阅读说明：本技术 一种中药单体药敏检测方法 (Method for detecting drug sensitivity of traditional Chinese medicine monomer ) 是由 邢海洋 瞿玲娜 于 2019-08-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种中药单体药敏检测方法,采用微量肉汤二倍稀释法测定中药单体作用于细菌(包含多重耐药菌)的最低抑菌浓度,包括以下步骤：(1)将中药单体溶解于二甲基亚砜,配置成浓度为10N mg/ml的中药单体溶液；(2)取96孔板,从第二列起每孔加入二甲基亚砜10μl,第一列加入中药单体溶液20μl；(3)依次进行倍比稀释；(4)保存于温箱至二甲基亚砜全部挥发,得不同剂量梯度的中药单体；(5)将浊度为0.5的菌悬液加入96孔板,每孔100μl；37℃培养18h后观察结果；(6)结果判定：药物组出现无浑浊的最小浓度为中药单体的最低抑菌浓度(MIC)。本发明检测过程简单能够简便有效测试中药单体的药敏性,可用来指导临床中药治疗细菌感染性疾病。(The invention discloses a method for detecting drug sensitivity of a traditional Chinese medicine monomer, which adopts a trace broth two-fold dilution method to determine the minimum inhibitory concentration of the traditional Chinese medicine monomer acting on bacteria (including multiple drug-resistant bacteria), and comprises the following steps: (1) dissolving the traditional Chinese medicine monomer in dimethyl sulfoxide to prepare a traditional Chinese medicine monomer solution with the concentration of 10N mg/ml; (2) taking a 96-well plate, adding 10 mu l of dimethyl sulfoxide into each hole from the second row, and adding 20 mu l of traditional Chinese medicine monomer solution into the first row; (3) sequentially carrying out multiple dilution; (4) storing in a warm box until the dimethyl sulfoxide is completely volatilized to obtain the Chinese medicinal monomers with different dose gradients; (5) adding bacterial suspension with turbidity of 0.5 into a 96-well plate, wherein each well is 100 mu l; observing the result after culturing at 37 ℃ for 18 h; (6) and (4) judging a result: the minimum concentration of the drug group without turbidity is the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of the traditional Chinese medicine monomer. The invention has simple detection process, can simply, conveniently and effectively test the drug sensitivity of the traditional Chinese medicine monomer, and can be used for guiding the clinical traditional Chinese medicine to treat bacterial infectious diseases.)

一种中药单体药敏检测方法

技术领域

本发明涉及药敏测试技术领域，具体为一种中药单体药敏检测方法。

背景技术

目前临床上对抗生素滥用的现象，对多重耐药菌的流行起到了一定的扩散作用。日益突出的多重耐药菌问题给临床上抗感染治疗带来了严峻的挑战。

药敏实验为细菌感染性疾病的治疗，尤其是多重耐药菌感染的治疗提供了重要的参考价值。但是现今药敏实验全是西药抗菌药物的体外抑菌实验。

近些年的研究报道发现有的中药成分对多种细菌，尤其是多重耐药菌具有抑制作用。但是临床仍缺乏商品化的临床简便可行而成本低廉的中药药敏实验器材。

现中医治疗细菌感染性疾病仍是以传统辨证论治为主，缺乏精准治疗手段，临床疗效欠佳。本发明申请人在2019年温岭市科协“金桥工程”课题《黄芩苷对多重耐药菌的体外抑菌实验研究》的研究中，发现一种临床可行而成本低廉的中药单体抑菌实验方案，可为指导临床中药抗菌，尤其是对多重耐药菌的治疗提供重要的参考价值。

发明内容

为解决现有问题，本发明提供一种中药单体药敏检测方法。本发明通过以下技术方案实现。

一种中药单体药敏检测方法，采用微量肉汤二倍稀释法测定中药单体作用于细菌(包含多重耐药菌)的最低抑菌浓度，包括以下步骤：

(1)先将中药单体溶解于二甲基亚砜，配置成浓度为10N mg/ml的中药单体溶液；

(2)取96孔板，从第二列起每孔加入二甲基亚砜10μl，第一列加入步骤(1)配置的中药单体溶液20μl；

(3)取在第一列细胞培养孔中取10μl加入到第二列细胞培养孔中，依次进行倍比稀释；

(4)倍比稀释后保存于温箱，直至二甲基亚砜全部挥发，细胞培养孔中剩余不同剂量梯度的中药单体；

(5)将浊度为0.5的菌悬液加入96孔板，每孔100μl；最终中药单体浓度为N、N/2、N/4、N/8、N/16、N/32、N/64、N/128、N/256mg/mL；37℃培养18h后观察结果；

(6)结果判定：药物组出现无浑浊的最小浓度为中药单体的最低抑菌浓度(MIC)。

优选的，所述中药单体为黄芩苷。

优选的，所述步骤1-6操作为无菌条件下进行。

优选的，所述测试步骤在生物安全柜中进行。

优选的，所述96孔细胞培养板可一次对多种中药单体同时进行药敏检测。

本发明的有益效果：

本发明一种中药单体药敏检测方法检测过程简单，实用工具为常见的96孔板，能够简便有效测试中药单体的药敏性，可用来指导临床中药治疗细菌感染性疾病，尤其是多重耐药菌感染性疾病，达到中医精准治疗的目的。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作更为详细、完整的说明。

具体实施例1，黄芩苷单体的药敏测试方法，采用采用微量肉汤二倍稀释法测定中药单体作用于细菌(包含多重耐药菌)的最低抑菌浓度，包括以下步骤：

(1)先将黄芩苷单体溶解于二甲基亚砜，配置成160mg/ml的浓度；

(2)取96孔板，从第二列起每孔加入二甲基亚砜10μl，第一列加入浓度为160mg/ml的黄芩苷单体溶液20μl；

(3)取在第一列细胞培养孔中取10μl加入到第二列细胞培养孔中，依次进行倍比稀释；

(4)倍比稀释后保存于温箱，直至二甲基亚砜全部挥发，细胞培养孔中剩余不同剂量梯度的黄芩苷单体；

(5)将浊度为0.5的菌悬液加入96孔板，每孔100μl；最终黄芩苷单体浓度为16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625mg/mL；37℃培养18h后观察结果；

(6)结果判定：药物组出现无浑浊的最小浓度为中药单体的最低抑菌浓度(MIC)。

采用此检测方法进行黄芩苷单体对不同细菌的药敏性进行检测，检测结果见下表(表1)。

表1.黄芩苷单体对不同细菌的药敏性检测结果

序号	菌种	耐药类型	MIC(mg/ml)
				1	鲍氏不动杆菌	耐碳青霉烯类	1
2	肺炎克雷伯杆菌	耐碳青霉烯类	1
				3	鲍氏不动杆菌	耐碳青霉烯类	0.5
4	肺炎克雷伯杆菌	耐碳青霉烯类	0.0625
				5	粘质沙雷菌	耐碳青霉烯类	0.0625
6	肺炎克雷伯杆菌	耐碳青霉烯类	＞8
				7	大肠埃希菌	ESBL	＞8
8	金黄色葡萄球菌	MRSA	0.25
				9	大肠埃希菌	ESBL	＞8
10	金黄色葡萄球菌	MRSA	1
				11	鲍氏不动杆菌	耐碳青霉烯类	＞8

由上可以看出同一种菌不同批次测试结果不完全一样，最低抑菌浓度越低说明黄芩苷的抑菌效果越好。最好患者治疗前都做下药敏检测，黄芩苷对这些耐药菌敏感，可以用于指导这些菌引起疾病。

显然，所描述的实施例仅是本发明的个别实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施，都属于本发明的保护范围。