(优选2min)，每次加入无菌水后用枪头吹打5～6次混匀，所述无菌水为灭菌去离子水。

在本发明的一个实施方式中，对实验组、阳性对照组、阴性对照组的样品进行拉曼检测时，将实验组、阳性对照组、阴性对照组的样品滴加在低拉曼背景芯片上进行拉曼检测，低背景拉曼芯片采用含有金属镀层的玻璃载玻片；低拉曼背景芯片购于上海氘峰医疗器械有限公司，Cat No 1001。

在本发明的一个实施方式中，采集拉曼光谱时使用532nm激光，光栅600g/mm，光谱中心设置为2300，光谱范围188～3950cm^-1；C-D峰和C-H峰分别位于2000-2300cm^-1和2800-3100cm^-1。

在本发明的一个实施方式中，C-D/(C-D+C-H)是指C-D峰面积/(C-D峰面积+C-H峰面积)，

C-D峰面积计算方式为：以C-D峰最大值处的波长X_d为中心，设定范围A_d，范围A_d的边界处的波长为X₁和X₂，其中X₁<X_d<X₂，且X₂-X₁>7nm，设定范围B_d，范围B_d的边界处的波长为X₀和X₁，其中X₁-X₀＝X₂-X₁，设定范围C_d，范围C_d的边界波长为X₂和X₃，其中X₃-X₂＝X₂-X₁，计算C-D峰面积：S_d＝S_ad-(S_bd+S_cd)/2，其中S_ad，S_bd和S_cd分别为范围A_d，B_d和C_d内拉曼光谱下的面积；

C-H峰面积计算方式为：以C-H峰最大值处的波长Y_h为中心，设定范围A_h，范围A_h的边界为波长Y₁和Y₂，其中Y₁<Y_h<Y₂，且Y₂-Y₁>9nm，设定范围B_h，范围B_h的边界为波长Y₀和Y₁，其中Y₁-Y₀＝Y₂-Y₁，设定范围C_h，范围C_h的边界波长为Y₂和Y₃，其中Y₃-Y₂＝Y₂-Y₁，计算C-H峰面积：S_h＝S_ah-(S_bh+S_ch)/2，其中S_ah，S_bh和S_ch分别为范围A_h，B_h和C_h内拉曼光谱下的面积。

在本发明的一个实施方式中，数据处理时截取1770～2400cm^-1图谱，然后对数据进行去背景(线性)和归一化(/面积)处理。

本发明利用细菌在不同抗生素作用下代谢活性不同，来实现细菌对抗生素敏感性检测及指导合理用药。本发明的工作原理具体是：细菌在NAD/NADP的还原过程中，将水中的氢转化为生物质，尤其是脂质和蛋白等生物大分子。这些大分子中的C-H键在拉曼光谱中具有特征峰(2800-3100cm^-1之间)。当重水存在时，重水中的氘(D)随着细菌代谢被用于合成重要的生物大分子，从而使拉曼图谱中的C-H峰(2800-3000cm^-1)发生偏移，出现C-D峰(2000-2300cm^-1)，C-D峰强度反映了细菌的代谢活性。在不同浓度的抗生素作用一段时间后，细菌被杀死或抑制，然后加入重水，根据C-D峰有无及强弱差异很容易可以得到该抗生素对细菌的最低抑制浓度MIC，将MIC与该菌所属的菌属的折点比较，可判断细菌敏感或耐药，进而快速筛选出有效抗生素。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

1、调整重水加入时间，在抗生素作用一段时间后加入重水，可避免抗生素作用前期细菌仍有较强代谢活性而出现较强氘峰。

2、在利用拉曼结合重水检测细菌MIC的同时引入折点比较，通过拉曼测到的MIC与临床使用的CLSI中规定的折点比较，更准确给出细菌对抗生素的敏感性。

附图说明

图1为不同浓度的环丙沙星(Ciprofloxacin)作用下单细胞拉曼图谱均值，左侧为未改进前方法(重水和抗生素同时添加)，右侧为改进后方法(抗生素作用2h后再添加重水)。

图1中，cip0.25、cip0.12、cip0.06、cip0.03、cip0.015、cip0.008、cip0.004、cip0.002均表示环丙沙星(Ciprofloxacin)不同浓度(单位是ug/mL)下的实验组，pos表示阳性对照组，neg表示阴性对照组。

图2为不同浓度的环丙沙星(Ciprofloxacin)作用下单细胞拉曼图谱C-D峰面积与C-H和C-D面积之和的比值，左侧为未改进前方法(重水和抗生素同时添加)，右侧为改进后方法(抗生素作用2h后再添加重水)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例

本实施例选用大肠埃希氏菌ATCC25922，由于其MIC质控范围远小于敏感折点，浓度设置仅跨越其MIC质控范围。

快速检测大肠埃希氏菌ATCC25922对环丙沙星(Ciprofloxacin)耐药性的方法，包括以下步骤：

设置不同浓度的抗生素实验组及阳性对照组与阴性对照组，其中，不同浓度的抗生素实验组是指将不同浓度的抗生素添加到培养基中，阳性对照组是指培养基中加入抗生素浓度为0，阴性对照组是指培养基中加入抗生素浓度为0，

对实验组、阳性对照组、阴性对照组中的细菌进行孵育，37℃孵育2h后，然后分别向实验组、阳性对照组菌液中加入重水，而阴性对照组菌液中不加入重水，即不同浓度的抗生素实验组是指将不同浓度的抗生素添加到培养基中，且后续会添加重水的实验组，阳性对照组是指培养基中加入抗生素浓度为0，并且后续添加重水的实验组，阴性对照组是指培养基中加入抗生素浓度为0，且后续不添加重水的实验组，继续孵育2h后离心清洗，对实验组、阳性对照组、阴性对照组的样品进行拉曼检测，根据得到的拉曼图谱分别计算实验组、阳性对照组、阴性对照组的C-D/(C-D+C-H)，将不同浓度的抗生素实验组相对于对照组C-D/(C-D+C-H)比值下降的转折点作为抗生素对该菌的最低抑菌浓度(MIC)，将最低抑菌浓度与CLSI药敏试验标准(2019)中给出的折点比较，当最低抑菌浓度(MIC)<CLSI规定的敏感值(S)，判读为敏感，当CLSI规定的敏感值(S)<最低抑菌浓度(MIC)<CLSI规定的耐药(R)，判读为中介，当最低抑菌浓度(MIC)>CLSI规定的耐药(R)，判读为耐药。在3～5小时内快速判断细菌敏感、中介或耐药。

本实施例中，培养液使用MH培养基；重水添加量占总体积的40％～60％；离心洗涤步骤设置离心机转速5000rpm，时间2min，每次加入无菌水后用枪头吹打5～6次混匀；无菌水为灭菌去离子水；低背景拉曼芯片采用含有金属镀层的玻璃载玻片；采集拉曼光谱时使用532nm激光，光栅600g/mm，光谱中心设置为2300，光谱范围188～3950cm^-1；C-D峰和C-H峰分别位于2000-2300cm^-1和2800-3100cm^-1。数据处理时截取1770～2400cm^-1图谱，然后对数据进行去背景(线性)和归一化(/面积)处理。

C-D/(C-D+C-H)是指C-D峰面积/(C-D峰面积+C-H峰面积)，

C-D峰面积计算方式为：以C-D峰最大值处的波长X_d为中心，设定范围A_d，范围A_d的边界处的波长为X₁和X₂，其中X₁<X_d<X₂，且X₂-X₁>7nm，设定范围B_d，范围B_d的边界处的波长为X₀和X₁，其中X₁-X₀＝X₂-X₁，设定范围C_d，范围C_d的边界波长为X₂和X₃，其中X₃-X₂＝X₂-X₁，计算C-D峰面积：S_d＝S_ad-(S_bd+S_cd)/2，其中S_ad，S_bd和S_cd分别为范围A_d，B_d和C_d内拉曼光谱下的面积；

C-H峰面积计算方式为：以C-H峰最大值处的波长Y_h为中心，设定范围A_h，范围A_h的边界为波长Y₁和Y₂，其中Y₁<Y_h<Y₂，且Y₂-Y₁>9nm，设定范围B_h，范围B_h的边界为波长Y₀和Y₁，其中Y₁-Y₀＝Y₂-Y₁，设定范围C_h，范围C_h的边界波长为Y₂和Y₃，其中Y₃-Y₂＝Y₂-Y₁，计算C-H峰面积：S_h＝S_ah-(S_bh+S_ch)/2，其中S_ah，S_bh和S_ch分别为范围A_h，B_h和C_h内拉曼光谱下的面积。

图1为不同浓度的环丙沙星(Ciprofloxacin)作用下单细胞拉曼图谱均值，左侧为未改进前方法(重水和抗生素同时添加)，右侧为改进后方法(抗生素作用2h后再添加重水)。图2为不同浓度的环丙沙星(Ciprofloxacin)作用下单细胞拉曼图谱C-D峰面积与C-H和C-D面积之和的比值，左侧为未改进前方法(重水和抗生素同时添加)，右侧为改进后方法(抗生素作用2h后再添加重水)。

从图1、图2可以看出，大肠埃希氏菌ATCC25922在环丙沙星作用下的MIC质控范围为0.004～0.015μg/ml。左侧未改进方法得到的MIC为0.25(与neg无显著性差异，p>0.05)，超出质控范围，右侧改进后方法得到的MIC为0.015(与neg无显著性差异，p>0.05)，在质控范围内，此MIC值与CIP对肠杆菌科细菌的折点(S＝1、I＝2、R＝4)比较，MIC<S，判定ATCC25922对环丙沙星敏感。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。